专利名称：血管活性肠肽1型受体的高亲和力结合多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉生物技术领域，特别涉及血管活性肠肽I型受体的高亲和力结合多肽。
背景技术：
血管活性肠妝受体(vasoactiveintestinal peptide receptor, VI PR)属于七次跨膜G蛋白偶联受体家族，整个受体包括3个部分N-末端胞外域，含一个疏水的N端信号肽以及VIP结合位点；跨膜域，含七个疏水的跨膜片段；C-末端胞浆域，与信号转导相关。目前发现血管活性肠肽受体有VPACl (血管活性肠肽I型受体)、VPAC2和PACl三种亚型，在人体组织中，内源性VIP主要通过与VPACl和VPAC2两种受体亚型结合发挥生物效应，并且VIP能够诱导VPACl的内化和核定位，通过信号转导调节肿瘤相关因子VEGF和EGFR等·基因的表达，从而促进肿瘤生长进展。研究证实，VPACl在结直肠癌等多种肿瘤细胞及其转移灶中呈高水平表达，而VPAC2仅表达于良性平滑肌瘤等少数肿瘤，并且VPACl与天然配体VIP的结合亲和力是VPAC2的20倍。目前全球结直肠癌(colorectal cancer, CRC)的发病率和死亡率呈持续上升趋势，已成为严重危害人类健康的疾病之一，针对CRC的分子核医学显像对于CRC的早期诊断和治疗具有重要意义。由于肿瘤细胞VPACl最大结合位点是正常组织的22. 5 57. 9倍，同时正常胃肠道比其它组织器官具有相对较低水平的VPACl表达，使得VPACl成为一潜在的CRC分子影像诊断和靶向治疗的理想靶标。但目前结直肠癌VIPR分子显像常用的分子探针主要为VIP或VIP类似物，缺乏对VPACl的高选择性，同时存在一定的促肿瘤增殖的风险。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种多肽，其和血管活性肠肽I型受体有高亲和力。为实现上述目的，本发明的技术方案为血管活性肠肽I型受体的高亲和力结合多肽，所述高亲和力结合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示，即“GFRFGALHEYNS”，氨基酸大写字母简写的对照表，参照实施例。对上述物质进行了高效液相色谱和质谱分析，确定了该高亲和力结合多肽，该高亲和力结合多肽为如图8所示的高亲和力多肽。进一步，所述高亲和力结合多肽在N-末端引入Gly- (D) -Ala-Gly-Gly-Aba进行修饰。其中，(D)指第二位的Ala为右旋丙氨酸。进一步，所述高亲和力结合多肽用99mTc标记。其标记率为(95. 86±0. 83) %，比活度为(38. 62±0. 32)TBq/mmol0本发明的另一目的在于提供所述多肽的新两种应用，血管活性肠肽I型受体的含量提供了新的思路。为实现上述目的，本发明的技术方案为所述的高亲和力结合多肽在制备血管活性肠肽或血管活性肠肽类似物的竞争性抑制剂中的应用。通过血管活性肠肽I型受体的高亲和力结合多肽与噬菌体克隆竞争抑制ELISA实验证实，其抑制率高。进一步，所述的高亲和力结合多肽在制备结直肠癌体外诊断试剂中的应用。通过"mTc标记多肽在动物体内分布及荷瘤动物显像证实，该标记多肽能够像其它多种结直肠癌分子显像剂一样灵敏探测结直肠癌，并且体内动力学及稳定性更优。所述的高亲和力结合多肽在制备造影剂中的应用。本发明的有益效果在于所述高亲和力结合多肽与阳性克隆竞争结合的IC5tl约为
0.0132 u mol/L,而天然配体VIP与阳性克隆竞争结合的IC5tl约为2. 7327 u mol/L，表明高亲和力结合多肽具有比VIP更高的亲和力。所述高亲和力结合多肽用99mTc标记。所述高亲和力结合多肽用"mTc标记，其标记率为95. 86±0. 83) %,比活度为(38. 62±0. 32)TBq/mmol o
图I为逆转录PCR结果图。图2为免疫荧光结果图。图3为噬菌体回收滴度曲线图，其中Mp代表膜结合，INp代表细胞内化部分，CHO-Kl代表阴性细胞结合部分。图4为噬菌体克隆与阳性细胞结合的ELISA分析图，每个克隆的左侧柱柱代表阳性细胞CH0-K1/VPAC1，第二条柱右侧柱代表阴性细胞CHO-Kl细胞，星号代表p < 0. 05。图5为多肽VPl与阳性噬菌体克隆的竞争结合分析图。图6为阳性克隆与VIP竞争结合分析图。图7为所述高亲和力结合多肽高效液相色谱纯化图。图8为所述高亲和力结合多肽的质谱鉴定图。图9为修饰后的所述高亲和力结合多肽高效液相色谱纯化图。图10为修饰后的所述高亲和力结合多肽的质谱鉴定图。图11为被99mTc标记后的所述高亲和力结合多肽在正常动物体内分布图，其中，图示说明各器官柱图从左至右依次代表I、5、10、30、60、120、240min测得的放射性计数。图12为被99mTc标记后的所述高亲和力结合多肽在正常动物体内分布显像图，图像中各主要器官已由箭头标示出。图13为被99mTc标记后的所述高亲和力结合多肽在荷瘤动物显像图，图中箭头示肿瘤影像，从左至右依次为0. 5、1、2、4、6小时影像图14为被99mTc标记后的所述高亲和力结合多肽在荷瘤动物体内竞争结合显像影像。
