用于促进成骨分化或血管化的肽及其应用

用于促进成骨分化或血管化的肽及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种有效促进成骨分化和血管化的蛋白，更具体而言，涉及表现出促进成骨分化或成骨作用和血管化的活性的肽，以及其应用。
【专利说明】
用于促进成骨分化或血管化的肽及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及有效促进成骨分化和血管化的蛋白，更具体而言，涉及表现出促进成 骨分化或血管化的活性的肽，以及其应用。
【背景技术】
[0002] 骨质减少很大程度上受骨质量的变化的影响。影响骨质量变化的主要因素包括遗 传因素、营养摄取、激素变化、锻炼和生活方式差异等。最近，已经知晓老龄化、缺乏锻炼、低 钙饮食、更年期和切除卵巢会引起骨质量减少，并由此导致骨质疏松。
[0003] 骨质疏松是一种下述的疾病：其中，骨骼随钙质在骨组织中的沉积减少的症状的 进程而变得非常薄弱，骨密度变低且髓腔变宽，由此容易引起骨相关疾病(如骨折)甚至轻 度休克的发生。
[0004] 尽管存在个体差异，骨再吸收水平在黑人中比在白人中更低，因此黑人具有较高 的骨质量。通常，骨质量在14~18岁之间达到最高水平，并在老龄时每年减少约1 %。特别 是，骨骼减少在女性中持续发生，因为在30岁和更年期时，由于激素变化而使骨骼减少快速 发生。也就是，一旦女性进入更年期，其将经历雌激素水平的快速减少，特别是，B-淋巴细胞 大量生成，并且前B细胞累积在骨髓中。结果，IL-6的量增大，由此破骨细胞的活性增大并由 此使骨质量减少。
[0005] 因此，尽管存在不同的程度，老年人、特别是绝经后女性不能避免骨质疏松，并且 在具有老龄化人群的发达国家中，对骨质疏松及其治疗剂存在越来越大的兴趣。
[0006] 另外，除了骨质疏松，骨相关疾病还包括骨关节炎、骨质流失疾病等。骨关节炎是 在关节的软骨变得受损时出现的局部退行性病变，并且还称为退行性关节炎。骨关节炎的 出现有两个主要原因，即，尽管关节的软骨或骨骼正常，但由于关节上负荷过重而使关节组 织受损时;或尽管关节上负荷正常，但软骨或骨骼较弱时。
[0007] 骨质流失疾病可能出现在身体的许多区域中，并且骨质流失疾病的主要原因可能 包括伴随骨组织流失的急性创伤、在手术期间伴随由于组织移除所致骨质流失的急性创 伤、伴随骨骼切除术的慢性感染和伴随骨节段流失的慢性骨不愈合等。
[0008] 已经建立了与治疗骨疾病相关的价值至少约1300亿美元的全球市场，并且该市场 的规模可期望在未来继续进一步增大，因此全球研究机构和药物公司已经对用于治疗骨疾 病的治疗剂的开发投入不菲。
[0009] 特别是，在骨质疏松的情况中，例如，骨质疏松治疗的实例包括雄激素合成代谢类 固醇、钙制剂、磷酸盐、氟制剂、依普黄酮和维生素 D3等。Merck&Co.，Inc.(美国）在1953年开 发出氨基双膦酸盐，Lilly Co.(美国）开发出用作选择性雌激素受体调节剂(SERM)的雷洛 昔芬，作为用于治疗骨质疏松的治疗剂。
[0010] 同时，作为骨再吸收抑制剂的雌激素最为广泛地用作骨质疏松治疗。不过，雌激素 的常规应用可能增大子宫内膜癌和乳腺癌的发病率，并可能导致血栓形成、胆石病、高血 压、水肿和乳腺痛等。对绝经后女性(其同时施用雌激素和孕酮)的追踪研究揭示了乳腺癌、 中风和肺栓塞等的高发病率。
[0011] 此外，双膦酸盐制剂(阿仑膦酸钠和依替膦酸钠）、维生素 D制剂、降血钙素制剂和 钙制剂等用作骨质疏松用治疗剂。不过，这些治疗剂具有以下问题:双膦酸盐制剂的吸收速 率低、施用方法复杂，引起食管炎;维生素 D制剂昂贵且其效果尚未确认;降血钙素制剂昂贵 且施用方法困难;且钙制剂虽然具有较少的副作用，但是其有效用于防止而非治疗骨质疏 松。另外，骨质疏松不能通过短期施用药物治疗，而必须长期施用。因此，需要开发出一种具 有优异效果的新型物质来代替现存的治疗物质，而没有上述副作用。
