一种检验Liddle’s相关基因突变的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测Liddle’s综合征相关基因突变样品制备试剂盒。具体的涉及一种应用大规模平行测序平台技术检测Liddle’s综合征相关基因的产品，该试剂盒包括：A.独特设计并制备捕获探针，针对基因SCNN1B、SCNN1G全部外显子片段；B.设计独特带有标签序列的接头；C.通用引物对探针序列进行PCR扩增；D.设计独特的混合后目的片段的捕获操作。这个方法和试剂盒制备的大规模平行测序平台样品通量大、效率高、操作简便，极大地降低了测序检验成本。
【专利说明】-种检验Liddle' s相关基因突变的试剂盒 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于分子生物学领域，涉及医学诊断和生物技术，涉及一种检测Liddle' s 相关基因突变的体外诊断试剂盒，是一种应用于新一代测序平台技术的一种Liddle' s相 关基因突变的试剂盒。 技术背景
[0002] Liddle's综合征是一种常染色体显性遗传的单基因高血压病，其临床特征是早发 的高血压，低血钾，低肾素，低醛固酮血症，对上皮钠通道（ENaC)抑制剂阿米洛利或氨苯蝶 啶敏感，而对醛固酮受体拮抗剂螺内酯不敏感，常规高血压药物治疗效果欠佳。
[0003] Liddle' s综合征是一种罕见疾病，但其发病率可能要比预期的高，是单基因遗传 性高血压病的最常见病因之一。该病在不同种族均有病例报道，包括高加索人、亚洲人、非 洲人等。美国一项研究对149例血钾低于4. Ommol/L且患有高血压的退伍军人进行调查， 结果显示Liddle' s综合征发病率高达6% [1]。
[0004] Liddle' s综合征的分子基础为编码ENaC的基因（SCNN1B和SCNN1G)获得性功能 突变，最常见的突变是β或Y亚单位C羧基末端和富含脯氨酸的高度保守序列PY基序 (Ρ :脯氨酸，Υ :酪氨酸，L :亮氨酸）断裂、错义、提前产生终止密码或移码突变所致。ΡΥ基 序基因突变可导致ENaC持续活化，钠重吸收增加，血压升高，醛固酮和肾素分泌受到抑制， 从而出现Liddle' s综合征的一系列临床症状。其关键性的病理生理改变为：远端肾小管 的ENaC对钠的重吸收增加，细胞外液容量扩张。
[0005] Liddle's综合征患者临床表现为高血压、低血钾、代谢性碱中毒，血浆肾素和醛固 酮水平在正常范围或降低，大多有明确的高血压家族史。服用阿米洛利对控制高血压有效 可支持对该病的诊断。近年来也有一些轻中度高血压伴或不伴低血钾的Liddle' s综合征 患者的报道。
[0006] Liddle's综合征患者具有发病年龄小，容易出现靶器官损害，故对于年龄< 30岁 的高血压患者，一旦有高血压家族遗传史，且具有低血浆肾素活性、低血钾等特征时，应考 虑进行SCNN1B和SCNN1G基因筛查，有助于早期病因诊断，早期指导治疗，一旦确诊，给予限 盐和口服阿米洛利或氨苯蝶啶可收到良好的治疗效果，从而避免恶性心血管事件的发生。
[0007] 由于Liddle' s综合征一直被视为一种罕见病，患者长期被误诊，造成血压控制困 难，大量使用降压药导致药物副作用增加，早年发生心肾功能不全等靶器官损害，脑卒中甚 至猝死。
[0008] [l]Tapolyai M, Uysal A, Dossabhoy NR, et al. High prevalence of Liddle, s syndrome phenotype among hypertensive US Veterans in Northwest Louisiana. J Clin Hypertens (Greenwich). 2010 ；12 (11) :856-860.
