高通量体外过敏原筛查方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高通量体外过敏原筛查方法。
【背景技术】
[0002]过敏性疾病又称变态反应性疾病，是指机体受到抗原性物质(也称变应原或过敏原)，如花粉、粉尘、食物、药物、寄生虫等刺激后，引起的组织损伤或生理功能紊乱，属于异常的或病理性的免疫反应。其根本要解决的问题是首先要确定过敏原到底是什么？只有准确地确定使患者过敏的确切过敏原才可以做到有效的预防和治疗。目前主要的过敏原筛查方法有体内检测和体外检测两种。其中体内检测法有皮试法和斑点法两种，缺点是身体痛苦较大。体外检测主要是体外免疫检测法。体外免疫检测的方法主要有瑞典法玛西亚公司的UniCAP系统和德国的Fooke系统，分别采取的是荧光免疫学方法与酶联免疫方法。目前中国国内的公司还没有开发出产品化的体外检测系统。
[0003]瑞典法玛西亚公司的UniCAP系统使用的方法是荧光免疫学检测,但由于UniCAP系统是采用病人血清与预先包被固定的过敏原进行反应，因此.血清中的特异性IgE抗体与过敏原结合过程中会受到血清中的特意性IgG抗体的竞争，因此对检测结果产生偏差，影响特异性和准确性。
[0004]德国的Fooke公司的产品虽然可以排除特异性IgG抗体对特异性IgE抗体的竞争性干扰，提高了特异性，但Fooke公司采用的是酶联免疫的方法ELISA，检测灵敏度比荧光素检测低很多，因此很容易产生假阴性结果，导致漏检。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是要提供一种检测过敏原准确性更高的高通量体外过敏原筛查方法。
[0006]为了解决以上的技术问题，本发明提供了一种高通量体外过敏原筛查方法，包括以下的步骤:
[0007]⑴抽取外周血，分离血清，加到事先预包被好小鼠或兔抗人IgE抗体和采用I %浓度的牛血清白蛋白BSA封闭液封闭的至少两个96孔板中，孵育反应0.75?I小时，温度37 0C ；
[0008]⑵血清中的过敏原特异的IgE抗体和非特异性的IgE抗体被预包被的抗IgE抗体捕获，产生特异性的抗原抗体反应；
[0009]⑶孵育反应结束后，采用PBS缓冲液洗涤，去除非特异性结合的成分；
[0010]⑷向其中的一个96孔板中分别加96种生物素标记的特异性过敏原，特定的过敏原与对应的抗体相结合；向另一个96孔板中加生物素标记的抗IgE的抗体，生物素标记的抗IgE抗体与96孔板中的所有IgE结合，温度37°C，孵育反应0.75?I小时后，采用PBS缓冲液洗涤，去除非特异性结合的成分；
[0011](5)在上述两个96孔板上都加样荧光素标记的链亲和素，链亲和素和生物素特异性结合，温度37°C，孵育反应0.5?0.75分钟后，同样使用PBS缓冲液洗涤；
[0012](6)最后把上述两块96孔板分别拿到高通量荧光信号检测系统上定量检测荧光强度，其中第一个96孔板检测出总的IgE，判断出是否过敏，过敏程度的高低；另一个96孔板根据不同孔的荧光强度，诊断出病人是对什么过敏原过敏。
[0013]本发明的优越功效在于:
[0014]I)本发明属于体外检测技术，采用特异性的抗原抗体反应的原理，通过高灵敏度的发光底物标记，检测标记物的发光程度来准确定量特异性的过敏原，可有效检测过敏原的准确性达到95%，甚至更高的水平；
[0015]2)本发明具有高通量的特性，可一次性检测90种以上过敏原；
[0016]3)与UNICAP系统相比，提高了特异性与准确性；
[0017]4)与Fooke公司的产品相比，不会导致假阴性的漏检。
【具体实施方式】
[0018]以下对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
