专利名称：通过敲除<i>abrB</i>基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法
技术领域：
本发明涉及通过敲除abrB基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
枯草芽孢杆菌OfeCiBm ·5油^Vi1S)是目前公认的安全微生物之一，其抗菌代谢产物丰富多样，尤其是脂肽类抗菌物质，不仅抗菌谱广而且还具有生物表面活性剂的功能，因此不仅可以在农业上用于进行生物防治，而且在工业和环境保护上也有着广泛的应用。枯草芽孢杆菌(feci/^Assubtil is) ATCC 9943 是一种可以分泌 surfactin， fengycin等抗菌月太物质的枯草芽孢杆菌(Val6rie Leclere, Romain Marti, Max Bechet. The lipopeptides mycosubtilin and surfactin enhance spreading of Bacillus subtilis strains by their surface-active properties. Arch Microbiol. (2006) 186: 475-483)。其中，surfactin作为一种生物表面活性剂，与化学表面活性剂相比，其具有拥有生物降解能力，低毒，结构丰富的优点，随着对工业原料的环境适应性要求的提高， 其应用于环境保护，石油开采方面潜力将会越来越大。但实际中，其并未在工业以及环境保护中广泛应用，究其原因，是因为它生产成本巨大，所以提高其产量便成为降低其生产成本的核心问题。目前，世界范围内，提高其产量的方法主要是筛选优良菌株，以及优化发酵条件， 而很少采用分子生物学技术对菌种进行改良的方法来提高其产抗菌物质的产量。但随着对抗菌肽合成分泌研究的日益深入，已经逐渐开始采用分子生物学技术，通过改造其合成分泌中信号通路等方法来对原始菌种进行基因改良，从而提高其自身合成分泌抗菌肽能力。afo资基因(Gene ID: 937009)，作为枯草芽孢杆菌中的一种调控蛋白，在枯草芽孢杆菌各种生理代谢过程中发挥着重要的作用，相关研究表明，AbrB蛋白对于抗菌物质的合成具有一定的阻碍作用。本方法首先以枯草芽孢杆菌ATCC 9943为出发菌株，以大肠杆菌克隆载体pGEM_T 为骨架构建一个基因敲除载体pAbrB-Cm，利用同源重组原理，通过双交换过程敲除枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组中afo资基因的方法构建了一个高产抗菌肽菌株FMB 29。发明内容技术问题
本发明的目的是利用分子生物学技术，构建afoW基因敲除载体，经过电转化通过同源重组将枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组中a^ri 基因敲除，从而构建一种高产抗菌肽的枯草芽孢杆菌菌株FMB 29。技术方案
1、通过敲除基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，其特征在于 (1) abrB基因敲除载体pAbrB-Cm的构建
根据枯草芽孢杆菌afo资基因设计引物AbrB5，-F和AbrB5，-R,以枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增部分5，端 基因及其上游基因，获得500bp基因片段；根据枯草芽孢杆菌 基因设计引物AbrB3，-F和AbrB3，-R,以枯草芽孢杆菌ATCC 9943 基因组DNA为模板PCR扩增部分3’端 基因及其下游基因，获得500bp基因片段；根据pHCMC04的DNA设计引物CM-F和CM-R，以pHCMC04质粒为模板PCR扩增包括启动子和终止子的氯霉素抗性基因表达框，获得1500bp基因片段；扩增得到的三个基因分别克隆至 PMD19-T载体，转化大肠杆菌(fecAericAia coli) DH5a,经验证、测序正确后，分别命名为 VabrB5' -Τ、x>abrB3' -Τ、pCM- ,于 _20°C条件下保存备用；
权利要求
1.通过敲除a^ri 基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，其特征在于 (1) abrB基因敲除载体pAbrB-Cm的构建设计引物 AbrB5，-F 和 AbrB5，-R，以枯草芽孢杆菌 UaciBw1S subtil is、KKL 9943 基因组DNA为模板PCR扩增部分5’端 基因及其上游基因，获得500bp基因片段；设计引物AbrB3，-F和AbrB3，-R,以枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增部分3， 端abrB基因及其下游基因，获得500bp基因片段；设计引物CM-F和CM-R，以pHCMC04质粒为模板PCR扩增包括启动子和终止子的氯霉素抗性基因表达框，获得1500bp基因片段；扩增得到的三个基因分别克隆至PMD19-T载体，转化大肠杆菌(Mscherichia coli) DH5a,经验证、测序正确后，分别命名为vabrB5，-Τ、VabrB3' -Τ、pCM- ,于_20°C条件下保存备用； pabrB5 用EcoRI/XbaI双酶切后获得abrB5 "片段，与经过相同双酶切处理的pGEM_T 载体，用T4 DNA连接酶连接，构建pGEM- Ρ载体，酶切验证正确后于_20°C条件下保存VabrB3，-T用XbaI/SphI双酶切后获得abrB3，片段，与经过相同双酶切处理的pGEM-abrB5，mt，用抖DNA连接酶连接，构建pGEM- 载体，酶切验证正确后于_20°C条件下保存备用；ρΟ -Τ用XbaI酶切后获得Oi片段，与经过相同酶切处理的pGEM- 载体，用Τ4 DNA 连接酶连接，构建afo^基因敲除载体pAbrB-Cm，酶切验证正确后，转化大肠杆菌DH5a，用于下一步转化；(2) FMB四突变菌株的构建以枯草芽孢杆菌ATCC 9943制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的a^ri 基因敲除载体PAbrB-Cm转化入枯草芽孢杆菌ATCC 9943，在基因组^力沙位点发生双交换，CM抗性平板上筛选得到氯霉素抗性菌株，命名为FMB 29 ；该菌株的 基因被氯霉素抗性基因所取代，成为缺失了 abrB基因的突变菌株，即为所得到的菌株。
2.权利要求1所述方法获得的敲除afo^基因菌株FMB29。
3.权利要求2所述敲除afoW基因菌株FMB四在生产枯草芽孢杆菌抗菌肽中的应用。
4.权利要求2所述敲除a^ri 基因菌株FMB四生产的枯草芽孢杆菌抗菌肽产品。
全文摘要
本发明涉及通过敲除abrB基因提高枯草杆菌抗菌肽产量的方法，属于生物技术领域。本方法首先以枯草芽孢杆菌ATCC9943为出发菌株，以大肠杆菌克隆载体pGEM-T为骨架构建一个基因敲除载体pAbrB-Cm，利用同源重组原理，通过双交换过程敲除枯草芽孢杆菌ATCC9943基因组abrB基因的方法构建了一个高产抗菌肽菌株FMB29。经过高效液相色谱分析，确定改良菌株产surfactin和fengycin的能力大大提高，并通过质谱鉴定了改良菌体FMB29发酵产物中surfactin和fengycin的存在。
文档编号C12P21/02GK102174558SQ20111007121
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月24日 优先权日2011年3月24日
发明者别小妹, 吕凤霞, 张充, 曹国强, 钟蕾, 陆兆新 申请人:南京农业大学