[0012] 当前，对于骨形态生成活性而言，已经报道了属于转化生长因子(TGF)-e超家族的 骨形态生成蛋白质（BMP) (Science 150,893-897，1965; Science 242; 1528-1534，1988)。已 知的BMP物种（species)来自BMP-1~BMP-14。其中，已知BMP-2~BMP-14表现出骨形态生成 活性。据认为，BMP-2~BMP-14可有效用于各种骨功能紊乱和骨疾病的疗法治疗，不过其在 自然界以痕量存在。
[0013] 因此，为了大量获得可用于上述治疗的BMP-2~BMP-14以使其价格可接受，需要制 备重组蛋白。通常，重组蛋白的制备与低分子量化合物相比需要更高的花费。另一方面，由 于蛋白特性，从物理性质和施用角度来看，重组蛋白作为药物制品具有许多限制。在这些背 景下，本发明人在先前已经开发出骨肽蛋白1(BFP 1)，其由15个氨基酸构成，并且作为低分 子量有机化合物具有与BMP蛋白相同的活性。

【发明内容】

[0014] 技术问题
[0015] 本发明人已经制备和筛选出各种类型的人源蛋白，以制备具有与天然BMP相同或 比其更优异的功能或作用的肽，所述肽可以低成本地制造并具有优异的稳定性。结果，可从 许多候选肽中选择出不仅具有优异的生理活性而且具有优异稳定性的肽，由此完成本发 明。
[0016] 因此，本发明的一个目的是提供一种趋化因子来源的肽，其通过对成骨细胞或血 管内皮细胞作用而促进分化，由此表现出分化因子的活性。
[0017] 本发明的另一目的是提供一种组合物，其用于缓解或治疗成骨分化因子或骨形态 生成因子或血管化因子的有效性的疾病或病症。
[0018] 本发明的又一目的是提供一种组合物，其有效用于缓解或治疗包括缺血性坏死在 内的血管疾病，所述组合物包含能够表现出促进血管化的活性的肽作为活性成分。
[0019] 本发明的又一目的是提供一种药物组合物，其具有优异的药物效应而无副作用 (因为其是包含由15个氨基酸构成的肽作为活性成分的低分子量有机化合物），并且还具有 相对较低的制造成本。
[0020] 本发明的又一目的是提供一种用于成骨分化的培养组合物，其包含具有成骨分化 因子或骨形态生成因子活性的肽，能够根据实验者的意图控制骨形态生成速度。
[0021] 本发明的目的不限于以上描述的那些，并且以上未描述的其他目的及其优势能够 由本领域技术人员通过下文描述的本发明的【具体实施方式】、权利要求和附图而清楚了解。 [0022]技术方案
[0023]为了实现上述目的，本发明提供一种具有分化因子活性的肽，所述肽具有氨基酸 序列SEQ ID N0:1。
[0024] 在优选实施方式中，所述肽具有细胞分化能力。
[0025] 在优选实施方式中，所述细胞是成骨细胞或血管内皮细胞。
[0026] 在优选实施方式中，所述肽为源自SDF-ld蛋白。
[0027] 另外，本发明提供了一种用于治疗或缓解骨质疏松的药物组合物，其包含以上描 述的任意一种肽作为活性成分。
[0028] 另外，本发明提供了一种用于治疗或缓解骨关节炎的药物组合物，其包含以上描 述的任意一种肽作为活性成分。
[0029] 另外，本发明提供了一种用于治疗或缓解骨质流失疾病的药物组合物，其包含以 上描述的任意一种肽作为活性成分。
[0030] 另外，本发明提供了一种用于成骨分化的培养基，其包含以上描述的任意一种肽 作为活性成分。
[0031] 另外，本发明提供了一种用于治疗或缓解血管疾病的药物组合物，其包含以上描 述的任意一种肽作为活性成分。
[0032] 在优选实施方式中，所述血管疾病为缺血性坏死。
[0033] 有益效果
[0034]本发明的效果如下。
[0035] 首先，本发明的肽通过对成骨细胞或血管内皮细胞作用而促进分化，由此表现出 分化因子的活性。
[0036] 另外，本发明的肽可用于缓解或治疗成骨分化因子或骨形态生成因子或血管化因 子的有效性的疾病或病症。
[0037] 另外，本发明的肽是由15个氨基酸构成的低分子量有机化合物，其具有优异的药 物效应而无副作用，并具有相对较低的制造成本。
