专利名称：桑蚕微粒子病检验试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种桑蚕微粒子病(胁)检验试剂盒及其使用方法。
背景技术：
桑蚕微粒子病是一种毁灭性的疫病，是由桑蚕微孢子虫(Nosema bombycis, Nb)引起的。历史上法国、意大利等国曾因该病的发生、流行，几乎导致养蚕业毁灭。目前的显微镜检验主要是针对母蛾而不是生产的产品蚕种(蚕卵)进行的，母蛾检验的结果有时不完全代表蚕种的真实情况。因此准确、快速地检测桑蚕微粒子病(M )具有十分重要的意义。目前对桑蚕微粒子病检测方法主要采用以病原孢子分离鉴定、显微镜镜检以形态学鉴定为主的国家标准(GB/T20395 — 2006)。其他各种检测研究包括电镜检查、分子生物学技术、血清学技术等都取得了较大进步，并获得使用者的认可。其中病原核酸检测在快速性、安全性、准确性和灵敏性等方面都有很大的提高，这些新技术试图突破传统的形态镜检检测旧模式，而直接用样品对其基因及基因产物进行快速检测，并且与分子生物学技术及生物信息学手段相结合，向准确、快速、灵敏和自动化的方向发展，避免了传统镜检过程中出现的漏检、错检、误检的情况，同时可以节约时间和物力。这些方法虽然有各自的优点但是都存在着一定的缺陷。电镜检查必须经过超薄切片、电镜观察，对技术设备和操作人员的技术要求较高，目前主要用于科研，尚不能实用地进行诊断鉴别。血清学检测技术快速简便成本低廉，但目前发现的桑蚕微粒子孢子因共同抗原的存在易出现一定的交叉反应，特异性较差。而聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。总之，这些方法虽然有各自的优点但是都存在着一定的缺陷，很难在基层生产上推广。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中等温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术(LAMP)具有很多的优越性，此外，2010年4月以来尚未发现应用环介导等温扩增技术检测桑蚕微粒子病的基因快速检验试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种检测效果更全面、特异性高、准确度高、漏检率低的桑蚕微粒子病、m检验试剂盒。本发明的目的可以通过以下技术措施实现一种桑蚕微粒子病Λ(力孢子检验试剂盒，所述的桑蚕微粒子病况力孢子检验试剂盒包括以桑蚕微粒子病况力孢子为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物外引物F3/B3和内引物FIP/BIP。与NCBI网站nt数据库的BLAST比对结果显示，除桑蚕微粒子病Λ b孢子外，无其它物种带有该靶基因。
作为本发明桑蚕微粒子病(Λ20检验试剂盒的优选实施方式，所述的两对引物为外引物 F3 (1) :(SEQ ID NO 1)
CAGGAGTTGCTTTTGCGA
外引物 B3 (1) :(SEQ ID NO 2)
AAACGGATTCAGCAGGTA
内引物 FIP (1) :(SEQ ID NO 3)
GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGttttTGTGCCATTGAATGTCAGA
内引物 BIP (1) :(SEQ ID NO 4)
CTGCGCTACCAGCGTTGTTAttttATATCACCATCGGTGGAAG
或
外引物 F3 (2) :(SEQ ID NO 5)
CTTTGAGCAGCGCTTTCA
外引物 B3 (2) :(SEQ ID NO 6)
GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT
内引物 FIP (2) :(SEQ ID NO 7)
GCATACGTAGACGATGCAGGCttttCAGCTTTAGCTGCGCTAC
内引物 BIP (2) :(SEQ ID NO 8)
GGCTTCCACCGATGGTGATAttttACACCACAAAAGATGGTACTG
或
外引物 F3 (3) :(SEQ ID NO 1)
CAGGAGTTGCTTTTGCGA
外引物 B3 (3) :(SEQ ID NO 2)
AAACGGATTCAGCAGGTA
内引物 FIP (3) :(SEQ ID NO 9)
GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGTGTGCCATTGAATGTCAGA
内引物 BIP (3) :(SEQ ID NO 10)
CTGCGCTACCAGCGTTGTTAATATCACCATCGGTGGAAG
或
外引物 F3 (4) :(SEQ ID NO 5)
CTTTGAGCAGCGCTTTCA
外引物 B3 (4) :(SEQ ID NO 6)
GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT
内引物 FIP (4) :(SEQ ID NO 11)
GCATACGTAGACGATGCAGGCCAGCTTTAGCTGCGCTAC
内引物 BIP (4) :(SEQ ID NO 12)
GGCTTCCACCGATGGTGATAACACCACAAAAGATGGTACTG。作为本发明桑蚕微粒子病(Λ20检验试剂盒的优选实施方式，所述的桑蚕微粒子病 (.Nb)检验试剂盒还包括样品预处理液、feiDNA聚合酶、反应液、稳定液、显色液和阳性对照样本。
7
作为本发明桑蚕微粒子病(Λ20检验试剂盒的更优选实施方式，
所述的样品预处理液10 20 mmol/L pH 8. 0的Tris- HClU 2 mmol/L EDTA和 1 1. 2 体积 % Triton X-100 ；
所述的fei DNA聚合酶酶浓度4-10 U/ μ L ；
所述的反应液1. 6 2mmol/L dNTP、20 25mmol/L Tris-HCl、10 12. 5mmol/L KCl, 10 12. 5mmol/L (NH4)2SO4,8 10mmol/L MgSO4 ·7Η20、0· 1 0. 125 体积％ TritonX-100、 0.8 lmol/L甜菜碱；
所述的显色液为SYBR Green I或Eva Green ； 所述稳定液为石蜡油；
所述的阳性对照为桑蚕微粒子病胁孢子靶基因组DNA ；
所述的内引物FIP/BIP各为0. 2 0. 25 μ mol/L,外引物F3/B3的浓度各为1. 2 2. 0 μ mol/L。作为本发明桑蚕微粒子病(Λ20检验试剂盒的最优选实施方式， 所述的fei DNA聚合酶酶浓度8 U/ μ L ；
所述的反应液2mmol/L dNTP、25mmol/L Tris-HCl、12. 5mmol/L KC1、12. 5mmol/L (NH4) 2S04、10mmol/L MgSO4 · 7H20、0. 125 体积 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜碱；
所述的样品预处理液20 mmol/L pH 8.0的Tris- HCl,2 mmol/L EDTA和1.2体积％ Triton X-100 ；
所述的显色液为STOR Green I ；
所述的内引物FIP/BIP的浓度为0. 2 μ mol/L ；
所述的外引物F3/B3的浓度为1.6 μ mol/L。作为本发明桑蚕微粒子病(胁)检验试剂盒的优选实施方式，所述的桑蚕微粒子病(胁)检验试剂盒还包括反应管，所述的反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。所述的反应管引用专利CN 200910213987. 4一一种用于环介导等温扩增技术的反应管及其使用方法。作为本发明桑蚕微粒子病(胁)检验试剂盒的更优选实施方式，所述的A、B两个空腔中分别装有工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由稳定液封存，所述工作液为反应液和fei DNA聚合酶的混合而成。本发明还提供一种桑蚕微粒子病(胁)检验试剂盒的使用方法，该方法包括如下步骤
(1)根据国家标准《家蚕一代杂交种检验规程》GB/T20395-2006的要求，取得桑蚕微孢子病Λ力孢子作为待测试样，将待测试样50 μ L注入1. 5mL无菌离心管中；
(2)在步骤(1)的离心管加入样品预处理液100μ L，混合均勻，沸水浴15min灭活后冰浴上冷却，高速离心，上清即为样品模板DNA ；
(3)在反应容器中加入feiDNA聚合酶0. 9 1. 8体积份数、反应液38 40体积份数、 稳定液52 54. 5体积份数、样品模板DNA 4. 5、体积份数、内引物FIP/BIP各2体积份数、 外引物F3/B3各4体积份数，混合均勻，恒温反应；
(4)在上述反应容器和阳性对照管中分别加入显色液，混勻，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性；所述步骤(3)中的外引物F3/B3和内引物FIP/BIP为以桑蚕微粒子病Λ力孢子为靶基
因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物。 作为本发明使用桑蚕微粒子病(Λ20检验试剂盒的方法的优选实施方式，所述的两
对引物为
外引物 F3 (1) :(SEQ ID NO 1)
CAGGAGTTGCTTTTGCGA
外引物 B3 (1) :(SEQ ID NO 2)
AAACGGATTCAGCAGGTA
内引物 FIP (1) :(SEQ ID NO 3)
GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGttttTGTGCCATTGAATGTCAGA
内引物 BIP (1) :(SEQ ID NO 4)
