专利名称：丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物应用技术领域，特别涉及一种丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试 剂盒及其制备方法。
背景技术：
丙型肝炎病毒简称为HCV，在病毒分类上属于正链RNA病毒，呈球形，直径小于 80nm(在肝细胞中为36 40nm，在血液中为36_62歷)。丙型肝炎是由HCV所引起，是严重 威胁人类健康的传染病之一，由于至今尚无预防疫苗问世，也没有特效药物治疗，因此早期 诊断是防止HCV传播的有效手段。丙型肝炎是通过输血或血制品、血透析、单采血浆还输血 球、肾移植、静脉注射毒品、性传播、母婴传播等传染引起的。在预防丙肝的措施上，筛选献 血员是重要一环，凡血中抗-HCV阳性或HCVRNA阳性均不能作为献血员，国外30-90%输血 后肝炎为丙型肝炎，我国输血后肝炎中丙型肝炎占1/3。建立HCV快速、准确的检测方法是 预防的关键所在。IgM和IgG是人或动物体内最重要的两种抗体。当一种抗原(病毒或细菌)进入 机体后，免疫应答中首先分泌的抗体是IgM抗体，它们在与抗原结合后启动补体的级联反 应，同时还把入侵者相互连接起来，聚成一堆便于巨噬细胞的吞噬，因此IgM在机体的早期 防御中起着重要的作用；而IgG抗体是血清免疫球蛋白的主要成分，它占总的免疫球蛋白 的75%，是初级免疫应答中最持久、最重要的抗体，它仅以单体形式存在，大多是抗菌性、抗 毒性和抗病毒抗体属于IgG，在抗感染中起到主力军作用，能够促进单核巨噬细胞的吞噬作 用(调理作用)，中和细菌毒素的毒性(中和毒素)和病毒抗原结合使病毒失去感染宿主细 胞的能力(中和病毒)。仅对IgG检测，不能说明患者是现症感染或既往感染，虽然IgM的 检出率要比IgG的检出率低，但是IgM检测阳性基本说明患者是现症感染。由于IgM抗体 半衰期较短，所以IgM的检测阴性并不能证明机体未受到感染，还需要检测半衰期较长，含 量最高的IgG抗体，以明确诊断。因此，要明确诊断机体对特定抗原的免疫反应状态，可以 同时检测机体内IgG、IgM抗体的存在。因此本发明提供一种丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联 检试剂盒以明确诊断HCV感染。目前单独检测丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体的方法很多，例如酶联免疫吸附法 (ELISA)、免疫胶体金渗滤法、乳胶凝集法、免疫荧光法(IFA)等。但还未有通过一次操作即 可联检丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体的方法。虽然分别单独检测丙型肝炎病毒IgG抗体和 IgM抗体后，再综合分析检测结果对疾病的诊断并无影响，但操作过程繁琐，检测不够方便 快捷。本发明提供一种丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒及其制备方法，能够一次 性检测丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体，从而简化了操作过程，实现了快速检测的目的。本发明 采用胶体金免疫层析法(Immimochromatography Assay)，这种方法开始于上个世纪90年 代中期，是在免疫渗滤法的基础上发展起来的，是免疫亲和技术、印刷技术、免疫标记技术 和层析技术的结合。这种方法目前已得到较为广泛的运用，它的基本原理是禾_胶体金标记一种抗原或抗体，相应的配对抗原或抗体包被在硝酸纤维素膜上，检测样品时，胶体金标 记物和样品中的配体相结合形成复合物，然后再通过层析作用向上移动，与包被抗原或抗 体结合而凝聚显色，从而实现对样品检测结果的判定。此方法操作简单、反应快速、敏感性 高、特异性强、稳定性好，经济实用，适合于现场检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种方便、快捷、灵敏，用于检测丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体 的试剂盒，检测人类样本中丙型肝炎病毒IgG，IgM抗体，用于丙型肝炎病毒感染的辅助诊 断和鉴别。本发明提供了一种丙型肝炎病毒IgG，IgM抗体联检试剂盒。包括样品垫(1)、紧 密连接于样品垫一端的含有标记HCV多表位复合抗原的胶体金垫O)、与胶体金垫的另一 端紧密相连的硝酸纤维素膜C3)和紧密连接于硝酸纤维素膜另一端的吸样垫G)。