一种glp-1受体激动剂的受体亲和力测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及受体亲和力测定方法，具体涉及一种GLP-1受体 激动剂的受体亲和力测定方法。
【背景技术】
[0002] 肠促胰岛素是指人体在进食后由肠道分泌的一类可引起降血糖效应多肽的总称。 由肠促胰岛素引起的胰岛素分泌约占其分泌总量的50%~70%。近年来，以胰高血糖素样 肽-l(GLP-l)为代表的肠促胰岛素类药物在糖尿病治疗领域受到广泛关注。GLP-1与其受 体结合后可激活与之偶联的G蛋白，增加细胞内cAMP浓度并激活蛋白激酶A(PKA)，由此上 调0细胞内胰岛素基因的转录和翻译，从而增加胰岛素分泌量并增强葡萄糖刺激信号的 敏感性，发挥降糖效果。由于其降血糖效应具有血糖依赖性，因而将GLP-1用于II型糖尿 病治疗时所诱发低血糖的风险极低，是一项非常重要的安全特性。此外，GLP-1还可以通过 抑制胰高血糖素的分泌、抑制肠蠕动、减少胃排空、促进胰岛0细胞的增殖与分化并抑制 其凋亡等方式来调节血糖。然而，GLP-1在人体内易被二肽基肽酶IV(DPP-IV)降解，体内 半衰期不足5min，这在很大程度上限制了其在临床上的应用。GLP-1受体激动剂可与体内 广泛分布的GLP-1受体（GLP-1R)结合，发挥与GLP-1类似的药理作用，这使得GLP-1R激动 剂成为一类治疗II型糖尿病的理想的候选药物分子。
[0003] Exendin-4是从美洲巨蜥的唾液中提取的一种由39个氨基酸构成的GLP-1类似 物，与哺乳动物体内的GLP-1具有53%的同源性，是一种天然的能够抵抗DPP-4降解的 GLP-1R激动剂。由于Exendin-4与GLP-1R具有更高的亲和力，因而能发挥更为显著的降 血糖作用；同时Exendin-4在体内能够发挥比GLP-1更持久的生物学活性。人工合成的 Exendin-4,商品名为Byetta，是由美国艾美林公司（Amylin)和礼来公司（Eli Lilly)联合 开发的皮下注射液，于2005年获FDA批准上市，作为磺脲类及二甲双胍等药物治疗不能达 标的II型糖尿病患者的辅助用药。但由于该药物仍然存在着体内半衰期较短（2. 4h)，用药 次数频繁（一天用药两次）等问题，使其在临床上的应用也受到了一定程度的限制。
[0004] 由此可见，开发亲和力更高、性质更优良，作用时间更长的新型GLP-1R激动剂具 有重要的临床意义和巨大的市场潜力。为此，药物研发人员针对GLP-1和Exendin-4分子， 进行了大量的化学改构与修饰等方面的研宄，同时非肽类的小分子GLP-1受体激动剂的研 发也取得了一定的成果。随着大量来源不同，物理化学性质各异的GLP-1受体激动剂被开 发出来，对高效、准确地评价和筛选GP1-R激动剂类药物的方法提出了新的要求，而基于 GP1-R激动剂的受体亲和力的测定是快速，高通量筛选此类药物的一项重要依据。常用的 测定方法包括以下三类：（1)基于放射性同位素受体配体结合的原理，将同位素标记的药 物分子和原型分子共同作用于高表达GLP-1R的细胞，通过检测最总结合到细胞上的放射 性强度来计算出药物的亲和力，但该方法依赖于同位素标记技术，且对人体有一定的伤害。 (2)以酶联免疫分析吸附试验（ELISA)、均相放射免疫闪烁迫近分析法为代表的针对GPCR 信号通路中第二信使cAMP/cGMP的检测，能够实现对单一靶点的单一功能分析，但专属性 较差，可能会存在细胞内源性的干扰作用。（3)报告基因测定法：基于GLP-1R及相关信号 通路的功能测定可作为高通量筛选GLP-1R激动剂类药物的重要手段。与传统的受体功能 检测法相比，该法能够区分激动剂和拮抗剂，是筛选受体激动剂和拮抗剂的有效方法。目前 常用的报告基因有：氯霉素乙酞转移酶，碱性磷酸化酶，P-半乳糖昔酶，绿色荧光蛋白和荧 光素酶等。荧光素酶（Luciferase)是一类能够催化不同底物发生氧化作用并伴随发出生 物荧光的酶，其检测速度快，灵敏度高、稳定性好、线性范围广等优点，具有其他报告基因无 可替代的优势。