[0009] 对于Liddle' s综合征的鉴别诊断传统的方法主要依靠生化检查和影像学检查。 这些手段存在很大的缺点：
[0010] 1.检查种类多；
[0011] 2.灵敏度和特异度低；
[0012] 3.易受药物和精神状况等因素的影响；
[0013] 4.检测时间要求苛刻；
[0014] 基因诊断的优势在于：
[0015] 1.方便，安全，快捷：仅抽取2-4毫升血：
[0016] 2.任何时间都可以检查；
[0017] 3.不限制饮食，服药，任何身体状况都可以检测；
[0018] 4.相比反复，多项传统检查，更为经济；
[〇〇19] 5.发病前，疾病极早期诊断的唯一方式；
[0020] 6.源头确诊，一次检测，终身受益。
[0021] 这一切都揭示了基因诊断在临床上有巨大的应用前景。
[0022] 近年，大规模 DNA 平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform)已经发展为主流的测序技术，这项测序技术的出现不仅令DNA测序费用降到了 以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的"特权"能够被众多研究 人员分享。
[0023] 但是直接使用大规模DNA平行测序平台检测的成本目前仍然令个人难以承受。本 发明可以同时把多个甚至几十病人的Liddle' s相关基因精确的选择性捕获，然后用于大 规模测序平台，可以极大地降低基因诊断的成本，使之广泛应用于临床成为可能。
【发明内容】
[0024] 本发明的目的是，提供一种检验Liddle' s相关基因突变的目标捕获再测序的试 剂盒。该试剂盒提高了基因捕获的通量和基因平行测序的通量，操作简便、成本低。
[0025] 为实现上述目的，本发明采用捕获目的SCNN1B、SCNN1G基因全部外显子片段以 及邻近50bp的非编码区的探针；用于扩增待测片段的通用引物；测序接头序列；缓冲液； dNTP ;高保真聚合酶；链霉素磁珠。本发明采用的技术方案是：一种新的目标捕获再测序方 法，包括以下步骤：
[0026] A.设计并制备用于捕获Liddle's相关基因突变的探针。并将这些探针结合在磁 珠、薄膜或者玻片上。探针序列见序列表。
[0027] B.将待测基因 DNA样品分别片段化至200-400bp，然后将末端补平，加入的ATP使 片段两端引入粘性末端。
[0028] C.分别加入Illumina公司Nextera? DNA Sample Prep Kit中设计好的一端带有 标签序列的接头序列片段，加入连接酶，使每个片段都与的一对接头连接，形成新的片段。
[0029] D.调节反应温度激活DNA聚合酶，用一对Illumina公司Nextera? Index Kit-PCR primers通用引物，对步骤c所得不同基因组完成连接的片段序列混合后进行PCR 扩增反应；
[0030] E.将步骤d所得全部样品的PCR扩增反应产物与步骤a所设计的捕获探针杂交， 然后经过多次洗脱纯化反应，得到待测片段。
[0031] F.将待测片段通过illumina公司Miseq测序仪的标准方案进行大规模平行测序。
[0032] G.将得到的测序结果同标准数据库进行比较，得到诊断结果。
[0033] 为实现上述技术方案，步骤A所述的捕获探针是脱氧核糖核酸（DNA)，或是核糖核 酸（RNA)组成，但不仅限于DNA和RNA。探针为120bp的与目标互补的片段组成。探针可以 是结合在磁珠上的，也可以结合在载玻片上，但不仅限于这些介质。链霉素磁珠材质是铝镍 钴系永磁合金或是钡铁氧体、钕铁硼永磁材料、钕铁硼永磁材料、橡胶磁，但不仅限于这些 材质。
[0034] 其中，步骤A所述的捕获探针，包括覆盖以下基因 SCNN1B和SCNN1G全部编码外显 子片段和两端50bp范围内的序列。这些探针以叠瓦式设计，片段长度为50bp-180bp，最优 为75bp ;片段长度为60bp-200bp，最优为80bp ;片段长度为65bp-220bp，最优为85bp ;片段 长度为70bp-240bp，最优为90bp ;探针之间重叠部分为5-20bp，最优为8bp ;目标区碱基的 探针覆盖度为IX至10X，最优为3X。
[0035] 本发明的主要优点在于：
[0036] 1.本发明可以在一次测序反应中同时进行多个不同来源样本全部Liddle's相关 基因的检测；全部序列直接测出，准确率可以达到99. 99%。
[0037] 2.本发明的试剂盒可以一次完成1-48个样品的平行捕获，提高了捕获效率，极大 地降低了样品准备的成本。
[0038] 3.本发明的试剂盒可以一次完成1-1152个样品的全部Liddle' s相关基因，近 4000条序列的平行检测，充分利用设备的高通量特性，极大降低了每个样品的测序成本。
[0039] 4.本发明的试剂盒可以一次反应同时分辨错义、插入和缺失突变。大大增加了临 床检出率和准确性。
[0040] 5.本发明的检测方法步骤简单，减少重复操作的环节，因而避免了复杂操作过程 中存在的诸多不确定引物，提高了检测准确率和稳定性。
[0041] 6.本发明所提供的检测方法所需时间大大少于sanger法的测序技术.