[0038] 另外，本发明的药物组合物通过包含肽而可以有效地作用于缓解或治疗包括缺血 性坏死在内的血管疾病，该肽作为活性成分而表现出血管化促进因子的活性。
[0039] 另外，本发明的药物组合物通过包含肽而可以有效地作用于缓解或治疗骨质疏 松、骨关节炎或骨质流失疾病，该肽作为活性成分而表现出分化因子的活性。
[0040] 另外，用于成骨分化用培养基的组合物通过包含肽而能够根据实验者的意图控制 成骨分化速率或骨形态生成速率，该肽作为活性成分而表现出分化因子的活性。
[0041] 本发明的效果不限于以上描述的那些，并且未描述的那些效果将由本领域技术人 员基于下文提供的描述而清楚了解。
【附图说明】
[0042] 图1示出了SEQ ID N0:1的肽BFP 5的氨基酸序列。
[0043]图2示出了本发明的SEQ ID N0:1的肽BFP 5的结构。
[0044] 图3示出了茜素红染色法确认的经由BFP 5的成骨分化而累积的矿化作用的照片。
[0045] 图4示出了描绘测量通过BFP 5引起的碱性磷酸酶(成骨细胞特异性基因）的表达 水平的实验结果的图示。
[0046]图5示出了描绘测量通过BFP 5引起的Runx2、碱性磷酸酶、骨桥蛋白、1型胶原蛋 白、DLX5和〇SteriX(它们是成骨细胞特异性基因）的表达水平的实验结果的照片。
[0047]图6示出了描绘测量通过BFP 5引起的的碱性磷酸酶和Osterix(它们是在成骨细 胞中表达的蛋白）的表达水平的实验结果的照片。
[0048]图7示出了描绘在用不同浓度的BFP 5处理后的碱性磷酸酶(其是在成骨细胞中表 达的蛋白）的表达水平的照片。
[0049]图8示出了描绘在用不同浓度的BFP 5处理后的Osterix(其是在成骨细胞中表达 的蛋白）的表达水平的照片。
[0050] 图9示出了描绘通过用BFP 5与VEGF、FGF、SDF-la和SDF-lg-起处理细胞而得的 BFP 5对血管化的作用的照片。
【具体实施方式】
[0051] 本发明选择使用的术语是考虑到功能而当前广泛使用的那些术语，不过，这些术 语根据本领域技术人员的意图、判例和新技术的出现等而可能改变。另外，在特定情况中， 还存在
【申请人】任意选择的术语，其中该术语将在本发明的【具体实施方式】中解释。因此，本发 明使用的术语应当基于该术语具备的含义和本发明整个说明书的内容而非该术语单纯的 名称限定。
[0052]下面，将参照附图及其优选实施方式详细描述本发明的技术特征。除非另外指出， 否则固体/固体是指(重量/重量)份或％，固体/液体是指(重量/体积)份或％，且液体/液体 是指(体积/体积)份或％。
[0053] 不过，本发明可以局限于下文说明的实施方式，但是也可实施为不同形式。在整个 说明书中用于解释本发明的相似标记表示相似元素。
[0054] 本发明人已经制备和筛选出各种类型的人源蛋白，以制备具有与天然BMP相同或 比其更优异的功能或作用的肽，所述肽可以低成本地制造并具有优异的稳定性。结果，可从 许多候选肽中选择出不仅具有优异的生理活性而且具有优异稳定性的肽。
[0055]特别是，本发明人并非基于与BMP的功能相关的区域合成出本发明的肽，而是本发 明的技术特征在于，本发明的肽基于人类趋化因子的特定区域合成。也就是，本发明的肽基 于A形状的基质细胞源因子l(SDF-l)的部分区域合成，该因子也称为C-X-C模序趋化因子 12(CXCL12)〇
[0056]事实上，趋化因子是选择性控制白细胞亚组的细胞粘附、化学吸引作用和活化等 的细胞因子，并主要涉及细胞迀移。趋化因子是具有四个分子量为10kD(90~130个氨基酸） 的保守性半胱氨酸残基的物质，其根据两个连续的半胱氨酸残基的位置可划分为两种类型 (即，CC趋化因子和CXC趋化因子），不过，事实上，趋化因子不具有成骨分化功能。