CTGCGCTACCAGCGTTGTTAttttATATCACCATCGGTGGAAG
或
外引物 F3 (2) :(SEQ ID NO 5)
CTTTGAGCAGCGCTTTCA
外引物 B3 (2) :(SEQ ID NO 6)
GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT
内引物 FIP (2) :(SEQ ID NO 7)
GCATACGTAGACGATGCAGGCttttCAGCTTTAGCTGCGCTAC
内引物 BIP (2) :(SEQ ID NO 8)
GGCTTCCACCGATGGTGATAttttACACCACAAAAGATGGTACTG
或
外引物 F3 (3) :(SEQ ID NO 1)
CAGGAGTTGCTTTTGCGA
外引物 B3 (3) :(SEQ ID NO 2)
AAACGGATTCAGCAGGTA
内引物 FIP (3) :(SEQ ID NO 9)
GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGTGTGCCATTGAATGTCAGA
内引物 BIP (3) :(SEQ ID NO 10)
CTGCGCTACCAGCGTTGTTAATATCACCATCGGTGGAAG
或
外引物 F3 (4) :(SEQ ID NO 5)
CTTTGAGCAGCGCTTTCA
外引物 B3 (4) :(SEQ ID NO 6)
GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT
内引物 FIP (4) :(SEQ ID NO 11)
GCATACGTAGACGATGCAGGCCAGCTTTAGCTGCGCTAC
内引物 BIP (4) :(SEQ ID NO 12)
GGCTTCCACCGATGGTGATAACACCACAAAAGATGGTACTG。
作为本发明使用桑蚕微粒子病(Λ20检验试剂盒的方法的优选实施方式，步骤(3) 中，恒温反应的反应条件为温度63士2°C，反应时间45 90min。本发明的桑蚕微粒子病(胁)检验试剂盒能对桑园害虫及与桑蚕近缘的昆虫，包括柞蚕、桑毛虫、菜粉蝶等的微孢子虫进行识别。解决显微镜检验方式根据微孢子虫形态难于识别的困难，避免误诊，以提高检验的准确性；同时适用于《桑蚕原种检验规程》GB/ T19178-2003的桑蚕原种母娥微孢子检验。本发明所说的基于环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication of DNA,简称LAMP)快速检测桑蚕微粒子病(胁)的方法，是利用feiDNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成， 结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP 反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(63 65°C)条件下 45 90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。目前国家标准中采用以病原孢子分离鉴定、形态学显微镜镜检鉴定为主的通行方法，初步鉴定需1 2 天，且误诊、错检率高；采用本发明的检测试剂盒仅需2小时，且可连续操作。并且，本发明的反应体系中加入了显色液，鉴定结果更为直观清晰、准确。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.本发明的检测试剂盒只需一个恒定温度设备就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性；3.本发明的检测试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率高；4.本发明的检测试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；5.本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠；6.由于选择了高保守性的籍M^f度作为靶基因设计引物，使得本发明的检测试剂盒检测桑蚕微粒子病(Λ20的准确率更高；7.在本发明检测试剂盒中采用特制的反应管，减少了气溶胶污染的可能性，同时方便操作。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。下列缩略语适用于本发明
LAMP loop-mediated isothermal amplification,环介导恒温扩增 dNTP :deoxyribonucleoside triphosphate,脱氧核苷三憐酸
