一种全人源抗GPC3的全分子IgG抗体及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种全人源抗GPC3的全分子IgG抗体，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。本发明还公开了上述全人源抗GPC3的全分子IgG抗体的应用。本发明还公开了一种编码上述全人源抗GPC3的全分子IgG抗体的基因。本发明还公开了一种表达载体，包含有上述基因以及与该基因操作性相连的表达调控序列。本发明还公开了一种宿主细胞，被上述表达载体所转化。
【专利说明】
一种全人源抗GPC3的全分子I gG抗体及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物免疫技术领域，尤其涉及一种全人源抗GPC3的全分子IgG抗体及 其应用，还涉及其编码基因，其编码基因的表达载体，及宿主细胞。
【背景技术】
[0002] 原发性肝细胞癌(HCC)的发病率在恶性肿瘤中排名世界第5位，而死亡率则位居第 3位。我国是肝癌高发区之一，每年有超过10万人死于原发性肝癌，只有10-20%的HCC患者 能在早期被诊断且接受手术治疗，大部分患者被诊断时已是晚期，预后较差，且治疗手段不 多。此外，原发性肝癌容易发生转移，即使是小肝癌根治性切除，术后5年转移复发率仍高达 50% ACC多通过血液循环，其次为淋巴管，也可以直接蔓延、侵袭或种植。肝癌的肝外器官 血行转移发生较早且交广泛，有研究表明，在尸检中发现60%以上的肝细胞癌伴肝外转移， 其中以肺最为常见(约占血行转移中的90%)。因此，早期诊治是改善HCC患者预后的最关键 因素之一。
[0003] 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖中的磷脂酰肌醇聚糖家族通过共价键 (glycosylphosphatilinositol，GPI)锚定在细胞表面的。在脊椎动物中，6个家庭成员已确 定(GPC1-6)。磷脂酰肌醇聚糖蛋白能够修改细胞信号通路，导致细胞增殖和组织生长。磷脂 酰肌醇聚糖3(GPC3)在肝细胞癌和其癌症包括黑色素瘤、鳞状细胞癌的肺，和卵巢透明细胞 癌中高表达，而在正常组织中不表达。GPC3基因编码一个70kDa大小的前体核心蛋白，可以 通过弗林蛋白酶裂解生成40kDa氨基(N)终端碎片和30kDa膜结合羧基(C)终端片段。其C端 有两个硫酸肝素（HS)多糖链。GPC3蛋白通过GPI锚定在细胞膜表面。GPC3结合Wnt和 Hedgehog信号通路中的蛋白，也可以结合一些基础的生长因子，如通过HS多糖链结合纤维 母细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2)〇
[0004] 抗GPC3抗体通过抑制GPC3基因功能可以阻止肝癌细胞的增殖或转移。目前抗GPC3 抗体大多以杂交瘤方式制备得到，如申请号为201210086009.X的专利《GPC3单克隆抗体杂 交瘤细胞株7D11及其制备方法和应用》，但往往特异性及亲和力不够理想。
【发明内容】
[0005] 基于【背景技术】存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种全人源抗GPC3的全分 子IgG抗体。
[0006] 本发明的目的又在于提供一种编码上述全人源抗GPC3的全分子IgG抗体的基因。
[0007] 本发明的目的又在于提供一种含有能编码上述全人源抗GPC3的全分子IgG抗体基 因的表达载体。
[0008] 本发明的目的又在于提供一种被上述表达载体所转化的宿主细胞。
[0009] 本发明的目的还在于提供上述全人源抗GPC3的全分子IgG抗体的应用。
[0010]为实现上述目的，本发明提出的一种全人源抗GPC3的全分子IgG抗体，所述轻链可 变区的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替 换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；
[0011] 所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，或者是该序列经一个或多个 氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。
[0012] 优选地，所述轻链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列如SEQ ID N0.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；