[0042] 实例：在完成同样的检测量（100人份的检测量），sanger法需要2个人工同时工 作一周。我们的方法只需要一个人在一天内完成全部的检测量。
[0043] 7.检测的准确度大大优于基因芯片技术，更符合临床检测要求。基因芯片只能检 测碱基错义突变，而插入和缺失突变无法同时检测。我们的方法可以同时检测错义、插入、 缺失和可变剪切的基因突变。 【专利附图】
【附图说明】
[0044] 图示为目标区域序列和探针。
[0045]
[0046]
[0047]
[0048]
[0049] 【具体实施方式】
[0050] 下面用实施例仅是对本发明实际应用的举例描述，本发明的实际应用不仅限于以 下实施例：
[0051] 实施例一、
[0052] -、探针设计：
[0053] 按表合成链霉素标记的探针。探针溶液采用agilent公司的SureSelect缓冲系 统体系。
[0054] 二、基因组提取：
[0055] 采用 Qiagen FlexiGene DNA Kit (Code No :51204)进行提取待测 96 份样本的基 因组， 〇〇26〇/280 值达到1. 8-2. 0,各取l-3g做为起始模板。
[0056] 三、测序前样品制备
[0057] 1.目的基因片段化：
[0058] 取定量过的270份基因组DNA，稀释至20-35ng/L。取130L，用超声破碎仪分别进 行片段化。
[0059] 2. AMpure XP 片段化选择
[〇〇6〇] 1.取96孔板，加入80-100L磁珠后，再加入样品DNA，移液器反复吹打混匀；
[0061] 2.混合液 26°C 放置 5min ;
[0062] 3.将96孔板静置在磁板上3min ;
[0063] 4.小心移取全部上清至新的孔中，小心不要碰到磁环；
[0064] 5.再在移至新孔的上清中加入100-150L磁珠，移液器反复吹打，充分混匀；
[0065] 6.混合液 26°C 放置 5min ;
[0066] 7.将96孔板静置在磁板上3min，小心移去上清；
[0067] 8.加入70 %乙醇200L，静置30s，小心移去上清；
[0068] 9.重复步骤8操作一次；
[0069] 10.将96孔板从磁板上取下，敞口放置，使乙醇充分挥发；
[0070] 11.加入40L10mM pH = 8. OTris-HCl，移液器反复吹打混匀；
[0071] 12.将96孔板静置在磁板上lmin，至溶液变清；
[0072] 13.小心移取上清至新的PCR管内，得到纯化后的基因组DNA。
[0073] 3.末端平齐和纯化
[0074] 1.取96孔板，按下表所示，在冰盒上加入各种试剂，保持冰浴状态。
[0075]
【权利要求】
1. 一种检测Liddle' S综合征相关基因突变的试剂盒，其包括：捕获目的SCNN1B、 SCNN1G基因全部外显子片段以及邻近50bp的非编码区的探针；用于扩增待测片段的通用 引物；测序接头序列；缓冲液；dNTP ;高保真聚合酶；链霉素磁珠。
2. 根据权利要求1所述"一种检测Liddle' s综合征相关基因突变的试剂盒"，全部探 针在3'采用生物素修饰。
3. 根据权利要求1所述"一种检测Liddle' s综合征相关基因突变的试剂盒"这种探 针是寡聚核糖核酸（RNA)，或寡聚脱氧核糖核酸（DNA)，但是不仅限于RNA和DNA，可以包括 生物素、荧光或者同位素等修饰后的DNA或者RNA。
4. 根据权利要求1所述"一种检测Liddle' s综合征相关基因突变的试剂盒"的探针 是结合在磁珠上的，或结合在载玻片上，但不仅限于这些介质。
5. 根据权利要求1所述"一种检测Liddle' s综合征相关基因突变的试剂盒"的探针 针对目标区域以高密度叠瓦式设计，探针序列与SCNN1B、SCNN1G为互补序列。
6. 根据权利要求1所述"一种检测Liddle' s综合征相关基因突变的试剂盒"探针长 度在50-180bp，最优为75bp。
7. 根据权利要求1所述"一种检测Liddle' s综合征相关基因突变的试剂盒"探针长 度在60-200bp，最优为80bp。
8. 根据权利要求1所述"一种检测Liddle' s综合征相关基因突变的试剂盒"探针长 度在65-2200bp，最优为85bp。
9. 根据权利要求1所述"一种检测Liddle' s综合征相关基因突变的试剂盒"探针长 度在70-240bp，最优为90bp。
10. 根据权利要求1所述"一种检测Liddle' s综合征相关基因突变的试剂盒"探针重 叠部分适宜范围为5bp-20bp，最优为8bp。
11. 根据权利要求1所述"一种检测Liddle' s综合征相关基因突变的试剂盒"链霉素 磁珠材质是铝镍钴系永磁合金或是钡铁氧体、钕铁硼永磁材料、钕铁硼永磁材料、橡胶磁， 但不仅限于这些材质。
【文档编号】C12Q1/68GK104087657SQ201410209085
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年5月19日 优先权日:2014年5月19日
【发明者】刘哲 申请人:百世诺（北京）医疗科技有限公司