10Bst Sl :Bst DNA polymerase (large fragment) ,fei DNA 聚合酶(大片段) EDTA :ethylenediamine tetraacetic acid,乙二胺四乙酸 DNA deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸 Betaine 舌甘菜碱
Triton X-100 聚乙二醇辛基苯基醚实施例1试剂盒的制备
1、按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物 外引物 F3 (1) :(SEQ ID NO 1) CAGGAGTTGCTTTTGCGA
外引物 B3 (1) :(SEQ ID NO 2)
AAACGGATTCAGCAGGTA
内引物 FIP (1) :(SEQ ID NO 3)
GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGttttTGTGCCATTGAATGTCAGA
内引物 BIP (1) :(SEQ ID NO 4)
CTGCGCTACCAGCGTTGTTAttttATATCACCATCGGTGGAAG。
2、购置DNA聚合酶-.BstDNA聚合酶置于容器；
3、配制反应液和引物反应液含有2mmol/LdNTP、25mmol/LTris_Cl、12. 5mmol/L KC1、 12. 5mmol/L (NH4) 2S04、lOmmol/L MgSO4 · 7H20、0. 125 体积 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜碱、 内引物FIP/BIP各0· 2 μ mol/L和外引物F3/B3各0. 25 μ mol/L,置于容器；
4、配制样品预处理液样品预处理液含有20mmol/L Tris- HCl (pH 8.0),2 mmol/L EDTA和1. 2体积％ Triton X-100,置于容器；
5、购置稳定液石蜡油，置于容器；
6、购置显色液STORGreenI，置于容器；
7、提取阳性对照提取桑蚕微粒子病胁孢子基因组DNA，置于容器；
8、将上述7个容器装成试剂盒，封装。制备工艺简述如下
(1)将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；
(2)将上述2、步骤配制的液体无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；
(3)将稳定液分装，抽样质检；
(4)将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；
(5)组装试剂盒。在本发明桑蚕微粒子病、Nb )检验试剂盒的其他实施例中，所采用的引物还可以是外引物 F3 (3) :(SEQ ID NO 1)
CAGGAGTTGCTTTTGCGA
外引物 B3 (3) :(SEQ ID NO 2)
AAACGGATTCAGCAGGTA
内引物 FIP (3) :(SEQ ID NO 9)
GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGTGTGCCATTGAATGTCAGA
内引物 BIP (3) :(SEQ ID NO 10)CTGCGCTACCAGCGTTGTTAATATCACCATCGGTGGAAG。实施例2试剂盒的制备
1、按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物 外引物 F3 (2) :(SEQ ID NO 5) CTTTGAGCAGCGCTTTCA
外引物 B3 (2) :(SEQ ID NO 6)
GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT
内引物 FIP (2) :(SEQ ID NO 7)
GCATACGTAGACGATGCAGGCttttCAGCTTTAGCTGCGCTAC
内引物 BIP (2) :(SEQ ID NO 8)
GGCTTCCACCGATGGTGATAttttACACCACAAAAGATGGTACTG。
2、购置DNA聚合酶-.BstDNA聚合酶置于容器；
3、配制反应液和引物反应液含有1. 6mmol/LdNTP、20mmol/L Tris-ClU0mmol/L KC1、 1 Ommo 1 /L(NH4)2SO4,8mmo 1 /L MgS04、0. 1 体积％ TritonX_100、0. 8mol/L甜菜碱、内引物FIP/ BIP各0. 25ymol/L和外引物F3/B3各1. 2 μ mol/L，置于容器；
4、配制样品预处理液样品预处理液含有10mmol/L Tris- HCl (pH 8.0),1 mmol/L EDTA和1. 0体积％ Triton X-100,置于容器；
5、购置稳定液石蜡油，置于容器；
6、购置显色液EVAGreen I，置于容器；
7、提取阳性对照提取桑蚕微粒子病胁孢子基因组DNA，置于容器；
