专利名称：风疹病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物应用技术领域，特别涉及一种风疹病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒 及其制备方法。
背景技术：
风疹病毒(rubella virus,RV)属节肢介体病毒中的披盖病毒(Togavirus)群，为 风疹的病原病毒。由T. H. Weller与F. A. Neva(1962)及P. D. Parkman等(1962)自风疹患 者的咽部洗涤液中分离到的。病毒粒子具有多形性，50-85nm，有包被。粒子中含有分子量 为2. 6-4. OX IO6的RNA(感染性核酸)。风疹病毒对公众健康的最大威胁就是它的致畸性。 母亲孕期原发感染可导致胎儿宫内感，其发病率和致畸率与感染时的胎龄密切相关，尤其 是前3个月感染风疹病毒可通过胎盘感染胎儿，导致流产、死胎、或致使新生儿产生一系列 的器官畸形，称为先天性风疹综合症(CRQ，先天性风疹患儿在生后数月内仍有病毒排出， 具有传染性。因此，建立风疹病毒快速、准确的检测方法是预防的关键所在。当风疹病毒进入机体后，最早出现的的免疫球蛋白是IgM抗体，之后出现IgG抗 体。仅对IgG检测，不能说明患者是现症感染或既往感染，而IgM检测阳性基本说明患者是 现症感染。但是由于IgM抗体半衰期较短，所以IgM的检测阴性并不能证明机体未受到感 染，还需要检测半衰期较长，含量最高的IgG抗体，以明确诊断。因此，为了更好的诊断机体 对风疹病毒的免疫反应状态，需要同时检测风疹病毒的IgG和IgM抗体。目前较多使用的 方法是经过分别对风疹病毒IgG和IgM抗体单独检测之后，再对检测结果进行综合分析，以 确定最终的诊断结果。但是这种方法操作过程繁琐，不够简便快捷。因此，本发明提供一种 能够用于同时检测机体内风疹病毒IgG、IgM抗体的试剂盒，简化了操作过程，检测方便、快 捷。目前用于检测风疹病毒IgG抗体或IgM抗体的方法有很多，主要包括酶联免疫吸 附法(ELISA)、免疫胶体金渗滤法、乳胶凝集法、免疫荧光法(IFA)等。本发明采用胶体金免 疫层析法(Immimochromatography Assay)，这种方法开始于上个世纪90年代中期，是在免 疫渗滤法的基础上发展起来的，是免疫亲和技术、印刷技术、免疫标记技术和层析技术的结 合。这种方法目前已得到较为广泛的运用，它的基本原理是利用胶体金标记一种抗原或抗 体，相应的配对抗原或抗体包被在硝酸纤维素膜上，检测样品时，胶体金标记物和样品中的 配体相结合形成复合物，然后再通过层析作用向上移动，与包被抗原或抗体结合而凝聚显 色，从而实现对样品检测结果的判定。此方法操作简单、反应快速、敏感性高、特异性强、稳 定性好，经济实用，适合于现场检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种方便、快捷、用于同时检测风疹病毒IgG、IgM抗体的试 剂盒，检测人类样本中风疹病毒IgG，IgM抗体，用于风疹病毒感染的辅助诊断和鉴别。本发明提供了一种风疹病毒IgG，IgM抗体联检试剂盒。包括样品垫(1)、紧密连接于样品垫一端的胶体金垫O)，与胶体金垫的另一端紧密相连的硝酸纤维素膜C3)和紧 密连接于硝酸纤维素膜另一端的吸样垫，硝酸纤维素膜包被了三条线，其中两条检测线 (T1, T2线)，一条质控线(C线)。样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫粘贴在底板5 上形成试剂条，试剂条也可以装入塑料卡中形成卡型包装。其特征在于检测线为分别包被 在硝酸纤维素膜上的鼠抗人IgM抗体(T1线)、风疹病毒抗原(T2线)；所述胶体金垫为胶体 金标记的风疹病毒抗原玻璃纤维(或无纺布)；所述的底板为PVC板，样品垫为玻璃纤维或 无纺布，吸样垫为吸水滤纸。本发明还提供了一种风疹病毒IgG，IgM抗体联检试剂盒的制备方法，包括以下步 骤(1)制备风疹病毒抗原选用风疹病毒敏感细胞株，接种风疹病毒的标准毒株，经细胞培养，获取抗原。(2)制备鼠抗人IgM单克隆抗体用人源性的IgM抗体免疫BALB/C小鼠，按常规方法进行细胞融合，克隆，收取腹 水，提纯抗人IgM抗体。