具体实施例方式主要材料与试剂噬菌体随机十二肽库试剂盒(包括噬菌体随机十二肽库，肽库滴度2X 1013pfu/ml，复杂度2. 8X IO9，E. coliER2738宿主菌以及_96gIII测序引物)购自New England Biolabs公司；中国仓鼠卵巢细胞亚株CHO-Kl购自中科院上海细胞库；G418购自 Invitrogen ;抗 VPACl 单克隆抗体购自 Santa Cruz Biotechnology ；PrimeScript RTreagent Kit试剂盒购自TaKaRa ；FITC标记山羊抗兔IgG购自中杉金桥；HRP_抗M13单克隆抗体购自GE Healthcare ;细胞培养基及胎牛血清购自Hyclone。实施例I血管活性肠肽I型受体的高亲和力结合多肽筛选一、构建稳定表达VPACl的CHO-Kl细胞I 方法用体积分数为10%胎牛血清的DMEM高糖培养基将CHO-Kl细胞置37°C，5% CO2孵箱常规培养，待细胞生长融合至85%左右时，传代接种96孔板，次日，加不同浓度梯度的G418筛选(详见百度文库)培养基，观察两周，确定G418最佳筛选浓度为700iig/ml。
将真核重组表达质粒载体pcDNA3. I (+) /VPACl进行酶切线性化，回收纯化，按转染试剂盒说明转染CHO-Kl细胞(24孔板，2X IO5/孔)，加入体积分数10%胎牛血清DMEM高糖培养基置37°C，5% C02孵箱培养。转染第三天在培养基中加入700ii g/ml G418筛选一周，每3天更换一次培养液，一周后用胰酶将单独的细胞群消化收集到新的24孔板培养，继续用700 u g/mL的G418筛选一周，挑选生长良好的细胞克隆继续在200 u g/ml G418培养基中维持培养约一个月。取挑选出的细胞株扩大培养，按照RNA抽提试剂盒说明提取总RNA，按TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit试剂盒说明进行反转录，根据设计的特异性引物检测目的基因VPACl的表达(引物正义链5 ' cccattgcctgtggtttg 3',反义链5 ' cctggaaagaccccacgac 3 ')。取待测细胞做细胞爬片，固定封闭后，加入兔抗人VPACl (Santa Cruz Biotechnology, sc-30019,效价为 I : 100)单抗 4°C孵育过夜，次日滴加二抗FITC标记山羊抗兔IgG(中杉金桥，ZF-0311，效价为I 100)，DAPI衬染核，封片后用激光共聚焦显微镜观察目的蛋白VPACl表达。2 结果VPACl在CHO-Kl细胞的稳定表达I)逆转录PCR结果挑取稳定生长的细胞克隆，扩大培养，提取总RNA，反转录之后以VPACl目的基因设计的特异引物进行PCR(引物正义链5 ' cccattgcctgtggtttg 3 ',反义链5' cctggaaagaccccacgac 3'),观察阳性细胞能扩增出特异性的目的条带,表明目的基因VPACl在CHO-Kl细胞有稳定表达(图I)。2)免疫荧光结果通过免疫荧光，可以直接观察到目的蛋白VPACl在阳性细胞表达情况，图2(A、B)显示在阳性细胞膜膜和胞质内有较强的荧光信号，表明有大量目的蛋白VPACl表达，而对照未转染的CHO-Kl细胞未检测到目的蛋白的表达(图2C、D)，说明VPACl已在转染后的阳性细胞稳定表达。二、基于噬菌体随机十二肽库的全细胞差减筛选I 方法培养CH0-K1/VPAC1及CH0-K1细胞生长汇合至85%左右，用体积分数为I %的BSA的无血清培养基培养1-2小时，PBS洗涤I次，以体积分数为0. 25%胰酶消化CHO-Kl细胞，IOOOrpm离心去上清后用3mL PBS-BSA重悬封闭15分钟，并计数细胞约I X IO7,同时取10 u I噬菌体十二肽库(滴度约2. OX IO11Pfu)同样用PBS-BSA封闭15分钟，加入500 U I蛋白酶抑制剂于细胞封闭悬液混匀，于37°C缓慢震荡孵育I. 