8、将上述7个容器装成试剂盒，封装。其他同实施例1。在本发明桑蚕微粒子病(Μ )检验试剂盒的其他实施例中，所采用的引物还可以是外引物 F3 (4) :(SEQ ID NO 5)
CTTTGAGCAGCGCTTTCA
外引物 B3 (4) :(SEQ ID NO 6)
GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT
内引物 FIP (4) :(SEQ ID NO 11)
GCATACGTAGACGATGCAGGCCAGCTTTAGCTGCGCTAC
内引物 BIP (4) :(SEQ ID NO 12)
GGCTTCCACCGATGGTGATAACACCACAAAAGATGGTACTG。实施例3桑蚕微粒子病(Λ20检验试剂盒的应用 1. 1材料
1. 1. 1孢子
本研究所用孢子有3株，主要来源于华南农业大学，广东省蚕业技术推广中心。详见表1。表1孢子名称及来源
孢子来源孢子及编号华南农业大学家蚕母蛾微孢子/1 生产抽检样品来源于广东省蚕业技术推广中心的生产检验样品JCi
12[1它孢子 I来源于华南农业大学的柞蚕母蛾微孢子 1. 1. 2主要仪器和试剂 1. 2分离孢子的鉴定
临床分离孢子的分离鉴定按要求抽取干燥处理的母蛾进行编号。按每盒母蛾为一集团投蛾。打开蛾盒检查蛾袋情况，若符合条件，则将母蛾全数投入磨蛾杯内；若该盒母蛾未装满，则不予镜检并作记载，再从第二样本中抽补。在磨蛾杯中加注0. 5%碳酸钾(或碳酸钠) 溶液8(T90mL，磨碎后取出(如磨蛾转速为8000r/min，磨蛾时间应补少于90s)。静置^iin 后，将蛾液倒入有过滤材料的漏斗内过滤，禁止用棒搅动，加水校正离心管液量。离心沉淀 3min(3000r/min),倒去上层清液，在沉淀物中加入氢氧化钾溶液lmL。离心管内液体经振荡后，每管取4个样本。按规定将上述4个样本制2个镜片标本，用600倍以上显微镜两人对检，每人检两个样本，每个样本观察不少于5个视野，若对检结果不一致，应复检确认。将镜检结果准确填入镜检单。1. 3样品处理(模板DNA提取)
1. 3. 1取50 μ L分离纯化的胁孢子样品于1. 5mL无菌离心管中； 1. 3. 2在上述孢子沉淀中加入100 μ L样品预处理液混合均勻，沸水中煮20分钟后立即置于冰浴上冷却10分钟，3000rpm离心2分钟，上清即为样品模板DNA。1. 4环介导等温扩增技术的反应过程
1. 4. 1在200 μ L反应管配制反应体系反应液22 μ UBst DNA聚合酶0. 5 μ L (4U)， 稳定液30 μ L，模板DNA 2. 5 μ L。1.4.2将配制好的反应管于65°C恒温反应lh。(在本发明的其他实施例中，反应体系可为feiDNA聚合酶0. 9 1. 8体积份数、 反应液38 40体积份数、稳定液52 54. 5体积份数、样品模板DNA 4. 5、体积份数、内引物FIP/BIP各2体积份数、外引物F3/B3各4体积份数。恒温反应的反应条件可为温度 63 士 2°C，反应时间 45 90min。)
1.5反应后处理
向上述反应产物中加入2 μ LSYBR Green I，混勻，同时也向阳性对照管(家蚕母蛾微孢子DNA)和阴性对照管(ddH20)中加入STOR Green I混勻，若反应管与阳性对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管与阴性对照管一样显现橙色则为阴性。1. 6特异性试验
1.6.1纯孢子LAMP检测用LAMP方法对2株微孢子核酸进行扩增，根据显色反应观察结果，绿色为阳性，橙色阴性，验证方法特异性。1.6.2几种孢子混合DNA检测用LAMP对家蚕胁微孢子及柞蚕微孢子DNA核酸， 取2μ L作LAMP检测。1. 7灵敏度试验将分离纯化的家蚕微粒子胁孢子，提纯纯化至IO8孢子数/mL， 用去离子水10倍梯度稀释至10_8，按1. 3样品处理方法处理提取DNA模板。1. 8重复性试验特异性试验和灵敏度试验分别重复2次。结果
2.1織Nb微孢子LAMP检测方法的建立
2.2特异性试验家蚕胁微孢子检测结果阳性，柞蚕母蛾微孢子、为阴性。结果显示
13试剂盒具有高特异性。2. 3灵敏度试验孢子原液浓度为IO8孢子数/mL，LAMP方法可检测到第2个稀释度，即为IO6孢子数/mL。2. 4重复性试验特异性试验重复两次，结果一致。灵敏度试验重复两次，数量级一致。实施例4采用反应管的桑蚕微粒子病(胁)检验试剂盒
本实施例的桑蚕微粒子病(Λ20检验试剂盒，采用的试剂和引物与实施例1相同，试剂盒还包括反应管，所述的反应管引用专利CN 200910213987. 4一一种用于环介导等温扩增技术的反应管及其使用方法，反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板，其中空腔A内装有22. 0 μ L的LAMP反应液和 0. 5 μ L的 DNA聚合酶，液体上层由石蜡封存；空腔B内装有2. 0 μ L的LAMP反应显色液，液体上层也由石蜡封存，将该反应管-20°C保存。本实施例采用反应管作为容器，对桑蚕微粒子病胁孢子进行LAMP检测，同时设有阳性对照组和阴性对照组，具体包括如下步骤