[0057]本发明的肽包括选自由SDF-ld源氨基酸组成的组的氨基酸序列。特别是，本发明 的肽基本上由图1所示的SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成。本发明的肽具有由SEQ ID NO: 1 所示的15个氨基酸构成的新型序列，并且本发明人将SEQ ID N0:1的肽命名为骨形成肽5 (BFP 5)〇
[0058]如本文所用，术语"肽"是指经肽键相互连接的氨基酸残基形成的线性分子。本发 明的肽可以根据本领域已知的化学合成方法制备，具体而言，根据固相合成技术 (MerrifieId，J.Amer·Chem.Soc·85:2149-54(1963);Stewart等，Sol id Phase Peptide Synthesis,第二版，Pierce Chem.Co. :Rockford, 111(1984))制备。
[0059] SEQ ID NO: 1的肽发挥与天然BMP和趋化因子中至少一个相似的作用，并通过与受 体结合而发挥诸如分化因子等功能。特别是，SEQ ID NO: 1的肽起到促进成骨细胞或血管内 皮细胞的分化的作用。
[0060] 本发明的肽不仅表现出几乎与天然BMP或趋化因子相同的优异生理活性，或比天 然BMP或趋化因子更优异，而且具有优异的热稳定性和对诸如酸、碱等物理化学因子的稳定 性。因此，具有优异的长期保存性的本发明的肽可以有利地应用于需要长期存储的产品，如 药物制品和准药品。
[0061 ]本发明的肽可以作为活性成分而包含于药物组合物中。
[0062] 因此，本发明的药物组合物是包含(a)药学有效量的本发明的肽和(b)药学可接受 载体的药物组合物。
[0063] 如本文所用，术语"药学有效量"是指足以实现所述肽的上述效果或活性的量。
[0064] 本发明的药物组合物中包含的药学上可接受的载体是制剂中通常使用的那些，可 以包括:乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸 钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基 羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等，但并不限于此。除了上述组分，本发明的药物组 合物可以还包括润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂等。适当的药学 上可接受的载体和制剂的实例如Remington's Pharmaceutical Sciences(第19版，1995) 中详细所述。
[0065] 本发明的药物组合物可以口服施用或非肠道施用，并且优选的是非肠道施用。对 于非肠道施用而言，药物组合物可以经由静脉注射、皮下注射、肌肉内注射、腹膜内注射、局 部施用或经皮肤施用等进行施用。
[0066] 本发明的药物组合物的适当剂量可以根据诸如配制方法、施用方法、患者的年龄、 体重和性别、疾病严重性、饮食、施用时间、施用途径、排泄率和反应敏感性等因素而区别规 定。同时，本发明的药物组合物的剂量为〇. OOOlyg/日~lOOyg/日，优选为〇. 000lyg/mL~?μ g/mL〇
[0067] 根据本领域技术人员能够容易实施的方法，通过配制药学可接受载体和/或赋形 剂，本发明的药物组合物可以制备为单位剂型或封入多剂容器中。特别是，制剂可以为在油 或水性介质中的溶液、悬浮液或乳液、提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊的形式，并还可以包 括分散剂或稳定剂。
[0068] 实施例
[0069] Pr〇-Pr〇-Arg-Ala-Cys-Pr〇-Thr-Ala-Arg-Ala-Leu-Cys-Glu-Ile-Arg(SEQ ID NO: 1)的合成
