释液，按1:100~1:500的体积比稀释CMV IgG高亲和力抗体(本实 施例选择1:200)，得到高亲和力质控品； 4、 制备低亲和力质控品 采用PH7.4的0.02M PBS缓冲液中加入5%BSA配制成稀释液； 然后用上述配制的稀释液，按1:550~1000的体积比稀释CMV IgG低亲和力抗体(本实施 例选择1:600)，得到低亲和力质控品； 5、 制备对照缓冲液 按下述组分配制对照缓冲液:PH7.4的Tris-Hcl缓冲液中加入20%牛血清，0.1%防腐剂 P-300，0· 1%表面活性剂Tween-20配制而成； 6、 制备解离缓冲液 采用尿素作为变性剂，在PBST缓冲液中加入8Mol/L尿素制备成解离缓冲液； 7、 制备样品稀释液 按下述组分配制样品稀释液:采用pH7.4的Tris-Hcl缓冲液，加入5%Casein(酪蛋白）， 〇· 1%防腐剂Ρ-300、0· 1%表面活性剂Tween-20配制而成。
[0020] 8、制备显色剂和底物液 显色剂是将0.03% TMB-HC1溶解在柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，PH3.0;底物液是将0.05% 过氧化氢尿素溶解在柠檬酸-乙酸盐缓冲液中，PH5.0;二者等体积混合使用。
[0021] 9、制备终止液 本发明所用终止液为〇. 4M的硫酸溶液。
[0022]二、使用本发明试剂盒检测巨细胞病毒IgG抗体亲和力的方法(本发明试剂盒针对 的标本为血清或血浆）： 米用二步法检测： 把样品在孔外用样品稀释液按1: looaoooul样品稀释液+i〇ui样品）的比例稀释样品， 缓慢混匀后，加入微孔板100U1/孔，每份样品加复孔，充分混匀，置于37°C恒温箱中30分钟 后，洗去其它没有结合的物质后，其中一孔加入离解缓冲液，另外一孔加对照缓冲液，置于 37°C恒温箱中10分钟后，充分洗涤，加入酶结合物工作液100ul/孔，置于37°C恒温箱中30分 钟后，充分洗涤，分别加入底物液和显色剂各50ul/孔，充分混匀后置于37°C恒温箱中10分 钟，加入终止液50ul/孔，在450/620nm波长下读数。
[0023] 检测结果解释： l.IgG抗体亲和力=解离缓冲液孔0D值/对照缓冲液孔0D值X 100%。
[0024] 2.若样本的对照缓冲液孔0D值2 0.15说明样本中含有IgG抗体，可进行亲和力计 算;若样本的对照缓冲液孔0D值<0.15,说明样本不含IgG抗体，或IgG抗体含量不足以被检 出，无需进行亲和力计算
[0025]三、本发明试剂盒性能指标 1、灵敏度 本试剂盒检测商品化血清转化盘RP-003(至感染后99天）、RP-019(至感染后68天）和 PTC-90U至感染后67天），IgG抗体检测均为低亲和力，与Abbott ATCHIT CMV IgG Avidity 的符合率为100%AP-019感染104天后本试剂盒检测为高亲和力，Abbott ATCHIT仍检测为 低亲和力。检测结果对比情况如下表1。
[0026]表1商品化血清转化盘检测结果
[0027] 2、特异性 检测744份CMV IgG阳性同时IgM阴性(既往感染)的样本，除去17份检测为灰区样本，19 份检测结果为低亲和力，特异性为97 · 4%(708/727)。
[0028] 3、分析特异性 单纯疱疹病毒IgG抗体、风疹病毒IgG抗体、弓形虫IgG抗体、EBV IgG抗体、VZV IgG抗 体、细小病毒B19 IgG抗体、流感病毒IgG抗体、抗核抗体、类风湿因子和系统性红斑狼疮患 者样本对CMV IgG抗体亲和力检测结果无显著影响。
[0029] 4、重复性 分析内变异系数(CV%)小于15%;分析间变异系数(CV%)不大于15%;批间变异系数(CV%) 不大于20%。
[0030] 5、干扰物质 20mg/dl胆红素、500mg/dl血红蛋白、3000mg/dl甘油三酯对检测结果无显著影响。
[0031] 6、抗凝剂影响 使用m)TA、枸椽酸钠或肝素钠的抗凝血浆对检测结果无显著影响。
[0032] 7、方法学对比 与商品化试剂盒对比检测1080份临床样本，高亲和力符合率为98.34%，低亲和力符合 率为98.17%，总体符合率为98.06%。