取上述制备的反应管三支，采用移液枪分别加入阴性对照样品、待检测样品和阳性对照样品各2. 5 μ L，加样时枪头穿透保护液层，样品加至反应管A腔内，盖紧管盖并做好标记，移至反应区。将上述反应管均于65°C恒温反应Ih。反应结束，将反应管倒置甩动1次，再正置甩动1次，使工作液与显色液充分混合均勻后观察。若反应管与阳性对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管与阴性对照管一样显现橙色则为阴性。在LAMP反应过程中，显色液与工作液密封状态好，没有发生互相泄露的情况，后期显色反应时，倒置甩动操作使得显色液和工作液混合，显色结果清晰。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
1权利要求
1.一种桑蚕微粒子病检验试剂盒，其特征在于，所述的桑蚕微粒子病检验试剂盒包括以桑蚕微粒子病胁孢子为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物外引物F3/ B3和内引物FIP/BIP。
2.根据权利要求1所述的桑蚕微粒子病检验试剂盒，其特征在于，所述的两对引物为外引物F3 (1)CAGGAGTTGCTTTTGCGA 外引物B3 (1) AAACGGATTCAGCAGGTA 内引物FIP (1)GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGttttTGTGCCATTGAATGTCAGA 内引物BIP (1)CTGCGCTACCAGCGTTGTTAttttATATCACCATCGGTGGAAG 或外引物F3 (2) CTTTGAGCAGCGCTTTCA 外引物B3 (2) GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT 内引物FIP (2)GCATACGTAGACGATGCAGGCttttCAGCTTTAGCTGCGCTAC 内引物BIP (2)GGCTTCCACCGATGGTGATAttttACACCACAAAAGATGGTACTG 或外引物F3 (3) CAGGAGTTGCTTTTGCGA 外引物B3 (3) AAACGGATTCAGCAGGTA 内引物FIP (3)GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGTGTGCCATTGAATGTCAGA 内引物BIP (3)CTGCGCTACCAGCGTTGTTAATATCACCATCGGTGGAAG 或外引物F3 (4) CTTTGAGCAGCGCTTTCA 外引物B3 (4) GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT 内引物FIP (4)GCATACGTAGACGATGCAGGCCAGCTTTAGCTGCGCTAC 内引物BIP (4)GGCTTCCACCGATGGTGATAACACCACAAAAGATGGTACTG。
3.根据权利要求1所述的桑蚕微粒子病检验试剂盒，其特征在于，所述的桑蚕微粒子病检验试剂盒还包括样品预处理液、fei DNA聚合酶、反应液、稳定液、显色液和阳性对照样本。
4.根据权利要求3所述的桑蚕微粒子病检验试剂盒，其特征在于，所述的样品预处理液10 20 mmol/L pH 8. 0的Tris- HClU 2 mmol/L EDTA和 1 1. 2 体积 % Triton X-100 ；所述的fei DNA聚合酶酶浓度4-10 U/ μ L ；所述的反应液1. 6 2mmol/L dNTP、20 25mmol/L Tris-HCl、10 12. 5mmol/L KCl, 10 12. 5mmol/L (NH4)2SO4,8 10mmol/L MgSO4 ·7Η20、0· 1 0. 125 体积％ TritonX-100、 0.8 lmol/L甜菜碱；所述的显色液为 STOR Green I 或 Eva Green, 1000 X , 2 μ L ； 所述稳定液为石蜡油；所述的阳性对照为桑蚕微粒子病况力孢子基因组DNA ；所述的内引物FIP/BIP各为0. 2 0. 25 μ mol/L,外引物F3/B3的浓度各为1. 2 2. 0 μ mol/L。
5.根据权利要求4所述的桑蚕微粒子病检验试剂盒，其特征在于，所述的样品预处理液20 mmol/L pH 8.0的Tris- HCl,2 mmol/L EDTA和1.2体积％ Triton X-100 ；所述的fei DNA聚合酶酶浓度8 U/ μ L ；所述的反应液2mmol/L dNTP、25mmol/L Tris-HCl、12. 5mmol/L KC1、12. 5mmol/L (NH4) 2S04、10mmol/L MgSO4 · 7H20、0. 125 体积 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜碱； 所述的显色液为STOR Green I,1000X,2yL； 所述的内引物FIP/BIP的浓度为0. 2 μ mol/L ； 所述的外引物F3/B3的浓度为1.6 μ mol/L。
