一种用于肺癌诊断的sall4免疫组织化学检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于肺癌诊断的SALL4免疫组织化学检测试剂盒、使用方法及应 用，属于医学和生物学检测领域。
【背景技术】
[0002] 肺癌是当今全球最常见的恶性肿瘤之一，危害严重并呈上升趋势，是全球发病率 和死亡率增加最快的疾病。肺癌的高病死率主要是由于无法做到早期诊断，因此，肺癌的早 期诊断是及时规范治疗并改善其预后的最有效措施。目前传统的诊断方法依赖于影像学和 纤维支气管镜检查，但是这两种方法具有操作复杂、有辐射副作用及费用高等局限。肿瘤标 志物的发现和合理应用对肿瘤早期发现、早期诊断具有重要意义。
[0003] 肿瘤标志物是肿瘤细胞在癌变过程中由于基因的表达水平的变化而生成或减少 的抗原和其它生物活性物质，可用于肿瘤的早期诊断、分期、监测肿瘤进程和评价药物的治 疗效果。肿瘤标志物会对肿瘤的临床治疗带来巨大的影响，尤其当其能够在临床病症出现 之前被检测到，或者可以用于治疗效果的实时检测时。与传统的诊断手段相比，肿瘤标志物 检测具有简便、费用相对低、没有辐射危害、风险小、病人容易接受等优点。目前，为了满足 肿瘤的临床诊断和治疗的需求，肿瘤标志物的研发亟待加速。
[0004] 目前用于肿瘤早期诊断的肿瘤标志物，大多由于缺乏灵敏度和特异性而不能在实 际检测中广泛应用。例如，对于肝癌，甲胎蛋白和超声波检查是普遍采用的诊断高危病人的 方式，并且确实显著提高了肝癌病人的生存率，但灵敏度比较低；肿瘤抗原CA-125有更高 的灵敏度，但却缺乏特异性。同样地，用于乳腺癌检测的血液肿瘤标志物CA15-3因灵敏度 低，在早期诊断中几乎没用。肿瘤的早期诊断、以及良性和恶性肿瘤的区分仍然是一个临床 难题，需要新的技术和方法来发现新的肿瘤标志物和提高肿瘤标志物检测的灵敏度和可信 度。而针对高发病率和死亡率的肺癌，寻找高敏感性和特异性的标志物，对肺癌的诊断和治 疗具有重大意义，已成为肺癌防治的当务之急。
[0005] SALL4蛋白由人源基因 SALL4编码翻译，其全称为Sal样蛋白4(Sal-like protein 4)，别名锌指蛋白 797 (Zinc finger protein 797)和锌指蛋白 SALL4 (Zinc finger protein SALL4)。SALL4属于Sal C2H2类锌指蛋白家族，包含有C2H2类锌指结构。SALL4 蛋白有两个亚型，即SALL4A和SALL4B，其分子量大小分别为112. 2KD和65. 7KD。SALL4蛋 白主要分布在细胞质和细胞核中。
[0006] SALL4属于锌指转录因子，通过与0CT3/4、S0X2及NANOG相互作用，参与干细胞的 自我更新和维持。SALL4不但在胚胎干细胞中高表达，而且在人造血系统肿瘤中也高表达， 例如急性粒细胞和淋巴细胞白血病。进一步发现SALL4能够上调原癌基因 Bmi-I在人造血 干细胞和白血病细胞中的表达。其它一些研究表明，SALL4可以作为肿瘤标记物，在肺癌和 乳腺癌的诊断中具有较高的应用价值。SALL4 mRNA在肺癌敏感性和特异性分别为85. 1% 和92.9%，93%的肺癌标本541^4 1111^^是癌旁的两倍。关于541^4蛋白在肺癌细胞中的表 达，以及作为一种肺癌标志物进行肺癌诊断的可行性，目前尚无相关报道。
[0007] 目前，在临床上，免疫组织化学染色已经在肿瘤病理诊断中得到了广泛应用，涉 及领域包括肿瘤组织起源的鉴别、未分化恶性肿瘤性质的判定、各种形态系统肿瘤鉴别、确 定肿瘤原发部位等。其原理是用标记的抗体对细胞或组织内的相应的抗原进行定性、定位 或定量检测，经过组织化学的呈色反应而呈现醒目的阳性色彩，再用光学显微镜、荧光显微 镜或电子显微镜观察。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的之一，是提供一种用于肺癌诊断的SALL4免疫组织化学检测试剂盒 及其使用方法，可有效地区分肺癌组织和正常组织，还可为肺癌个体化治疗提供新的诊断 和分类依据。
[0009] 本发明的目的之二，是提供一种用于肺癌诊断的SALL4免疫组织化学检测试剂盒 的应用。