硝酸纤 维素膜包被了三条线，其中两条检测线0\，1~2线)，一条质控线(C线)。样品垫、胶体金垫、 硝酸纤维素膜和吸样垫粘贴在PVC支撑板( 上形成试剂条，试剂条也可以装入塑料卡中 形成检测卡。其特征在于检测线为分别包被在硝酸纤维素膜上的鼠抗人IgM抗体(1\线)、 HCV多表位复合抗原(T2线)；所述胶体金垫为胶体金标记的HCV多表位复合抗原玻璃纤维 (或无纺布)；所述的底板为PVC板，样品垫为玻璃纤维或无纺布，吸样垫为吸水滤纸。本发明还提供了一种丙型肝炎病毒IgG，IgM抗体联检试剂盒的制备方法，包括以 下步骤(1)制备HCV多表位复合抗原选取5个丙型肝炎病毒高度保守的T细胞和B细胞表位，利用大肠杆菌表达、并经 过高度纯化的丙型肝炎病毒多表位复合抗原。(2)制备抗人IgM抗体用纯化的高浓度人IgM免疫BALB/C小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 融合，抗体阳性孔细胞经3次克隆，扩增后注入BALB/C小鼠腹腔制备腹水，经正辛酸方法提 纯单克隆抗体。保存在0-4°C冰箱中备用。(3)制备胶体金颗粒取0.01%的氯金酸水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1 %枸橼酸三 钠水溶液0. 75-2. 5ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒的大小为 20-40nm。(4)胶体金垫的制备取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液，用0. lmol/L K2CO3将胶体金溶液的pH值 调至8. 0左右，按IOOml胶体金溶液加入1. 5mgHCV多表位复合抗原的比例混合均勻，室 温搅拌30分钟；加入10%牛血清蛋白(BSA)溶液，室温搅拌5分钟；加入10%聚乙二醇 (PEG) 2000溶液，室温搅拌5分钟；llOOOr/min离心60分钟，仔细吸取上清液，弃去；用胶体 金复溶液复溶至100ml，按Iml溶液铺^cm2的比例均勻铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置 干燥间，在温度20°C，湿度小于30%的条件下干燥2小时，制成胶体金垫。(5)样品垫的处理将玻璃纤维或无纺布浸泡于50ml 0. OlM pH 7. 4的磷酸缓冲溶液(含有5ml 10%BSA, 2. 5ml 10% Tween-20)中30min，于38°C烘干，真空封装，储存于4°C，备用。(6)包被鼠抗人IgM抗体、HCV多表位复合抗原，抗HCV抗体设定划膜仪涂覆参数1 μ L/cm,分别用微量进样器取Iml抗人IgM抗体、HCV多表 位复合抗原、抗HCV抗体，按顺序接到划膜仪的A、B、C管道接口。将贴有硝酸纤维素膜的 PVC板置于划膜仪的往复运动平台上，开启划膜仪，在硝酸纤维素膜上涂覆抗人IgM抗体 0\线)、!1(^多表位复合抗原(T2线)、抗HCV抗体(C线)。划线后将硝酸纤维素膜烘箱中， 温度38°C，干燥M小时，备用。(7)试剂盒的组装将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫按图1所示，依次搭接粘贴在底板上， 切成2. 5mm宽的小条，制成试剂条，试剂条也可以装在塑料卡中形成检测卡。本发明所述试剂盒的检测方法为将被检血清或血浆或全血平衡至室温；取出丙 型肝炎病毒IgG，IgM抗体联检装置，水平放置；在样品垫中加入2-3滴样品，15分钟内观察 并记录C、T1, T2线的显色情况，判断检测结果。本发明的检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术测定丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体， 检测时，将被测样品加在试纸条(卡)上的样品垫上，可以直接观察到免疫反应的结果，完 成样品检测。本发明可用于定性检测样本中可能存在的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体，达到 快速筛检病人的目的。可通过一次操作即可联合检测出丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体，简化 了操作过程，且检测结果具有较高的总体符合率，具有操作简单、反应迅速、灵敏度高、经济 适用等特点。