6.根据权利要求3、4或5所述的桑蚕微粒子病检验试剂盒，其特征在于，所述的桑蚕微粒子病检验试剂盒还包括反应管，所述的反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。
7.根据权利要求6所述的桑蚕微粒子病检验试剂盒，其特征在于，所述的A、B两个空腔中分别装有工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由稳定液封存，所述工作液为反应液和fei DNA聚合酶的混合而成。
8.一种使用如权利要求3所述的桑蚕微粒子病检验试剂盒的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(1)取待测试样50μ L注入1.5mL无菌离心管中；(2)在步骤(1)的离心管加入样品预处理液100μ L，混合均勻，沸水浴15min灭活后冰浴上冷却，高速离心，上清即为样品模板DNA ；(3)在反应容器中加入feiDNA聚合酶0. 9 1. 8体积份数、反应液38 40体积份数、 稳定液5(Γ55体积份数、样品模板DNA 5、体积份数、内引物FIP/BIP各2体积份数、外引物F3/B3各4体积份数，恒温反应；(4)在上述反应容器和阳性对照样本中分别加入显色液，混勻，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性；所述步骤(3)中的外引物F3/B3和内引物FIP/BIP为以桑蚕微粒子病Λ(力靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物。
9.根据权利要求8所述的使用桑蚕微粒子病检验试剂盒的方法，其特征在于，所述的两对引物为外引物F3 (1) CAGGAGTTGCTTTTGCGA 外引物Β3 (1) AAACGGATTCAGCAGGTA 内引物FIP (1)GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGttttTGTGCCATTGAATGTCAGA 内引物BIP (1)CTGCGCTACCAGCGTTGTTAttttATATCACCATCGGTGGAAG 或外引物F3 (2) CTTTGAGCAGCGCTTTCA 外引物B3 (2) GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT 内引物FIP (2)GCATACGTAGACGATGCAGGCttttCAGCTTTAGCTGCGCTAC 内引物BIP (2)GGCTTCCACCGATGGTGATAttttACACCACAAAAGATGGTACTG 或外引物F3 (3) CAGGAGTTGCTTTTGCGA 外引物B3 (3) AAACGGATTCAGCAGGTA 内引物FIP (3)GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGTGTGCCATTGAATGTCAGA 内引物BIP (3)CTGCGCTACCAGCGTTGTTAATATCACCATCGGTGGAAG 或外引物F3 (4) CTTTGAGCAGCGCTTTCA 外引物B3 (4) GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT 内引物FIP (4)GCATACGTAGACGATGCAGGCCAGCTTTAGCTGCGCTAC 内引物BIP (4)GGCTTCCACCGATGGTGATAACACCACAAAAGATGGTACTG。
10.根据权利要求8或9所述的使用桑蚕微粒子病检验试剂盒的方法，其特征在于， 步骤(3)中，恒温反应的反应条件为温度63士2°C，反应时间45 90min。
全文摘要
本发明提供一种桑蚕微粒子病检验试剂盒，所述的桑蚕微粒子病(Nb)检验试剂盒包括以桑蚕微粒子病孢子为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物外引物F3/B3和内引物FIP/BIP。本发明的桑蚕微粒子病检验试剂盒检测效果更全面、漏检率低，可代替传统的显微镜检测技术。
文档编号C12Q1/68GK102154517SQ201110071349
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月24日 优先权日2011年3月24日
发明者余爱群, 冯雪梅, 曹以诚, 杜正平, 王先燕, 胡智明, 邱国祥, 陈洵, 黄自然 申请人:华南农业大学, 广东省蚕业技术推广中心, 广州华峰生物科技有限公司