[0010] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种用于肺癌诊断的SALL4免疫组织 化学检测试剂盒，包括如下组分：阳性对照、阴性对照、一抗、二抗、固定剂、脱脂和透明剂、 复水剂、脱水剂、缓冲液A、缓冲液B、抗原修复剂、通透剂、过氧化物酶失活剂、非特异性蛋 白阻断剂、显色液和染色剂。
[0011] 在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0012] 进一步，所述阳性对照为SALL4高表达的精原细胞瘤组织，所述阴性对照为：不含 SALL4抗体的羊血清孵育的肺鳞癌组织。
[0013] 进一步，所述一抗为小鼠来源的抗人SALL4单克隆抗体，所述二抗为生物素标记 的山羊抗小鼠 IgG，所述固定剂为福尔马林，所述脱脂和透明剂为二甲苯，所述复水剂为浓 度为100 % v/v、90 % v/v、80 % v/v、70 % v/v的梯度酒精，所述脱水剂为浓度为70 % v/ v、80% v/v、90% v/v、100% v/v的梯度酒精，所述缓冲液A为ImM PBS(PH7. 4)，所述缓冲 液B为ImM PBST(PH7. 4)，所述抗原修复剂为ImM Tris/EDTA(PH8)，所述通透剂为0. 3% Triton-100,所述过氧化物酶失活剂为3 % v/v的过氧化氢，所述非特异性蛋白阻断剂为 〇. 5%羊血清，所述显色液为DAB，所述染色剂为苏木精。
[0014] 一种用于肺癌诊断的SALL4免疫组织化学检测试剂盒的使用方法，包括如下步 骤：
[0015] (1)取待测样品和阳性对照分别进行福尔马林固定，4°C放置12小时；
[0016] (2)将步骤所得⑴固定标本，进行石蜡包埋，制成4 μπι厚石蜡切片，置于37°C干 燥12小时，得到干燥后的切片；
[0017] (3)脱蜡复水：将步骤⑵所得干燥后的切片，于60°C烘烤2小时，再用脱脂和透 明剂脱蜡5分钟，然后用复水剂复水，每梯度2分钟，再用无菌水冲洗2分钟，得到复水切 片；
[0018] (4)将步骤（3)所得复水切片，加入通透剂，对组织进行通透，室温放置3分钟，移 去通透剂，再用洗涤剂冲洗5分钟，得到通透切片；
[0019] (5)将步骤（4)所得通透切片，用过氧化物酶失活剂浸泡10分钟，进行内源性过氧 化物酶活性封闭，再用缓冲液A冲洗5分钟，得到内源性过氧化酶失活切片；
[0020] (6)将步骤（5)所得内源性过氧化物酶失活切片，置于抗原修复剂中，沸水煮3分 钟，进行抗原修复，室温冷却，用缓冲液A冲洗5分钟，得到抗原修复切片；
[0021] (7)将步骤（6)所得抗原修复切片，加非特异性蛋白阻断剂，常温封闭1小时，得到 非特异性抗体封闭切片；
[0022] (8)将步骤（7)所得非特异性抗体封闭切片，除阴性对照只加非特异性蛋白阻断 剂，其余切片均加非特异性蛋白阻断剂稀释的10 μ g/ml的一抗，然后室温孵育2小时，依次 用缓冲液A和缓冲液B冲洗，各冲洗3次，每次5分钟，得到一抗后的切片；
[0023] (9)将步骤（8)所得一抗后的切片，加入200倍非特异性蛋白阻断剂稀释的二抗， 室温孵育1小时，依次用缓冲液A和缓冲液B冲洗，各冲洗3次，每次5分钟，得到二抗后的 切片；
[0024] (10)将步骤（9)所得二抗后切片，用新鲜配制的显色液染色，室温孵育5分钟，得 到染色后的切片；
[0025] (11)将步骤（10)所得染色后的切片，自来水冲洗3分钟，染色剂复染3分钟，自 来水冲洗3分钟，得到复染切片；
[0026] (12)将步骤（11)所得复染切片，用脱水剂脱水干燥，每梯度2分钟，再用脱脂和透 明剂透明5分钟，中性树胶封固，即得SALL4免疫组织化学染色切片；
[0027] (13)将步骤（12)所得SALL4免疫组织化学染色切片，置于光学显微镜下，观察染 色程度、统计阳性细胞数目，再结合阳性对照和阴性对照的结果，判断待测样品是否为肺癌 组织。
[0028] 在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0029] 进一步，步骤（1)所述待测样品，为从病