图1丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒结构示意图；附图符号说明1 样品垫；2 含有标记HCV多表位复合抗原的胶体金垫；3 硝酸纤维素膜(T1, T2 分别包被了鼠抗人IgM抗体、HCV多表位复合抗原的两条 检测线；C 包被抗HCV抗体的质控线)；4 吸样垫；5:底板；图2本发明试剂盒的检测结果示意图。自左至右依次是I\、C两条线阳性，T2、C两条线阳性，I\、T2、C三条线阳性；C 一条 线阴性 ’无效。
具体实施例方式实施例1 制备丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒1.制备HCV多表位复合抗原选取5个丙型肝炎病毒高度保守的T细胞和B细胞表位，分别来自核心蛋白 (l-16aa, 132_141aa)，El (126_135aa)，NS3 (139_147aa)及 NS5 (768_775aa)，利用大肠杆菌 表达、并经过高度纯化制得丙型肝炎病毒多表位复合抗原。
2.制备抗人IgM抗体用纯化的高浓度人IgM免疫BALB/C小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 融合，抗体阳性孔细胞经3次克隆，扩增后注入BALB/C小鼠腹腔制备腹水，经正辛酸方法提 纯单克隆抗体。保存在0-4°C并向中备用。3.制备胶体金颗粒取0. 01%的氯金酸水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1 %枸橼酸三钠水 溶液1ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒的大小为20-40nm。4.胶体金垫的制备取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液，用0. lmol/L K2CO3将胶体金溶液的pH值 调至8. 0左右，按IOOml胶体金溶液加入2. OmgHCV多表位复合抗原的比例混合均勻，室 温搅拌30分钟；加入10%牛血清蛋白(BSA)溶液，室温搅拌5分钟；加入10%聚乙二醇 (PEG) 2000溶液，室温搅拌5分钟；llOOOr/min离心60分钟，仔细吸取上清液，弃去；用胶体 金复溶液复溶至100ml，按Iml溶液铺^cm2的比例均勻铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置 干燥间，在温度20°C，湿度小于30%的条件下干燥2小时，制成胶体金垫。5.样品垫的处理将玻璃纤维或无纺布浸泡于50ml 0. OlM pH 7. 4的磷酸缓冲溶液(含有5ml 10% BSA, 2. 5ml 10% Tween-20)中30min，于38°C烘干，真空封装，储存于4°C，备用。6.包被鼠抗人IgM抗体、HCV多表位复合抗原，抗HCV抗体设定划膜仪涂覆参数1 μ L/cm,分别用微量进样器取Iml抗人IgM抗体、HCV多 表位复合抗原、抗HCV抗体，按顺序接到划膜仪的A、B、C管道接口。将贴有硝酸纤维素膜 的PVC板置于划膜仪的往复运动平台上，开启划膜仪，在硝酸纤维素膜上分别涂覆浓度为 2. Omg/ml的抗人IgM抗体(T1线)、浓度为1. 5mg/ml的HCV多表位复合抗原(T2线)、浓度 为2.0mg/ml的抗HCV抗体(C线)。划线后将硝酸纤维素膜烘箱中，温度38°C，干燥M小 时，备用。7.试剂盒的组装将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫按图1所示，依次搭接粘贴在底板上， 切成2. 5mm宽的小条，制成试剂条，试剂条也可以装在塑料卡中形成检测卡。将被检血清或血浆或全血平衡至室温；取出丙型肝炎病毒IgG，IgM抗体联检装 置，水平放置；在样品垫中加入2滴样品，15分钟内观察并记录C、I\、T2线的显色情况，判断 检测结果。检测样品(血清、血浆或全血)时，若是阳性，样品与胶体金标记丙型肝炎病毒结 合，由于层析作用复合物沿纸条向前移动，当样品-胶体金标记丙型肝炎病毒复合物移动 到鼠抗人IgM单克隆抗体包被线(T1)时，若样品中含有丙型肝炎病毒IgM抗体，则IgM抗体 与包被线上的鼠抗人IgM单克隆抗体结合，形成胶体金-HCV多表位复合抗原-IgM抗体-鼠 抗人IgM单克隆抗体夹心物而凝聚显色，此时T1包被线可观察到红色条带；当样品-胶体 金标记丙型肝炎病毒复合物移动到HCV多表位复合抗原包被线(T2)时，若样品中含有丙型 肝炎病毒IgG抗体，则形成胶体金-HCV多表位复合抗原-IgG抗体-HCV多表位复合抗原夹 心物而凝聚显色，此时T2包被线可观察到红色条带，表明样品中含有丙型肝炎病毒IgG抗 体；当胶体金标记丙型肝炎病毒复合物移动到抗HCV抗体包被线(C)时，与抗HCV抗体结合而显色，此时C包被线可观察到红色条带。