(3)制备胶体金颗粒取0. 01%的氯金酸水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1 %枸橼酸三钠水 溶液1. 0ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒的大小为20-40nm。(4)制备胶体金垫取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液，用0. lmol/L K2CO3将胶体金溶液的pH值 调至8. 0，按IOOml胶体金溶液加入1. Omg风疹病毒抗原的比例混合均勻，室温搅拌30分 钟；加入10%牛血清蛋白(BSA)溶液，室温搅拌5分钟；加入10%聚乙二醇(PEG) 2000溶 液，室温搅拌5分钟；llOOOr/min离心60分钟，仔细吸取上清液，弃去；用胶体金复溶液复 溶至100ml，按Iml溶液铺^cm2的比例均勻铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间，在温 度25°C，湿度小于30%的条件下干燥2小时，制成胶体金垫，置4°C备用。。(5)样品垫的处理将玻璃纤维或无纺布浸泡于含有5ml 10% BSA, 2. 5ml 10% Tween-20的0. OlM pH 7. 4的磷酸缓冲溶液50ml中30min，于38°C烘干，真空封装，置4°C备用。(6)包被鼠抗人IgM抗体、风疹病毒抗原，羊抗鼠IgG (或兔抗鼠IgG)设定划膜仪涂覆参数1 μ L/cm,分别用微量进样器取Iml抗人IgM抗体、风疹病毒 抗原、羊抗鼠IgG，按顺序接到划膜仪的A、B、C管道接口。将贴有硝酸纤维素膜的PVC板置 于划膜仪的往复运动平台上，开启划膜仪，在硝酸纤维素膜上涂覆抗人IgM抗体(T1线)、风 疹病毒抗原0~2线)、羊抗鼠IgG(C线)。划线后将硝酸纤维素膜烘箱中，温度38°C，干燥M 小时，封装备用。(7)试剂盒的组装将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫按图1所示的顺序依次粘贴在底板 上，切成2. 5mm宽的小条，制得试剂条，也可以将试剂条装在塑料卡中形成检测卡。本发明所述试剂盒的检测方法为将被检血清或血浆或全血平衡至室温；取出风 疹病毒IgG，IgM抗体联检装置，水平放置；在样品垫中加入2-3滴样品，15分钟内观察并记 录C、T1, T2线的显色情况，判断检测结果。
本发明的检测试剂盒采用免疫层析胶体金技术测定IgG、IgM抗体，检测时，将被 测样品加在试纸条(卡)上的样品垫上，可以直接观察到免疫反应的结果，完成样品检测。 本发明可用于定性检测样本中可能存在的风疹病毒，达到快速筛检病人，及时控制疫情的 目的。可通过一次操作即可联合检测出风疹病毒IgG、IgM抗体，简化了操作过程，且检测结 果具有较高的总体符合率，具有操作简单、反应迅速、灵敏度高、经济实用等特点。
图1风疹病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒结构示意图；附图符号说明1 样品垫；2 含有标记风疹病毒抗原的胶体金垫；3 硝酸纤维素膜(T1和T2 包被鼠抗人IgM抗体、风疹病毒抗原的两条检测线，C 包被羊抗鼠IgG的质控线)；4 吸样垫；5 底板。图2本发明试剂盒的检测结果示意图。自左至右依次为I\、C两条线阳性检测结果；T2、C两条线阳性检测结果；I\、T2、C三 条线阳性检测结果；C 一条线阴性检测结果 ’无效。
具体实施例方式实施例1 风疹病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒的制备方法1.制备风疹病毒抗原常规进行BHK-21细胞培养，待细胞生长旺盛后，在培养瓶中接种风疹病毒的标准 毒株，风疹病毒毒株接种后2-3天，开始出现细胞病变，待细胞病变达到85 %以上，收集培 养液和/或病变细胞，再用PBS洗3次，冻融3次后超声破碎，差速离心和甘油梯度离心纯 化风疹病毒抗原。测定蛋白含量和包被工作浓度后，加50%甘油-20°C保存备用。2.