[0070] 向反应容器中添加量为700mg的氯代三苯甲基氯树脂(CTL树脂，Nova Biochem产 品目录号01-64-0021)和10mL二氯甲烷(MC)，并搅拌3分钟。在除去溶液中，向其中添加10mL 二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌3分钟，并除去溶剂。向反应容器中添加二氯甲烷(1 OmL)、200mmo 1 Fmoc_Arg(pbf )-〇H(Bachem,瑞士)和400mmol二异丙基乙基胺(DIEA)，经搅拌良好溶解并反 应，同时搅拌1小时。在反应完成后，即刻洗涤所得物，与溶解在二氯甲烷(DCM)中的甲醇和 DIEA(比例2:1)反应10分钟，并用过量的DCM/DMF(比例1:1)洗涤。在除去溶液后，向其中添 加 lOmL二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌3分钟，并除去溶剂。向反应容器中添加量为lOmL的脱保护 溶液(20%的哌啶/DMF)，在室温下搅拌10分钟，并除去溶液。向其中添加等量的脱保护溶 液，反应维持10分钟，并除去溶液，分别用DMF洗涤两次，用MC洗涤一次，并用DMF洗涤一次， 共3分钟，并从中制备出Arg(pbf)-CTL树脂。
[0071 ]向新反应容器中添加 DMF溶液（10mL)、200mmo1 Fmoc-I le_0H(Bachem，瑞士）、 200mmol HoBt和200mmol Bop，并经搅拌良好溶解。向反应容器中分两部分添加 DIEA (400_〇1)，搅拌至少5分钟，直至全部固体变溶解。向反应容器中添加包含脱保护树脂的溶 解后的氨基酸混合物溶液，并在室温反应1小时，同时搅拌。除去反应溶液，并与DMF溶液搅 拌3次，每次5分钟并除去。收集少量的反应后树脂，并通过Kaiser测试(Nihydrin测试)检测 反应程度。使用脱保护溶液，以与上述相同的方式进行脱保护反应两次，并由此制备Ile-Arg(pbf )-CTL树脂。树脂用DMF和MC充分洗涤，并再次进行Kaiser测试，并与上述相同的方 式进行随后的氨基酸粘附测试。基于所选择的氨基酸序列，以Fmoc-Glu、Fmoc-Cys(trt)、 Fmoc-Leu、Fmoc-Ala、Fmoc-Arg、Fmoc-Ala、Fmoc-Thr、Fmoc-Pro、Fmoc-Cys(trt)、Fmoc_Ala、 Fmoc-Arg、Fmoc-Pro和Fmoc-Pro的顺序进行链反应。Fmoc保护基团与脱保护溶液反应两次， 每次10分钟，并通过洗涤良好除去。向其中添加乙酸酐、DIEA和HoBt来进行1小时的乙酰化， 并分别用DMF、MC和甲醇洗涤3次肽基树脂，通过向其中缓慢吹入氮气干燥，通过在P205下降 至真空而完全干燥，并添加30mL脱水溶液（三氟乙酸（95% )、蒸馏水（2.5 % )、茴香硫醚 (2.5% ))，并且反应在室温保持2小时，同时不定期振荡。树脂通过过滤而进行过滤，用少量 TFA溶液洗涤，并与母液合并。所得物在减压下进行蒸馏直至整个体积降至约一半，并通过 添加50mL冷醚诱发沉淀。通过离心过滤收集析出物，并用更冷的醚洗涤两次。在除去母液 后，所得物在氮气下充分干燥，并合成出〇 · 65g NH2-Pr〇-Pr〇-Arg-Ala-Cys-Pr〇-Thr_Ala-Arg-Ala-Leu-Cys-Glu-Ile-Arg-〇H肽，然后进行纯化(收率93% ) 〇
[0072] 实验例1
[0073] 通过使用在线PEP-F0LD服务器提供的程序添加15个氨基酸序列而确认了实施例 中制得的SEQ ID NO: 1的结构。结果如图2所示。
[0074]从图2可以观察到，SEQ ID NO: 1的肽具有α-螺旋结构。
[0075] 实验例2
[0076]为了确认BFP 5(其是实施例中制备的SEQ ID NO: 1的肽)对成骨分化的活性的效 果，进行了下述实验。
[0077] 1.成骨细胞和成骨分化用培养基的制备
[0078]将从Balb/c小鼠骨髓基质细胞克隆的间充质干细胞（1χ104)等分至10%含FBS的 DMEM中，并在大气（约37°C，5%C02)中培养3天，由此制备出在本实验中用作成骨细胞的间 充质干细胞。成骨分化培养基(下文称为〃〇DM〃）由DMEM构成，其包含50yg/mL抗坏血酸、10- 8Μ 地塞米松和ΙΟπιΜβ-甘油磷酸盐等。