在T1包被线观察到红色条带，判定为样品中含 有丙型肝炎病毒IgM抗体；在T2包被线可观察到红色条带，判定为样品中含有丙型肝炎病 毒IgG抗体；若I\、T2包被线处同时可观察到红色条带，只能判定为被检测样品中含有丙型 肝炎病毒IgM抗体；若Ι\、Τ2包被线处同时不能观察到红色条带，则判定为被检测样品中不 含有丙型肝炎病毒IgG，IgM抗体；无论丙型肝炎病毒IgG，IgM抗体是否存在于样本中，一 条红色条带都会出现在质控线(C)。质控区线(C)所显现的红色条带是判定是否有足够样 本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。
权利要求
1.一种利用胶体金免疫层析技术制备的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，包括 样品垫(1)、胶体金垫O)、硝酸纤维素膜(3)、吸样垫(4)及底板(6)，其中，胶体金垫为胶 体金标记的HCV多表位复合抗原玻璃纤维(或无纺布)，硝酸纤维素膜上分别包被了抗人 IgM抗体、HCV多表位复合抗原作为检测线，抗HCV抗体作为质控线。
2.一种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，所 述的底板为PVC板，样品垫为玻璃纤维或无纺布，吸样垫为吸水滤纸。
3.—种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，所 述的胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂枸橼酸三钠作用下，聚合成为大小为20-40nm的 胶体金颗粒。
4.一种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，所 述的胶体金标记HCV多表位复合抗原的pH值为8. 0，胶体金与抗原的配比为15 μ g/ml胶体金ο
5.一种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，其特征在于所述 的硝酸纤维素膜上包被的抗人IgM抗体的浓度为1. Omg/ml, HCV多表位复合抗原的浓度为 1. 5mg/ml，抗HCV抗体的浓度为1. Omg/ml。
6.一种如权利要求1和6所述的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，其特征在于， 所述的硝酸纤维素膜上三条包被线的划线方法为将配制好的抗人IgM抗体溶液与HCV多 表位复合抗原溶液，用划膜仪在硝酸纤维素膜的上部和中部以ι μ L/cm的参数进行划线， 包被Tl和T2线，同时在硝酸纤维素膜的下部包被抗HCV抗体作为C线，划线后将硝酸纤维 素膜烘箱中，温度38°C，干燥M小时。
7.—种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，所 述的试剂盒的组装方法为将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫依次粘贴在底板上， 且成小条，制成试剂条，也可以将试剂条装在塑料卡中形成检测卡。
8.—种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，检 测方法为将被检血清或血浆或全血平衡至室温，将试纸条或检测卡平放，在上样垫中加入 2-3滴样品，15分钟内观察并记录C、T1, T2线的显色情况，判断检测结果。
全文摘要
本发明涉及一种丙型肝炎IgG、IgM抗体联检试剂盒及其制备方法。该试剂盒以胶体金为标记物，在底板(5)上顺次相互搭接地粘附有样品垫(1)、以胶体金标记的丙型肝炎(HCV)混合抗原玻璃纤维或无纺布构成的胶体金垫(2)、分别包被了抗人IgM抗体、HCV混合抗原作为检测线，包被了抗HCV抗体作为质控线的硝酸纤维素膜(3)、吸样垫(4)。本发明采用胶体金免疫层析技术测定丙型肝炎IgG、IgM抗体，通过一次操作即可联合检测出丙型肝炎IgG、IgM抗体，简化了操作过程，具有操作简单、反应迅速、灵敏度高、经济实用等特点。
文档编号G01N21/78GK102109523SQ200910265470
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月29日 优先权日2009年12月29日
发明者李峰, 杨利, 陈立柱 申请人:北京库尔科技有限公司