制备抗人IgM单克隆抗体用纯化的高浓度人IgM免疫BALB/C小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 融合，抗体阳性孔细胞经3次克隆，扩增后注入BALB/C小鼠腹腔制备腹水，经正辛酸方法提 纯单克隆抗体。保存在0-4°C冰箱中备用。3.制备胶体金颗粒取0. 01%的氯金酸水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1 %枸橼酸三钠水 溶液1. 0ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒的大小为20-40nm。4.胶体金垫的制备 取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液，用0. lmol/L K2CO3将胶体金溶液的pH值调 至8. 0左右，按IOOml胶体金溶液加入1. Omg风疹病毒抗原的比例混合均勻，室温搅拌30 分钟；加入10%牛血清蛋白(BSA)溶液，室温搅拌5分钟；加入10%聚乙二醇(PEG) 2000溶 液，室温搅拌5分钟；llOOOr/min离心60分钟，仔细吸取上清液，弃去；用胶体金复溶液复 溶至100ml，按Iml溶液铺^cm2的比例均勻铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间，在温度25°C，湿度小于30%的条件下干燥2小时，制成胶体金垫，置4°C备用。5.样品垫的处理将玻璃纤维或无纺布浸泡于含有5ml 10% BSA, 2. 5ml 10% Tween-20的0. OlM pH 7. 4的磷酸缓冲溶液50ml中30min，于38°C烘干，真空封装，置4°C备用。6.包被鼠抗人IgM抗体、风疹病毒抗原，羊抗鼠IgG (或兔抗鼠IgG)设定划膜仪涂覆参数1 μ L/cm,分别用微量进样器取Iml抗人IgM抗体、风疹病毒 抗原、羊抗鼠IgG (或兔抗鼠IgG)，按顺序接到划膜仪的A、B、C管道接口。将贴有硝酸纤维 素膜的PVC板置于划膜仪的往复运动平台上，开启划膜仪，在硝酸纤维素膜上分别涂覆浓 度为0. 8mg/ml的抗人IgM抗体(T1线)、浓度为1. Omg/ml的风疹病毒抗原(T2线)、浓度为 0. 8mg/ml的羊抗鼠IgG (或兔抗鼠IgG) (C线)。划线后将硝酸纤维素膜烘箱中，温度38°C， 干燥M小时，封装备用。7.试剂盒的组装将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫按图1所示的顺序依次粘贴在底板 上，切成2. 5mm宽的小条，制得试剂条，也可以将试剂条装在塑料卡中形成检测卡。将被检血清或血浆或全血平衡至室温；取出风疹病毒IgG，IgM抗体联检装置，水 平放置；在样品垫中加入2滴样品，15分钟内观察并记录C、T1, T2线的显色情况，判断检测结果。检测样品(血清、血浆或全血)时，样品与胶体金标记风疹病毒抗原复合物在层析 作用下沿纸条向上移动，当样品-胶体金标记风疹病毒抗原复合物移动到鼠抗人IgM单克 隆抗体包被线(T1)时，若样品中含有风疹病毒IgM抗体，则IgM抗体与包被线上的鼠抗人 IgM单克隆抗体结合，形成胶体金-风疹病毒抗原-IgM抗体-鼠抗人IgM单克隆抗体夹心 物而凝聚显色，此时T1包被线可观察到红色条带；当样品-胶体金标记风疹病毒复合物移 动到风疹病毒抗原包被线(T2)时，若样品中含有风疹病毒IgG抗体，则形成胶体金-风疹病 毒抗原-IgG抗体-风疹病毒抗原夹心物而凝聚显色，此时T2包被线可观察到红色条带；当 胶体金标记风疹病毒复合物移动到羊抗鼠IgG包被线(C)时，与羊抗鼠IgG结合而显色，此 时C包被线可观察到红色条带。在T1包被线观察到红色条带，判定为样品中含有风疹病毒 IgM抗体；在T2包被线可观察到红色条带，判定为样品中含有风疹病毒IgG抗体；若1\、T2 包被线处同时可观察到红色条带，只能判定为被检测样品中含有风疹病毒IgM抗体；若1\、 T2包被线处同时不能观察到红色条带，则判定为被检测样品中不含有风疹病毒IgG，IgM抗 体；无论风疹病毒IgG，IgM抗体是否存在于样本中，一条红色条带都会出现在质控线(C)。 质控线(C)所显现的红色条带是判定是否有足够样本，层析过程是否正常的标准，同时也 作为试剂的内控标准。