[0033]以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当 视为属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒，包括微孔板、酶结合物工作液、样品稀 释液、解离缓冲液、对照缓冲液、高亲和力质控品、低亲和力质控品；其特征在于:所述微孔 板上包被有巨细胞病毒抗原;所述酶结合物工作液中的抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗 人I gG抗体;所述解离缓冲液由PBST溶液中加入8Mo 1 /L尿素配制而成。2. 根据权利要求1所述的巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒，其特征在于:所述试 剂盒中还包括底物液、显色液和终止液。3. 根据权利要求1所述的巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒，其特征在于:所述微 孔板上包被的巨细胞病毒抗原为巨细胞基因重组抗原PP150和gp52按质量比1:1的比例用 pH9.6、0.05M的碳酸盐缓冲液稀释至0.1~0.4ug/人份后，达到最佳的包被效果，再包被到 空白微孔板上。4. 根据权利要求1所述的巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒，其特征在于:所述酶 结合物工作液中的抗体按体积比1:1000~10000的比例，用含牛血清、防腐剂P300和表面活 性剂Tween-20的pH7 · 4的Tris-Hcl缓冲液进行稀释。5. 根据权利要求1所述的巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒，其特征在于:所述高 亲和力质控品中CMV IgG高亲和力抗体按体积比1:100~500的比例，用ρΗ7·4 0.02M PBS并 含有BSA的缓冲液进行稀释。6. 根据权利要求1所述的巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒，其特征在于:所述低 亲和力质控品中CMV IgG高亲和力抗体按体积比1:550~1000的比例，用ρΗ7·4 0.02M PBS 并含有BSA的缓冲液进行稀释。7. 根据权利要求1所述的巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒，其特征在于:所述对 照缓冲液是含牛血清、防腐剂P300和表面活性剂Tween-20的pH7.4的Tris-Hcl缓冲液;所述 样品稀释液是含Casein、防腐剂P300、表面活性剂Tween-20的pH7.4的Tris-Hcl缓冲液。8. 根据权利要求1所述的巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒，其特征在于:所述显 色剂是含有TMB-HC1的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，PH3.0;底物液是含有过氧化氢尿素的柠檬 酸-乙酸盐缓冲液，PH5.0;所述终止液为0.4M硫酸溶液。
【专利摘要】本发明公开了一种巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒，包括微孔板、酶结合物工作液、样品稀释液、解离缓冲液、对照缓冲液、高亲和力质控品、低亲和力质控品；所述微孔板上包被有巨细胞病毒抗原；所述酶结合物工作液中的抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体；所述解离缓冲液由PBST溶液中加入8Mol/L尿素配制而成。本发明采用酶联免疫间接法原理进行检测，可以帮助区分巨细胞病毒感染是否为原发感染或新的复发感染，弥补了我国对人血清或血浆中巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测的空白，适合于手工操作，且操作方法简便，可用于大量样本的检测，为临床医生评估胎儿的健康状况和采取进一步的措施提供有力的帮助。
【IPC分类】G01N33/569, G01N33/543
【公开号】CN105510581
【申请号】CN201510931251
【发明人】王汝化, 陶占领, 王春霞, 赵金荣, 刘伟伟, 吴学炜
【申请人】郑州安图生物工程股份有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月11日