Psa的elisa试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及PSA的ELISA试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 前列腺特异抗原（prostatespecificantigen，PSA)是与前列腺癌相关的一种抗 原，属糖蛋白类物质，分子量约为34KD，pH为6. 8~7. 5,等电点为6. 9,半衰期为2. 2 士 0. 8 天。PSA存在于前列腺内质网和前列腺上皮细胞及分泌物当中，正常前列腺及病变前列腺组 织内均含有PSA。它是公认的诊断前列腺癌的较好的肿瘤标志物，其诊断前列腺癌的特异性 为82%-97%。前列腺癌在男性所有类型癌中占10%~20%，是男性最常见的癌肿。该病 进展缓慢，是威胁50岁以上男性生命的主要癌症，在西方国家占男性死亡率的第二位。流 行病学调查表明，随着我国居民生活水平的改善，环境污染的加剧以及饮食结构的改变，前 列腺癌的发病率日趋上升，已引起临床上的高度重视。美国FDA已批准将PSA检测作为50 岁以上男性的普查指标。研宄显示，PSA测定在早期诊断前列腺癌上要优于直肠指检。正 常男性的PSA值<4ug/L。
[0003] PSA在血液中以游离和结合两种形式存在。其中游离PSA(freePSA，F-PSA)只 占小部分，结合型（comlexedPSA，C-PSA)占大部分，即与内源性蛋白酶抑制物前列腺癌 a1-抗糜蛋白酶（al-antichymotrysin，ACT)结合成PSA-ACT复合物，以及与另一种蛋白 抑制物a2-巨球蛋白（a2-macroglobulin，a2M)结合成PSA-a2M。在精液中，PSA还与 C蛋白抑制物构成复合物。由于PSA-a2M不具有免疫活性，不能被现有的PSA检测法检测 到。所以目前可定量检测到的PSA有3种：T-PSA(总PSA)，F-PSA，PSA-ACT。
[0004] 测量血清中总PSA可以用于筛选和早期诊断前列腺癌，它是公认的诊断前列腺癌 的较好的肿瘤标志物。研宄显示，总PSA测定在早期诊断前列腺癌上要优于直肠指检。美 国FDA已批准将总PSA检测作为50岁以上男性的普查指标。使用总PSA作为诊断前列腺 癌的诊断标准是：总PSA:0~4ng/ml正常；4~10ng/mL，21~25%的患癌几率；>10ng/ml 癌症。在4. 0~10ng/ml的灰色区域，单独检测总PSA无法区分癌症和良性增生。游离PSA 可提供更好的生化指标，用于区分总PSA4~10ng/ml的前列腺癌和良性增生。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种检测游离PSA的酶联免疫试剂盒，其由PSA标准品、 对照液、游离PSA单克隆抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶（HRP)标记的游离PSA单克隆 抗体溶液和辅助试剂组成。
[0006] 在本发明中，包被酶标板的游离PSA单克隆抗体和HRP标记的游离PSA单克隆抗 体为配对抗体，并且可通过商业渠道获得。
[0007] 在本发明的一个实施方案中，所述包被酶标板的制备过程为：将包被用游离PSA 单克隆抗体用〇. 05M碳酸盐缓冲液（pH值为9. 5)稀释后加入酶标板各孔，每孔100y1，吸 附过夜，用0. 05M磷酸盐缓冲液（pH值为9. 5)洗板，再用封闭液封闭过夜，甩干后晾干，即 获得单克隆抗体包被酶标板。所述封闭液为含lg/L的BSA、0.lg/L的蔗糖和0. 5g/L的酪 蛋白（Casein)的 15mmol/LPBS缓冲液，pH值为 9. 5。
[0008] 所述HRP标记的游离PSA单克隆抗体溶液为含0. 5mg/L的HRP标记的游离PSA单 克隆抗体和〇. 2mg/L的PEG200的15mmol/LPBS缓冲液，pH值为8. 5。
[0009] 所述辅助试剂包括对照缓冲液、底物溶液、显色液、反应终止液和清洗缓冲液，各 试剂具体为：
[0010] 对照缓冲液为15mmol/L的PBS(pH7. 4)缓冲液；
[0011] 底物溶液为磷酸-柠檬酸缓冲液（PH7. 4)配制的3%过氧化氢溶液，并且溶液中 0.lmg/L的焦磷酸二氢钠；
[0012] 显色液为四甲基联苯胺（TMB)的甲醇溶液，浓度为0.lmg/ml;
[0013] 反应终止液为3mol/L硫酸；
[0014] 清洗缓冲液为15臟〇1/1的？85&117.4)配制的0.05%吐温20溶液。
[0015] 本发明所述游离PSA的酶联免疫试剂盒的最低检测限可以达到0.Ing/mLPSA，并 且稳定性极佳，在室温条件下可保存1年，在4°C下可保存3年。
【具体实施方式】
[0016] 下面将结合举例来说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保 护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权 利要求书记载的内容为准。
[0017] 实施例1
[0018] 试剂盒组成：游离PSA单克隆抗体包被酶标板（96孔）；辣根过氧化物酶（HRP)标 记的游离PSA单克隆抗体溶液1瓶，6ml/瓶；对照缓冲液1瓶；游离PSA标准品1瓶，底物 溶液、显色液各1瓶，各5ml/瓶；反应终止液1瓶，5ml/瓶；清洗缓冲液（20X浓缩）1瓶， 30ml/ 瓶。
[0019] 游离PSA单克隆抗体包被酶标板的制备过程为：将包被用游离PSA单克隆抗体 用0. 05M碳酸盐缓冲液（pH值为9. 5)稀释后加入酶标板各孔，每孔100y1，吸附过夜，用 0.05M磷酸盐缓冲液（pH值为9. 5)洗板，再用封闭液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆 抗体包被酶标板。所述封闭液为含lg/L的BSA、0.lg/L的鹿糖和0. 5g/L的酪蛋白（Casein) 的15mmol/LPBS缓冲液，pH值为9. 5。
