酶标抗体-金纳米探针在二氨基联苯胺催化显色及暗场成像的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及酶标抗体-金纳米探针在二氨基联苯胺催化显色及暗场成像中的应 用，属于纳米材料及生物医学纳米技术领域。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤居高不下的死亡率和高昂的治疗费用给患者和家属都带来巨大的痛苦 和压力，准确灵敏的检测方法不仅可以实现肿瘤的早期诊断，也能更好地给患者提供个体 化医疗，降低患者的痛苦。
[0003] 现今，免疫酶标法以其定位准确、对比度高等优点已成为临床肿瘤诊断中不可缺 少的重要诊断手段。其基本原理是先以功能性酶标记的抗体与细胞或组织上的待测物质直 接或间接结合，接着加入酶的显色底物，生成有色的不溶于水的产物，利用光学显微镜或电 子显微镜观察，对细胞表面或细胞内的待测抗原成分进行定位研宄。自2007年阎锡蕴研宄 组首次提出氧化铁纳米颗粒模拟酶的概念，许多纳米材料的类酶特性被相继发现，其中金 纳米颗粒作为一类功能性纳米颗粒，因其独特的表面等离子体共振、表面化学特性和催化 活性，在生物和化学检测中被格外关注。金的氧化还原电位为+1. 68,具有极强的夺电子能 力。对于有氧化还原电位较小的生物大分子参加的生化反应，具有很强的催化作用，能明显 提高生物大分子的活性，可催化H202氧化底物发生显色反应。但无论是传统的酶标二抗还 是新兴的金属模拟过氧化物酶，催化活性都很有限，这就大大限制了临床检测的灵敏度，同 时，目前的免疫组化检测为人工读片，主观性较强，准确性得不到保证。
[0004] 暗场显微镜以其分辨能力高等优点成为生物医学领域新的表征技术之一，金纳米 颗粒又以其优越的暗场散射性质在肿瘤成像方面的应用获得了科学家的认可，国内外很多 研宄组利用金纳米颗粒的暗场散射性质实现了恶性肿瘤的检测。但金纳米颗粒的散射强 度有限，当单独使用金纳米颗粒标记肿瘤细胞或组织进行暗场观察难以达到临床检测的要 求。
【发明内容】
[0005] 发明目的：为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于酶标抗体-金纳米 探针在二氨基联苯胺催化显色及协同增强暗场成像中的应用。该方法通过将金纳米颗粒 作为大量酶标二抗的载体同时利用其本身的类酶活性和暗场散射特性，以及催化产物DAB 聚合体的暗场散射特性，提高该方法的暗场散射强度。
[0006] 技术方案：本发明提供的酶标抗体-金纳米探针在二氨基联苯胺催化显色及暗场 成像中的应用。
[0007] 其中，所述酶标抗体-金纳米探针（GNP-Ab-HRP)采用以下方法制得：选用辣根过 氧化物酶（HRP)标记的兔鼠通用酶标二抗构建酶标抗体-金纳米探针（GNP-Ab-HRP)，采 用静电吸附法将鼠兔通用型酶标二抗偶联到金纳米颗粒上，并用1 %BSA封闭，离心即得 GNP-Ab-HRP探针。
[0008] 本发明还提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括以下组份：
[0009] 包括彼此独立的一抗溶液、酶标抗体-金纳米探针溶液、DAB显色液和洗涤液；
[0010] 所述一抗溶液包括：一抗、防腐剂和磷酸盐缓冲液（pH= 7-8);
[0011] 所述酶标抗体_金纳米探针溶液包括：10-500yg/ml酶标抗体-金纳米探针、 0. 1-5%
[0012] 封闭蛋白和磷酸盐缓冲液（pH= 8-10);
[0013] 所述DAB显色液包括彼此独立的DAB显色液I、DAB显色液II和1-60%过氧化氢， 使
[0014] 用前按1:1:1混合；
[0015] 所述洗涤液包括质量百分比为0. 01-2 %吐温-20和磷酸盐缓冲液（pH= 7-8);