[0013] 所述重链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO. 10所示。
[0014]本发明还提出的一种全人源抗GPC3的全分子IgG抗体，所述轻链恒定区的氨基酸 序列如SEQ ID N0.11所示，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID N0.12所示。
[0015] 本发明还提出的一种DNA分子，其编码上述全分子IgG抗体的轻链和/或重链。
[0016] 优选地，编码上述全分子IgG抗体的轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0017] 优选地，编码如上述全分子IgG抗体的重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.2所 不。
[0018] 本发明还提出的一种表达载体，包含有上述DNA分子以及与该DNA分子操作性相连 的表达调控序列。
[0019] 本发明还提出的一种宿主细胞，被上述表达载体所转化。
[0020]优选地，所述宿主细胞可以是被上述表达载体转化的293Freestyle细胞。
[0021]本发明还提出的一种上述全分子IgG抗体在制备与GPC3相关的肿瘤的诊断或治疗 药剂中的应用。
[0022]本发明还提出的一种抑制GPC3介导的肿瘤药物，所述药物的活性成分为上述全分 子IgG抗体。
[0023]本发明使用噬菌体抗体库技术筛选到了对GPC3具有高度亲和力的人源Fab抗体， 并获取了赋予所述抗体优异特性的重链和轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，并将所 述抗体的重链和轻链可变区与含有抗体恒定区的表达载体连接，最终获得了具有特异的抗 原结合性和在细胞学上证明抗体可以抑制肿瘤细胞的生长对肿瘤细胞有杀伤作用的全人 源全分子抗体。
[0024]与国内现有的抗GPC3鼠源单抗相比，本发明制备的是全人源IgG抗体，而且实验证 明有很好的特异性及对GPC3阳性的肿瘤细胞有很好的杀伤作用。
[0025]本发明提供了一种具有高特异性、良好亲和力的抗GPC3的全分子全人源单克隆抗 体。GPC3在肝细胞癌和其癌症包括黑色素瘤、肺部鳞状细胞癌和卵巢透明细胞癌中高表达， 而在正常组织中不表达，因此本发明的抗GPC3抗体可应用于有关GPC3阳性的肿瘤的诊断、 治疗。本发明以GPC3为靶分子，在噬菌体抗体库技术的基础上制备出全分子人源抗体。对制 备的人源抗GPC3抗体做功能鉴定，显示该抗体能够与GPC3特异性结合，体外GPC3阳性肿瘤 细胞杀伤实验结果证实，该抗体能够有效抑制GPC3阳性的肿瘤细胞的增殖。
[0026]本发明人通过肿瘤细胞增殖抑制实验，证明抗GPC3抗体可以明显抑制肝癌细胞 Hep3B的增殖，细胞增殖率降低至约为20%。抗GPC3抗体对GPC3阳性的肝癌细胞具有较好的 杀伤作用。
【附图说明】
[0027] 图1为本发明实施例1所得纯化全人源抗GPC3的全分子I gG抗体的SDS-PAGE检测结 果，其中Μ为标准标记物，1为抗GPC3抗体，2为细胞培养上清，3为流穿。
[0028] 图2为本发明实施例1所得抗GPC3抗体的酶联免疫吸附试验检测结果。
[0029]图3为本发明实施例1所得抗GPC3抗体的免疫印迹鉴定结果，其中1为抗GPC3抗体 与GPC3阳性的肝癌细胞Η印3Β，2为抗GPC3抗体与GPC3阳性的肝癌细胞Α431。
[0030]图4为本发明实施例1所得抗GPC3抗体的亲和力检测结果。
[0031]图5为本发明实施例1所得抗GPC3抗体在体外与肝癌细胞的相互作用。
【具体实施方式】
[0032]下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0033]实施例1:全人源抗GPC3的全分子IgG抗体的制备
[0034] 1)用GPC3抗原在人源Fab噬菌体库中经过六轮"吸附-洗脱-扩增"的富集筛选，获 得抗GPC3的Fab抗体，然后通过PCR扩增测序获得Fab抗体的可变区序列；
[0035] 2)根据已获得的抗体的重轻链可变区序列设计引物；
[0036] 3)扩增PA21抗体重链、轻链：
[0037] 以上述制备的人源Fab模板，分别以上述涉及的重链和轻链的上下游引物扩增全 分子人源抗体重链、轻链基因。
[0038] (l)PCR