权利要求
1.一种利用特异性的抗原抗体反应及胶体金免疫层析技术制备的风疹病毒IgG、IgM 抗体联检试剂盒，其特征在于由样品垫(1)、胶体金垫O)、硝酸纤维素膜(3)、吸样垫(4) 和底板( 组成，底板上依次粘贴样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫，胶体金垫为 胶体金标记的风疹病毒抗原玻璃纤维或无纺布，硝酸纤维素膜上依次包被有鼠抗人IgM抗 体、风疹病毒抗原、羊抗鼠IgG，以鼠抗人IgM抗体、风疹病毒抗原包被线作为检测线，以羊 抗鼠IgG包被线作为质控线。
2.一种如权利要求1所述的风疹病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，所述的 底板为PVC板，样品垫为玻璃纤维或无纺布，吸样垫为吸水滤纸。
3.—种如权利要求1所述的风疹病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，所述的 胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂枸橼酸三钠作用下，聚合成为大小为20-40nm的胶体 金颗粒。
4.一种如权利要求1所述的风疹病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，所述的 胶体金标记风疹病毒抗原的PH值为8. 0，胶体金与抗原的配比为10 μ g/ml胶体金。
5.一种如权利要求1所述的风疹病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，所述的 风疹病毒抗原的制备方法为选用风疹病毒敏感细胞株，接种风疹病毒的标准毒株，经细胞 培养，获取风疹病毒抗原。
6.一种如权利要求1所述的风疹病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，所述的 抗人IgM抗体的制备方法为用人源性的IgM抗体免疫BALB/C小鼠，按常规方法进行细胞 融合，克隆，收取腹水，提纯抗人IgM抗体。
7.—种如权利要求1所述的风疹病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，所述的硝 酸纤维素膜上三条包被线的划线方法为用划膜仪在硝酸纤维素膜上以1 μ L/cm的参数进 行划线，包被鼠抗人IgM抗体作为T1检测线，风疹病毒抗原作为T2检测线，包被羊抗鼠IgG 作为C质控线，划线后将硝酸纤维素膜烘箱中，温度38°C，干燥M小时。
8.—种如权利要求1所述的风疹病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，检测方 法为将被检血清或血浆或全血平衡至室温，将试纸条或检测卡平放，在上样垫中加入2-3 滴样品，15分钟内观察并记录C、1\、T2线的显色情况，判断检测结果。
全文摘要
本发明提供了一种风疹病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒及其制备方法。试剂盒包括样品垫(1)、胶体金垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸样垫(4)和底板(5)。其中，所述胶体金垫为胶体金标记的风疹病毒抗原玻璃纤维(或无纺布)；所述硝酸纤维素膜上依次包被有鼠抗人IgM抗体、风疹病毒抗原、羊抗鼠IgG，以鼠抗人IgM抗体、风疹病毒抗原作为检测线，以羊抗鼠IgG作为质控线。本发明利用特异性的抗原抗体反应及胶体金免疫层析技术检测风疹病毒IgG、IgM抗体，通过一次操作即可联合检测出风疹病毒IgG、IgM抗体，简化了操作过程，具有操作简单、反应迅速、灵敏度高、经济实用等特点。
文档编号G01N21/78GK102109519SQ20091026547
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月29日 优先权日2009年12月29日
发明者李峰, 杨利, 陈立柱 申请人:北京库尔科技有限公司