荧光纳米探针及其制备方法和用于食品中多种危害因子同步检测的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及食品检测领域，特别是一种荧光纳米探针，该荧光纳米探针的制备方法，以及用于食品中多种危害因子同步检测的方法。
【背景技术】
[0002]食品中危害因子检测一直是食品安全领域中的重要课题，但目前能够灵敏、稳定可靠、快速简便、低成本地监控乳品中常见的危害因子的方法，实现对乳品中高频危害因子实现一步“全检测”的技术仍然缺乏。
[0003]如乳品中常见的“高频危害因子”如三聚氰胺，黄曲霉毒素Ml，Beta_内酰胺类抗生素等的检测技术主要有基于色谱-质谱等理化检测、基于抗原抗体反应原理的免疫分析检测和基于微生物相关技术原理的检测。对乳品中抗生素的检测最初发展起来的是基于抗生素与微生物间相互作用而建立的微生物生长抑制法、微生物受体法和酶促比色法。乳品中理化检测方法是利用抗生素分子中的基团具有的特殊反应或性质来测定其含量，如高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法、联用技术等等，能进行定性、定量和药物鉴定，敏感性较高，但色谱法分析过程繁琐复杂，样品前处理步骤较为复杂，工作量大，仪器昂贵，要求有熟练地技术人员及较长的分析周期，这也一定程度上限制了色谱法的应用。目前，用于检测抗生素残留的免疫分析方法主要有两类:一类是以抗原抗体识别为核心反应，代表方法是酶联免疫吸附法(ELISA)，另一类是以受体配体识别为核心反应。但影响因素较多，易出现假阳性结果且灵敏度低。不管哪种方法，其检测对象都是一种(类)物质，要实现一次性对高频危害因子实现同步高通量的测定，目前的检测方法还不能实现。
[0004]以稀土荧光化合物作为荧光标记物的时间分辨荧光生化分析技术已经取得了显著的进步，在医学临床诊断、食品安全领域以及生命科学等领域发挥着越来越重要的作用。现有技术中，基于稀土荧光生物标记物超长荧光寿命的时间分辨荧光生化分析技术可有效消除各种各样来自于样品及仪器的背景信号对荧光测定的干扰，使得测定灵敏度显著增加。
[0005]但是现有的稀土荧光探针具有光信号较弱、检测集成度低的问题，并且现有的稀土荧光探针及其配套的检测装置和平台无法实现多种危害因子同步检测的目的。
【发明内容】
[0006]本发明的主要目的是提供一种光信号强、有助于高通量检测食品中危险因子的荧光纳米探针，同时，本发明还提供了该荧光纳米探针的制备方法，以及采用该荧光纳米探针来实现食品中多种危害因子同步检测的方法，该方法能够实现多种危害因子同步检测的目的。
[0007]在阐述本发明的具体方案之前，对本发明中的各化合物简称予以说明:
[0008]TEOS (正硅酸乙酯)、BHHCT (三联苯衍生物螯合物)、BPTA(四氮-[2，6_双(3 ’ -氨基甲基-Γ-吡啶)-4-苯基吡啶])、APTMS(3-氨丙基三甲氧基硅烷)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、BBCAP(2，9-双[N，N-双(羧甲基)氨甲基]-1，10-(菲咯啉))、PTTA(联三吡啶多羧酸衍生物)、BCPDA(4，7-双氯磺酰基苯基-1，10-菲啰啉-2，9-二羧酸迮00(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、Tris(三羟甲基氨基甲烷)、BSA(牛血清白蛋白)、PDMS(聚一■甲基娃氧烧)。
[0009]本发明提供的技术方案为:一种荧光纳米探针，包括内部载有Eu3+和/或Tb3+的稀土螯合物的TEOS纳米内核，所述的TEOS纳米内核表面修饰有多层表面键合有Eu3IPz^Tb3+稀土螯合物的TEOS壳层。
[0010]优选地，荧光纳米探针的最外层还设有一层TEOS壳层，该TEOS壳层表面并不键合有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物，其主要用于键合抗体或者抗原模拟物。
[0011]在上述的荧光纳米探针中，所述的TEOS纳米内核的表面也键合有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物。
[0012]需要说明的是:在本方案中，“和/或”所指代的意思为可以选择之一或两种均可选择。比如，Eu3+和/或Tb3+的稀土螯合物是指该稀土螯合物中所螯合的稀土离子可以为Eu3+也可以为Tb3+，也可以为两者的混合物。
[0013]在本方案中，若选择螯合有Eu3+和Tb3+的离子时，其配比是根据实际需要来进行选择的，螯合物中所键合的Eu3+和Tb3+的摩尔比例可以为0:5、1:4、2:3、1:1、3:2、4:1、5:0。
[0014I Tb纳米、Eu纳米还是混合包裹的Eu/Tb纳米都具有一致的激发和发射光谱。调整Eu与Tb 二者浓度的混合比例能够制备多色荧光纳米，其所制备出的多色荧光纳米探针的激发波长是保持一致的，如图5中A、B所示，BBCAP-Eu，BBCAP-Tb的激发波长为280nm。随着掺入Tb与Eu摩尔比例的不同，形成的多色荧光纳米探针在峰型上展示了一些变化，如图5中C所示。但这种混合包裹的焚光纳米探针，随着在外层的“layer-by-layer”(一层又一层)包裹，其特征光谱峰也没有发生变化，这对于后续的标记实验是重要的，这样可以保证不同类型的荧光纳米探针混合进行多种危害因子的同步检测，并有望实现可视化检测。