[0019]本发明提供了一种高通量体外过敏原筛查方法，包括以下的步骤:
[0020]⑴抽取外周血，分离血清，加到事先预包被好小鼠或兔抗人IgE抗体和采用I %浓度的BSA封闭液(牛血清白蛋白封闭液)封闭的96孔板中，37°C孵育反应I个小时。
[0021 ] ⑵血清中的过敏原特异的IgE抗体和非特异性的IgE抗体被预包被的抗IgE抗体捕获，产生特异性的抗原抗体反应；
[0022]⑶孵育结束后，采用PBS缓冲液洗涤，去除非特异性结合的成分；
[0023]⑷向其中的一个96孔板中分别加96种生物素标记的特异性过敏原，特定的过敏原与对应的抗体相结合；向另一个96孔板中加生物素标记的抗IgE的抗体，生物素标记的抗IgE抗体与96孔板中的所有IgE结合，37°C孵育反应I个小时后，采用PBS缓冲液洗涤，去除非特异性结合的成分；
[0024](5)在上述两个96孔板上都加样荧光素标记的链亲和素，链亲和素和生物素特异性结合，37°C孵育反应30分钟后，同样使用PBS缓冲液洗涤；
[0025](6)最后把上述两块96孔板分别拿到高通量荧光信号检测系统上定量检测荧光强度，其中第一个96孔板检测出总的IgE，判断出是否过敏，过敏程度高低；另一个96孔板根据不同孔的荧光强度，诊断出病人是对什么过敏原过敏。
[0026]以上所述仅为本发明的优先实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围内之内。
【主权项】
1.一种高通量体外过敏原筛查方法，其特征在于:包括以下的步骤: ⑴抽取外周血，分离血清，加到事先预包被好小鼠或兔抗人IgE抗体和采用1%浓度的牛血清白蛋白BSA封闭液封闭的至少两个96孔板中，孵育反应0.75?I小时，温度37°C ；⑵血清中的过敏原特异的IgE抗体和非特异性的IgE抗体被预包被的抗IgE抗体捕获，产生特异性的抗原抗体反应； ⑶孵育反应结束后，采用PBS缓冲液洗涤，去除非特异性结合的成分； ⑷向其中的一个96孔板中分别加96种生物素标记的特异性过敏原，特定的过敏原与对应的抗体相结合；向另一个96孔板中加生物素标记的抗IgE的抗体，生物素标记的抗IgE抗体与96孔板中的所有IgE结合，温度37 °C，孵育反应0.75?I小时后，采用PBS缓冲液洗涤，去除非特异性结合的成分； (5)在上述两个96孔板上都加样荧光素标记的链亲和素，链亲和素和生物素特异性结合，温度37°C，孵育反应0.5?0.75分钟后，同样使用PBS缓冲液洗涤； (6)最后把上述两块96孔板分别拿到高通量荧光信号检测系统上定量检测荧光强度，其中第一个96孔板检测出总的IgE，判断出是否过敏，过敏程度的高低；另一个96孔板根据不同孔的荧光强度，诊断出病人是对什么过敏原过敏。
【专利摘要】本发明公开一种高通量体外过敏原筛查方法，包括：抽取外周血，分离血清，加到事先预包被好小鼠或兔抗人IgE抗体和BSA液封闭的96孔板中孵育；产生特异性的抗原抗体反应；孵育后，洗涤去除非特异性结合的成分；向其中一个96孔板中分别加96种生物素标记的特异性过敏原；向另一个96孔板中加生物素标记的抗IgE的抗体，孵育后，洗涤去除非特异性结合的成分；在96孔板上加样荧光素标记的链亲和素，孵育后洗涤；96孔板分别拿到高通量荧光信号检测系统上定量检测荧光强度，第一个96孔板检测出总的IgE用于判断过敏；另一个96孔板诊断过敏原。本发明的优点是有效检测过敏原的准确性达到95％，可一次性检测90种以上过敏原。
【IPC分类】G01N33/564
【公开号】CN105510578
【申请号】CN201410497884
【发明人】路建伟, 敖星星
【申请人】苏州爱乐桢医疗器械有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2014年9月25日