[0039] 反应体系如下：
[0040]
[0041 ]反应条件如下：
[0042]
[0043] (2)2%琼脂糖凝胶电泳，紫外下观察目的条带，切胶回收。
[0044] (3)胶回收试剂盒纯化目的DNA片段，去离子水洗脱。
[0045] 4)双酶切IgG表达质粒
[0046] IgG表达质粒pFUSE-CHIg-hGl、pFUSE-CLIg-hk(购自 Invivogen公司）包含IgGl型 人源的重链和轻链(Kappa)恒定区碱基编码序列。
[0047] (1 )pFUSE-CHIg-hGl、pFUSE-CLIg-hk 模板载体的双酶切 [0048] 反应体系如下：
[0049]
[0050]反应条件为:37 °C酶切过夜。
[0051 ] (2) 1 %琼脂糖凝胶电泳，紫外下切胶回收。
[0052] (3)胶回收试剂盒纯化目的DNA片段，去离子水洗脱。
[0053] 5)Infusion PCR重组表达质粒
[0054] 反应体系如下：
[0055]
[0056] 反应条件为：5(TC孵育15min。
[0057] 取5yL反应液转化感受态细菌，铺于相应抗性的平板上，次日挑克隆送测序。将测 序结果正确的克隆保存菌种并扩大培养，提取质粒。
[0058] 6)抗GPC3抗体的表达
[0059] (1)取50yg重组后的重链质粒于lmL的Opti-MEM培养基中，取50yg的轻链质粒于 lmL的Opti-MEM培养基中，取200yL的293Fectin于2.8mL的Opti-MEM培养基中，将上述三种 混合液室温静置5min;
[0060] (2)然后将两个质粒混合液混合均匀后，补加500yL的Opti-MEM培养基混合均匀后 直接加入转染试剂293Fectin的混合液，混合均匀后静置20min。期间处理293F细胞，将293F 细胞离心后用293F Expression Medium重悬，然后计数以及用台盼蓝计算细胞活力比，吸 取IX 108个细胞于培养瓶中，用293F Expression Medium定容为94mL;
[0061 ] (3)20min结束后将6mL的DNA、293Fectin的复合物加入准备好的293F细胞中；
[0062] (4)将细胞放在摇床培养箱中培养，培养条件8%C02，120rmp，37°C，6天后收集细 胞上清。
[0063] 7)抗GPC3抗体的纯化
[0064]将收集的细胞上清用0.22μπι的滤膜过滤，同时将平衡液和洗脱液过滤膜。用AKATA 纯化仪按照Protein Α纯化的标准步骤纯化，以lmL/min的速度上样，以1.5mL/min的速度洗 脱。
[0065] 结果成功表达并纯化抗GPC3抗体。将纯化抗GPC3抗体进行SDS-PAGE检测，其结果 如图1所示，由图1可知纯化的抗体纯度很高，且用Pro. A柱纯化效果较好。
[0066]实施例2:抗GPC3抗体的功能活性鉴定 [0067] 1)酶联免疫法
[0068]用包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6)GPC3蛋白至2yg/mL包被ELISA 96孔板，每孔 加入100yL，4 °C过夜;PBST (PBS含0.5 % TWeen20) 5 %脱脂牛奶-洗涤缓冲液封闭，37 °C孵育 2h; TOST洗涤5次后，每个孔中加入100yL PA21抗体(2yg/mL起始浓度，14个浓度梯度稀释） 37°C2h;以1:4000稀释的羊抗人二抗100μL7孔加入到孔内，37°C孵育lh;过氧化物酶底物显 色液100μL7孔，室温下10分钟后用2M硫酸中止反应，上机检测比色采用双波长450nm/ 690nm〇
[0069] 结果如图2所示，由图2可知:抗GPC3抗体能与GPC3蛋白起抗原抗体反应，且结合能 力较强。
[0070] 2)ffestern blot
[0071] 以不表达GPC3蛋白的肝癌细胞A431为阴性对照，分别将高表达GPC3的肝癌细胞 Hep3B和不表达GPC3蛋白的肝癌细胞A431进行10%SDS-PAGE电泳并电转到硝酸纤维膜上， 将此膜与2yg/mL PA21抗体室温孵育lh，1:4000稀释HRP-羊抗人IgG(北京中杉公司）和ECL 发光试剂盒(美国Pierce公司）曝光于凝胶成像系统(Bio-Rad公司）。
[0072] 结果如图3所示，由图3可知:抗GPC3抗体与Hep3B表达的GPC3蛋白有特异性结合。
[0073] 3)亲和力检测