[0015]在上述的荧光纳米探针中，所述的稀土螯合物所用的螯合剂为BBCAP或BHHCT或PTTA0
[0016]在上述的荧光纳米探针中，所述的表面键合有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS壳层为3_5层。
[0017]本发明还提供上述的荧光纳米探针的制备方法，具体来说，包括以下步骤:
[0018]步骤1:在反相微乳液中合成内部载有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS纳米内核；
[0019]步骤2:在TEOS纳米内核的表面键合Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物；
[0020]步骤3:在键合有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS纳米内核表面修饰一层TEOS壳层；
[0021 ]步骤4:在步骤3得到的具有TEOS壳层的粒子表面键合Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物；
[0022]步骤5:重复步骤3和步骤4，2?4次；
[0023]步骤6:在步骤5得到的粒子表面修饰一层TEOS壳层。
[0024]在上述的荧光纳米探针的制备方法中，所述的步骤2具体为:将步骤I所得到的TEOS纳米内核置于无水乙醇中并加入APTMS反应，得到表面键合有氨基的TEOS纳米内核，并将其置于无水乙醇中；
[0025]然后加入螯合剂，使螯合剂和氨基反应，将反应产物经过Tris.HCl溶液处理后置于无水乙醇中；
[0026]最后加入EuCl3和/或TbCl3,反应一段时间后得到表面键合Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS纳米内核；
[0027]其中，TEOS纳米内核、APTMS、螯合剂、EuCl3和/或TbCl3的重量比为10?100:1?5:0.5?5:0.5 ?5ο
[0028]在上述的荧光纳米探针的制备方法中，所述的步骤2具体为:将步骤I所得到的TEOS纳米内核置于无水乙醇中并加入APTMS反应，得到表面键合有氨基的TEOS纳米内核，并将其置于无水乙醇中；
[0029]然后加入螯合剂，使螯合剂和氨基反应，将反应产物经过Tris.HCl溶液处理后置于无水乙醇中；
[0030]最后加入EuCl3和/或Tb Cl3，反应一段时间后得到表面键合Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS纳米内核；
[0031 ] 其中，TEOS纳米内核、APTMS、螯合剂、EuCl3和/或TbCl3的重量比为10?100:1?5:0.5?5:0.5 ?5ο
[0032]本发明还提供一种用于食品中多种危害因子同步检测的方法，具体来说，所述的方法通过具有多条检测通道的微流控芯片和多种如上述的荧光纳米探针实施;每一种危害因子均对应有相应的检测通道和相应的荧光纳米探针；
[0033]所述的方法具体为:将待检物溶液加入到多条检测通道后，用缓冲液冲洗后加入含多种荧光纳米探针的溶液，最后用缓冲液冲洗后检测检测通道内的荧光信号；
[0034]其中，对于采用夹心法检测的危害因子，该危害因子对应的检测通道内和用于检测该危害因子的荧光纳米探针的表面均固定有该危害因子的捕获抗体；
[0035]对于采用竞争法检测的危害因子，该危害因子对应的检测通道内固定有该危害因子的捕获抗体，且用于检测该危害因子的荧光纳米探针的表面偶联有该危害因子的模拟物。
[0036]另外，本发明还提供了另一种用于食品中多种危害因子同步检测的方法，所述的方法通过具有多条检测通道的微流控芯片和多种如上述的荧光纳米探针实施;每一种危害因子均对应有相应的检测通道和相应的荧光纳米探针；
[0037]所述的方法具体为:首先将含多种荧光纳米探针的溶液与待检物溶液混合后，将混合溶液加入到多条检测通道中，然后用缓冲液冲洗后检测检测通道内的荧光信号；
[0038]其中，对于采用夹心法检测的危害因子，该危害因子对应的检测通道内和用于检测该危害因子的荧光纳米探针的表面均固定有该危害因子的捕获抗体；
[0039]对于采用竞争法检测的危害因子，该危害因子对应的检测通道内固定有该危害因子的模拟物，且用于检测该危害因子的荧光纳米探针的表面固定有该危害因子的捕获抗体。
[0040]所述的模拟物为危害因子与BSA或卵清蛋白反应得到，如BSA-三聚氰胺、BSA-氯霉素等。
[0041]在此需要说明的是，采用夹心法进行测试的危害因子一般为大分子危害因子如细菌、病毒等微生物，该大分子危害因子具有多个结合位点，也称为完全抗原;对于采用竞争法进行测试的危害因子一般为小分子危害因子如三聚氰胺、抗生素、激素等，其仅具有一个结合位点，也称为半抗原。
[0042]在上述的用于食品中多种危害因子同步检测的方法中，所述的微流控芯片上还设有控制通道，所述的控制通道内未修饰任何生物分子。
[0043]在上述的用于食品中多种危害因子同步检测的方法中，所述的微流控芯片包括PDMS本体，所述的PDMS本体的中央设有进样口，所述的检测通道和控制通道分别与进样口相连，所述的进样通道的末端和控制通道的末端均设有出口，所述的进样通道和控制通道内均设有多个柱状的凸起;所述的微流控芯片设置在一可旋