5小时；孵育结束前适时消化阳性CH0-K1/VPAC1细胞并用同样条件封闭，计数阳性细胞约IO6-IO7,将上述阴性细胞孵育液1500rpm离心2分钟；上清加入已封闭好的阳性CHO-K1/VPAC1细胞，4°C缓慢震荡孵育I小时，1500rpm离心2分钟，细胞沉淀用2ml体积分数为0. I % TBST洗涤2次，3分钟/次，最后用PBS-BSA洗涤I次去除TBST ;细胞结合的噬菌体用2. Oml酸洗脱缓冲液(0. 2mol/LGlycine-HCl，pH 2. 2，I. Omg/mlBSA)冰上洗脱 8 分钟，立即用 300 U I 中和缓冲液(I. Omol/L Tris-HCl, PH9. I)中和，1500rpm离心2min，小心收集上清中和洗脱液并准确计量；细胞沉淀用细胞裂解缓冲液(0. 1% Triton 2. 0ml, 500 U I蛋白酶抑制剂)室温裂解细胞30分钟，并准确计量细胞裂解液体积，收集内化进入细胞的噬菌体；分别取10 Ul中和洗脱液及细胞裂解液测滴度，剩余用作扩增，测滴度(结果详见表1)，分别取I. OX IO11Pfu的中和及裂解扩增噬菌体共同混合投入到下一轮筛选，重复进行四轮筛选，TBST浓度逐轮增加至
0.5%，洗涤时间增至5分钟/次,洗涤次数增至7次，阴性细胞孵育时间逐轮增至2小时，阳性细胞孵育时间逐轮减至30分钟，其余条件同第一轮筛选。各轮筛选得到的回收噬菌体及扩增液均铺制LB/IPTG/X-gal平板利用蓝斑形成实验测定滴度，并计算每轮回收率。经过第四轮筛选后，将回收得到的细胞结合及内化的噬菌体稀释合适的滴度铺制LB/IPTG/X-gal平板，37°C培养过夜后，分别随机挑取20个分隔良好的蓝斑，扩增纯化，加入50%甘油保存于-20°C，待后续测序及相关鉴定用。2 结果以实施例I制备的稳定表达VPACl的CHO-Kl细胞为靶细胞，未转染的CHO-Kl细胞作为吸附细胞，共进行四轮全细胞差减筛选，每轮保持投入的噬菌体量相同。经过四轮筛选可见回收噬菌体滴度及回收率有明显增加，细胞结合及内化噬菌体均得到显著的富集，而吸附细胞CHO-Kl所结合噬菌体保持低水平滴度并有所下降(表I和图3)。从表I亦可看出，随着筛选轮次增加，阳性细胞结合噬菌体回收率从第一轮2. 978X 10_6增加到第四轮
1.538X 10_3，增加了约516. 5倍，回收噬菌体得到了明显富集。表I各轮噬菌体回收滴度及回收率
权利要求
1.血管活性肠肽I型受体的高亲和力结合多肽，其特征在于，所述高亲和力结合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.根据权利要求I所述的高亲和力结合多肽，其特征在于，所述高亲和力结合多肽在N-末端引入Gly-Ala-Gly-Gly-Aba进行修饰，其中，位于第二位的Ala为右旋丙氨酸。
3.根据权力要求2所述的高亲和力结合多肽，其特征在于，所述高亲和力结合多肽用99mTc标记。
4.权利要求1-3任一项所述的高亲和力结合多肽在制备血管活性肠肽或血管活性肠肽类似物的竞争性抑制剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的高亲和力结合多肽在制备结直肠癌体外诊断试剂中的应用。
6.权利要求1-3任一项所述的高亲和力结合多肽在制备造影剂中的应用。
全文摘要
本发明涉生物技术领域，特别涉及血管活性肠肽1型受体的结合多肽，血管活性肠肽1型受体的高亲和力结合多肽，所述高亲和力结合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示；所述的高亲和力结合多肽在制备血管活性肠肽或血管活性肠肽类似物的竞争性抑制剂中的应用；所述高亲和力结合多肽与阳性克隆竞争结合的IC50约为0.0132μmol/l，而天然配体VIP与阳性克隆竞争结合的IC50约为2.7327μmol/l，表明高亲和力结合多肽具有比VIP更高的亲和力；所述高亲和力结合多肽用99mTc标记；所述高亲和力结合多肽用99mTc标记，其标记率为(95.86±0.83)％，比活度为(38.62±0.32)TBq/mmol。
文档编号C07K7/08GK102796175SQ20121028726
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月14日 优先权日2012年8月14日
发明者李前伟, 唐波, 黄定德, 郑磊 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院