[0016] 各组分用量如下表：
【主权项】
1. 酶标抗体-金纳米探针在二氨基联苯胺催化显色及协同增强暗场成像中的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于；所述酶标抗体-金纳米探针（GNP-Ab-HRP) 采用W下方法制得；选用辣根过氧化物酶（HR巧标记的兔鼠通用酶标二抗构建酶标抗 体-金纳米探针（GNP-Ab-HRP)，采用静电吸附法将鼠兔通用型酶标二抗偶联到金纳米颗粒 上，并用1 %BSA封闭，离屯、即得GNP-Ab-HRP探针。
3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述所述酶标抗体-金纳米探针 (GNP-Ab-HR巧的粒径为lO-lOOnm，每个酶标抗体-金纳米探针（GNP-Ab-HRP)表面有5-500 酶标抗体。
4. 一种包括权利要求1至3任一项中所述的酶标抗体-金纳米探针免疫组化检测试剂 盒，其特征在于： 包括彼此独立的一抗溶液、酶标抗体-金纳米探针溶液、DAB显色液和洗漆液； 所述一抗溶液包括；一抗、防腐剂和磯酸盐缓冲液（pH= 7-8); 所述酶标抗体-金纳米探针溶液包括；10-500yg/ml酶标抗体-金纳米探针、0. 1-5% 封闭蛋白和磯酸盐缓冲液（pH= 8-10); 所述DAB显色液包括彼此独立的DAB显色液I、DAB显色液II和1-60 %过氧化氨，使用 前按1:1:1混合； 所述洗漆液包括质量百分比为0. 01-2%吐温-20和磯酸盐缓冲液（pH= 7-8); 各组分用量如下表：
5. 权利要求3所述的免疫组化试剂盒在肿瘤细胞检测中的应用。 '
6. 如权利要求4所述的应用，其特征在于：包括W下步骤： (1) 酶标抗体-金纳米探针的构建 选用辣根过氧化物酶（HR巧标记的兔鼠通用酶标二抗构建酶标抗体-金纳米探针 佑NP-Ab-HRP)，采用静电吸附法将鼠兔通用型酶标二抗偶联到金纳米颗粒上，并用1%BSA 封闭，离屯、即得GNP-Ab-HRP探针； (2) 暗场免疫组化检测方法 GNP-Ab-HRP催化DAB显色，再利用其进行双模态免疫组化检测，并实现量化判读； 将待测样品按常规方法预处理后，先与一抗4°C解育过夜，再与酶标抗体-金纳米探针 佑NP-Ab-HRP) 37°C解育30min，用PBS-T洗漆后进行DAB显色，在暗场显微镜下观察； (3) 判读方法及标准 1)对暗场成像图进行取色； 。分析目标颜色面积，计算红色面积佩和红色与黄绿色面积和做的比值N; 3) 通过将R值和N值和标准区间比对，确定目标颜色面积处于哪种阴性/阳性区 间；其中，区间判断标准为；当R<400时，为;当400<R<10000且N<0. 26时，为" + 当 400<R<10000 且 0. 26《N《0. 35 时，为"++'' ；当S> 10000 且N〉0. 35 时，为"+++，' ； 4) 得出检测结论； 5)输出只含有目标颜色的检测图片。
7.酶标抗体-金纳米探针在二氨基联苯胺催化显色反应中的应用。
【专利摘要】本发明提供了酶标抗体-金纳米探针在二氨基联苯胺催化显色及暗场成像中的应用。还提供了一种包括上述酶标抗体-金纳米探针免疫组化检测试剂盒。本发明将酶标抗体-金纳米探针催化二氨基联苯胺(DAB)显色，从而可实现协同增强的暗场免疫组化检测，并建立了量化判读。
【IPC分类】G01N33-543, G01N33-535, G01N33-574
【公开号】CN104849449
【申请号】CN201510243543
【发明人】张宇, 范霖, 田艳艳, 娄豆豆, 张熙之, 马明, 顾宁
【申请人】东南大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月13日