[0079] 2.矿物化的测量
[0080] 间充质干细胞至成骨细胞的分化引起钙累积。此处，钙累积的程度是指成骨细胞 的分化程度，并且钙离子的累积程度可以通过观察经茜素红染色而染成红色的细胞的染色 程度而确认。关于这一点，经茜素红染色测量矿物化。也就是，随着至成骨细胞的分化得到 促进，存在更多的区域能够被茜素红染色。因此，成骨分化的程度可以通过下述过程确认： 向成骨分化培养基中添加茜素红、使用SEQ ID NO: 1(BFP 5)的肽处理并观察茜素红染色的 程度。
[0081]更具体而言，将所制备的成骨细胞、即间充质干细胞转移至成骨分化培养基，添加 浓度为〇 · 01yg/yL、0 · 1μg/μL、1μg/μL和10yg/yL的BFP 5，并温育另外两天。然后，将经培养 的间充质干细胞在冰上冷却，用70%乙醇固定1小时，并用茜素红-s溶液染色约10分钟，并 通过钙沉积的程度确认矿物化。结果如图3所示。
[0082]如测量经由BFP 5(其是本发明的SEQ ID NO: 1肽）的成骨分化而累积的矿物化的 茜素红染色所确认的，由图3的照片可以确认，添加有Uig/yL BFP 5的细胞显示出最强的染 色。另外，当使用BFP 1确认成骨分化时，染色与BFP 5相比相同或较弱。此外，虽然尚不知道 趋化因子SDF Ια的成骨分化能力，不过从实验结果中确认了较弱的染色，因此，据推测趋化 因子SDF Ια可以促进成骨分化。因此，可以推断出，作为来源于趋化因子的合成肽的BFP 5 的促进成骨分化的能力与BFP 1相同或高于BFP 1 (其是来源于ΒΜΡ-7的合成肽）。
[0083] 实验例3
[0084]进行测量由BFP 5(其是实施例中制备的SEQ ID NO: 1的肽）引起的碱性磷酸酶(其 是成骨细胞特异性基因）的表达水平的实验来使用试剂盒测量碱性磷酸酶的酶活性，且结 果示出于图4中。成骨细胞特异性基因在分化至成骨细胞时表达，特别是，通过逆转录基因 扩增(RT-PCR)测量作为成骨细胞特异性基因的碱性磷酸酶的表达水平，结果确认，在lyg/μ L BFP 5下观察到碱性磷酸酶的强表达。
[0085] 实验例4
[0086]为了确认BFP 5(其是实施例中制备的SEQ ID NO: 1的肽)对成骨分化活性的效果， 使用抗体在荧光显微镜下分析了由BFP 5引起的成骨细胞特异性基因（如Runx2、碱性磷酸 酶、骨桥蛋白、1型胶原蛋白、DLX5和Osterix)的表达水平，并且所得照片分别在图5中示出。 [0087]从图5中可确认，在成骨细胞中表达的Runx2、碱性磷酸酶、骨桥蛋白、1型胶原蛋 白、DLX5和Osterix的基因在用BFP 5处理的细胞中强表达。
[0088]成骨细胞特异性蛋白在分化至成骨细胞时表达。当针对该蛋白的抗体与细胞反应 时，利用荧光显微镜确认结合程度。结果，可确认，碱性磷酸酶(其是用作成骨作用标记物并 在成骨分化中期产生的酶)在BFP 5时有强表达，并且Runx-2(其是在成骨细胞的成骨细胞 特异性蛋白的制造中起到重要作用的转录调节因子)在成骨分化中发挥重要作用。Runx-2 还显示出在BFP 5时强表达。
[0089] 实验例5
[0090]为了确认作为实施例中制备的SEQ ID NO: 1的肽的BFP 5对成骨分化活性的效果， 确认了成骨细胞中表达的蛋白水平，并在图6中示出结果。
[0091] 如图6所示，可观察到碱性磷酸酶和Osterix由BFP 5引起强表达。
[0092] 实验例6
[0093]为了确认作为实施例中制备的SEQ ID NO: 1的肽的BFP 5对成骨分化活性的有效 浓度，使用不同浓度的BFP 5处理细胞，并在图7中示出在成骨细胞中表达的碱性磷酸酶的 表达水平及结果。
[0094]由图7可确认，当影响成骨分化活性的BFP 5以0.1yg/mL~lyg/mL的浓度处理时， 成骨细胞的表达为最高水平。