[0020] HRP标记的游离PSA单克隆抗体溶液为含0. 5mg/L的HRP标记的游离PSA单克隆 抗体和0. 2mg/L的PEG200的15mmol/LPBS缓冲液，pH值为8. 5。具体过程为：以NaI04-乙 二醇法进行HRP的氧化，达到终浓度15mg/ml。单克隆抗体和HRP在碱性碳酸盐缓冲液中透 析9小时，实现HRP对单克隆抗体的标记，反应结束后用NaBH4溶液终止反应，再对PBS透 析过夜。用饱和硫酸铵沉淀，获得纯化的HRP酶标抗游离PSA单克隆抗体。再用含0. 2mg/ L的PEG200的15mmol/LPBS缓冲液溶解至抗体终浓度0. 5mg/L。
[0021] 对照缓冲液为15mmol/L的PBS(pH7. 4)缓冲液；
[0022] 底物溶液为磷酸-柠檬酸缓冲液（pH7. 4)配制的3%过氧化氢溶液，并且溶液中 0.lmg/L的焦磷酸二氢钠；
[0023] 显色液为四甲基联苯胺（TMB)的甲醇溶液，浓度为0.lmg/ml;
[0024] 反应终止液为3mol/L硫酸；
[0025] 清洗缓冲液（IX)组成为15mmol/L的PBS(pH7. 4)配制的0. 05%吐温20溶液。
[0026] 实施例2试剂盒灵敏度考察
[0027] 分别配制PSA标准品不同浓度的PBS缓冲液，浓度分别为0.lng/ml，0. 5ng/ml， lng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，采用实施例1制备的试剂盒进行检测，以对照缓冲液作 为空白对照，具体检测方法如下：
[0028] a)抗原-抗体反应：在包被酶标板的微孔中分别加入50y1PSA标准品溶液和对 照缓冲液，37°C水浴保温50分钟。清洗缓冲液洗板操作5次。
[0029] b)将HRP标记的PSA单克隆抗体溶液加入各孔，每孔100y1，37°C水浴保温50分 钟。重复洗板操作5次。
[0030] C)显色反应：每孔依次加入底物溶液，显色液各50y1，37°C水浴保温20分钟，每 孔再加入50y1反应终止液结束反应。
[0031] d)比色：用酶标仪在450nm测定OD值并记录。
[0032] e)制作标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标，作出标 准曲线；计算标准曲线回归系数R2,当R2> 0. 99时本次测定有效；
[0033] 计算PSA标准品与空白对照的比值，当比值大于2时，说明试剂盒可以测定该浓度 的PSA标准品，最低浓度即为试剂盒的灵敏度，平行试验五次取平均值，具体结果如下：
[0034] 0.lng/mlPSA标准品及对照缓冲液0045。吸光度值
【主权项】
1. 一种检测游离PSA的酶联免疫试剂盒，其由PSA标准品、对照液、游离PSA单克隆抗 体包被的酶标板、辣根过氧化物酶（HRP)标记的游离PSA单克隆抗体溶液和辅助试剂组成。
2. 根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述包被酶标板的制备过程 为：将包被用游离PSA单克隆抗体用0. 05M碳酸盐缓冲液（pH值为9. 5)稀释后加入酶标板 各孔，每孔100 U 1，吸附过夜，用0. 05M磷酸盐缓冲液（pH值为9. 5)洗板，再用封闭液封闭 过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。
3. 根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述封闭液为含lg/L的BSA、 〇. lg/L的蔗糖和0. 5g/L的酪蛋白（Casein)的15mmol/L PBS缓冲液，pH值为9. 5。。
4. 根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述HRP标记的游离PSA单 克隆抗体溶液为含0. 5mg/L的HRP标记的游离PSA单克隆抗体和0. 2mg/L的PEG200的 15mmol/L PBS 缓冲液，pH 值为 8. 5。
5. 根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，对照缓冲液为15mmol/L的 PBS(pH7.4)缓冲液。
6. 根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，底物溶液为磷酸-柠檬酸缓冲 液（pH7. 4)配制的3 %过氧化氢溶液，并且溶液中0. lmg/L的焦磷酸二氢钠。
7. 根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，显色液为四甲基联苯胺（TMB) 的甲醇溶液，浓度为〇. lmg/ml ;
8. 根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，反应终止液为3mol/L硫酸； 清洗缓冲液为15臟〇1/1的？83(?117.4)配制的0.05%吐温20溶液。
【专利摘要】本发明属于生物医药领域，具体涉及一种检测游离PSA的酶联免疫试剂盒，其由PSA标准品、对照液、游离PSA单克隆抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶(HRP)标记的游离PSA单克隆抗体溶液和辅助试剂组成。
【IPC分类】G01N33-574
【公开号】CN104849459
【申请号】CN201510318891
【发明人】陈立国, 胡申刚
【申请人】广州华弘生物科技有限公司
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年6月11日