[0074] 根据GPC3的等电点以及按照BiacoreXIOOcontrol soft的protocol优化偶联条 件，斜率优化选择醋酸钠作为偶联稀释缓冲液。用此缓冲液稀释GPC3样品稀释至25yg/mL后 偶联到CM5芯片上。预设偶联水平1500RU。然后用pH7.4的Running buffer稀释PA21样品，稀 释一系列浓度至 〇11]?、511]\1、1〇11]\1、2〇11]\1、4〇11]\1、8〇11]\1。设置进样时间为18〇8，解离时间1〇1^11，再 生缓冲液用50mM pH2 · 2Gly_HCl。按照BiacoreXIOOcontrol soft的protocol进行上机测 试。
[0075] 其亲和力检测结果如图4所示，KD值为7.9X10、。
[0076] 4)肝癌细胞体外杀伤实验
[0077] 将被试细胞A431和Hep3B细胞培养在含有10%小牛血清(FBS)和1%抗生素(P/S) 的DMEM培养基中，37 °C 5 %二氧化碳条件下培养。待细胞培养良好后转种在96微孔细胞培养 板上，过夜培养当细胞生长在96微孔细胞培养板上达70 %时，无菌条件下加入不同剂量的 抗体，继续培养24小时，显微镜下观察细胞死亡情况并照相，然后加 Cell Titer 96aqueous nonradioactive cell Proliferation assay(Promega MI)检查LDH，计算分析细胞死亡百 分数，实验重复三次。
[0078]抗GPC3抗体与肝癌细胞的相互作用结果如图5所示，由图5可知:在抗体的作用下， GPC3阳性的细胞，细胞存活率为20 %左右，而对GPC3阴性的细胞没有杀伤作用；当抗体量达 到ΙΟμ mol/L时可以使高表达GPC3的Hep3B细胞的存活率只有10%左右，而对照的A431细胞 存活率没有明显变化。
[0079] 上述文中Μ为mol/L的含义。
[0080] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种全人源抗GPC3的全分子IgG抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO.3所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变 而获得的保守性变异体； 所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是该序列经一个或多个氨基 酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。2. 根据权利要求1所述全分子IgG抗体，其特征在于，所述轻链可变区的三个抗原互补 区CDR的氨基酸序列如SEQIDN0.5、SEQIDN0.6和SEQIDN0.7所示 ； 所述重链可变区的三个抗原互补区⑶R的氨基酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和 SEQ ID NO .10所示。3. -种全人源抗GPC3的全分子IgG抗体，其特征在于，所述轻链恒定区的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 11所示，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 12所示。4. 一种DNA分子，其编码权利要求1-3任一项所述全分子IgG抗体的轻链和/或重链。5. 根据权利要求4所述DNA分子，其特征在于，编码如权利要求1所述全分子IgG抗体的 轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示。6. 根据权利要求4或5所述DNA分子，其特征在于，编码如权利要求1所述全分子IgG抗体 的重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。7. -种表达载体，包含有权利要求4-6任一项所述DNA分子以及与该DNA分子操作性相 连的表达调控序列。8. -种宿主细胞，被权利要求7所述表达载体所转化。9. 一种如权利要求1-3任一项所述全分子IgG抗体在制备与GPC3相关的肿瘤的诊断或 治疗药剂中的应用。10. -种抑制GPC3介导的肿瘤药物，其特征在于，所述药物的活性成分为权利要求1-3 任一项所述全分子I gG抗体。
【文档编号】G01N33/574GK106084041SQ201610483207
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】冯振卿, 唐奇, 许国贞, 刘振云, 朱进, 熊四平, 唐小军
【申请人】安徽未名细胞治疗有限公司