[0095] 实验例7
[0096] 为了确认作为实施例中制备的SEQ ID NO: 1的肽的BFP 5对成骨分化活性的有效 浓度，使用不同浓度的BFP 5处理细胞，并在图8中示出在成骨细胞中表达的Osterix的表达 水平及结果。
[0097]由图8可确认，当影响成骨分化活性的BFP 5以0.1yg/mL的浓度处理时，成骨细胞 的表达为最高水平。
[0098] 实验例8
[0099]为了确认作为实施例中制备的SEQ ID NO: 1的肽的BFP 5对血管化活性的效果，使 用BFP 5与VEGF、FGF、SDF-la和SDF-lg处理细胞，并观察BFP 5对血管化的效果。结果示出在 图9中。
[0100]图9对与血管化相关的蛋白VEGF的表达进行了确认，由图9可确认，使用BFP5处理 的细胞显示出VEGF的强表达。
[0101]由这些实验的结果可以确认，由于作为本发明的SEQ ID N0:1的肽的BFP 5与BMP-7或BFP 1(之前已知它们可促进成骨分化)相比对促进成骨分化具有更重要的作用，因而毫 无疑问的是BFP 5可以在更宽的范围诱发快速成骨作用，具有与BMP-7相同或比BMP-7更高 的成骨强度。另外，明显的是，作为本发明的SEQ ID N0:1的肽的BFP 5在明显低于BFP 1的 处理浓度下具有与BFP 1相同或比BFP 1更高的成骨促进功能。
[0102] 结果，本发明的药物组合物可以用作骨质疏松和/或骨关节炎的有效治疗剂。另 外，以相同的方式，当本发明的药物组合物填充或施用至骨质流失疾病的骨质流失区域时， 通过促进成骨作用可以有效地进行骨恢复。另外，通过包含表现出促进血管化活性的肽作 为活性成分，本发明的药物组合物可以用作用于缓解或治疗包括缺血性坏死在内的血管疾 病的有效治疗剂。
[0103] 同时，尽管未提供【具体实施方式】，不过明显的是，当将作为本发明的SEQ ID NO: 1 的肽的BFP 5添加至用于成骨分化的培养组合物时，实验者可在进行实验的同时控制实验 的速度，因而能够容易地进行实验。
[0104] 已经参照示例性实施方式说明了本发明。不过，本发明的范围不应限制于这些实 施方式，并且本领域普通技术人员使用所附权利要求中限定的本发明的基本构思得出的各 种修改和改进形式也囊括在本发明的范围内。
[0105]
【主权项】
1. 一种表现出分化因子活性的肽，其具有氨基酸序列SEQ ID NO: 1。2. 如权利要求1所述的肽，其中，所述肽具有促进细胞分化的能力。3. 如权利要求2所述的肽，其中，所述细胞是成骨细胞或血管内皮细胞。4. 如权利要求1所述的肽，其中，所述肽来源于SDF-ld蛋白。5. -种用于治疗或缓解骨质疏松的药物组合物，其包含权利要求1~4中任一项所述的 肽作为活性成分。6. -种用于治疗或缓解骨关节炎的药物组合物，其包含权利要求1~4中任一项所述的 肽作为活性成分。7. -种用于治疗或缓解骨质流失疾病的药物组合物，其包含权利要求1~4中任一项所 述的肽作为活性成分。8. -种用于成骨细胞分化的培养基组合物，其包含权利要求1~4中任一项所述的肽作 为活性成分。9. 一种用于治疗或缓解血管疾病的药物组合物，其包含权利要求1~4中任一项所述的 肽作为活性成分。10. 如权利要求9所述的药物组合物，其中，所述血管疾病为缺血性坏死。
【文档编号】A61P9/10GK106084029SQ201610248837
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年4月20日 公开号201610248837.7, CN 106084029 A, CN 106084029A, CN 201610248837, CN-A-106084029, CN106084029 A, CN106084029A, CN201610248837, CN201610248837.7
【发明人】尹择林, 金亨根, 宣钟根, 金枝贤, 姜周延
【申请人】全南大学校产学协力团, 全南大学校病院