[0005] 本实验室前期研宄中，基于G蛋白偶联受体介导的信号通路和荧光素酶报告基因 检测技术，通过重组质粒构建、脂质体转染及加压筛选等手段，获得了能稳定共表达萤火 虫荧光素酶与GLP-1R，并能特异性响应GLP-1R介导的cAMP响应元件（CRE)的工具细胞 株--CH0-GLP-1 R-CRE-Luc+。
[0006] 利用荧光素酶报告基因法所构建的细胞筛选模型，建立GLP-1R激动剂的受体亲 和力测定方法，从而对其进行评价与筛选，可作为此类药物早期研发与筛选过程中的一种 有效措施。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题在于提供一种GLP-1受体激动剂的受体亲和力测定方 法。本发明基于荧光素酶报告基因法，通过因素考察与优化，建立了一种测定GLP-1R激动 剂的受体亲和力的方法，可用于GLP-1R激动剂的快速评价与筛选。
[0008] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0009] 利用CH0-GLP-1R-CRE-LUC+细胞，测定GLP-1R激动剂的受体亲和力的实验步骤如 下：
[0010] ⑴细胞的复苏及传代：
[0011] 从液氮罐中取出冻存的CH0-GLP-1R-CRE-LUC+细胞，将细胞快速融化复苏后，转入 含5mL细胞生长培养基的培养瓶中，于37°C、5% C02培养箱中培养。待细胞贴壁生长后，用 0. 25%胰蛋白酶消化传代，每3天按1 : 3比例传代1次。
[0012] ⑵细胞接种与培养：
[0013] 取处于对数生长期的细胞用0. 25%胰酶消化，1000r/min离心5min，弃上清，将细 胞重悬于含0. 25% FBS(胎牛血清）的DMEM/F12基础培养基中，记数。将细胞悬液稀释至 一定浓度后，以100 U L/孔接种于96孔板。于37°C、5% C02培养箱培养4h。
[0014] (3)待测样品溶液的配制与稀释：
[0015] 配制待测样品溶液，通过BCA法测定其浓度，以含有0. 25 % FBS的DMEM/F12培养 基对对待测样品按倍比依次稀释，得到10-11个不同浓度梯度。
[0016] (4)待测样品作用于细胞：
[0017] 将上述不同浓度梯度的待测样品，按每孔20 yL加至细胞培养板中，每个待测样 品的浓度设置3个平行复孔，于37°C、5% C02培养箱培养。
[0018] (5)荧光素酶与化学发光底物作用：
[0019] 将化学发光底物与含有细胞裂解液的底物缓冲液（均购自Promega公司）混匀。 以每孔100 y L加至上述孵育后的细胞板中。室温下，在振荡器上震荡一定时间后转移至96 孔酶标板中。
[0020] (6)荧光强度测定：
[0021] 使用化学发光分析仪（Luminoskan Ascent，Thermo Scientific)，以 Is/孔的速 度读取各孔的荧光强度，以相对光单位（RLU)表示。
[0022] (7)数据处理：以所测样品的摩尔浓度的对数值（Log[M])为横坐标，所测各样品 孔的荧光强度（RL值）为纵坐标绘制量效曲线。并通过软件GraphPad Prism 5.0非线性 拟合中的Dose-response-Stimulation模式对量效曲线进行参数拟合，计算样品的半数有 效浓度（EC 5Q)。
[0023] 其中，步骤（1)中的细胞生长培养基是在DMEM/F12基础培养基中，添加10% FBS、 0? 6mg/mL潮霉素B和lmg/mL G418配制而成的。
[0024] 其中，步骤（2)中的DMEM/F12基础培养基的配制方法如下：DMEM/F12培养基干粉 一袋（Gibco)，碳酸氢钠1. 201g、链霉素钠0. lg、氨节西林0. 06g，溶解于超纯水中并定容至 1L，于超净工作台内过滤除菌。
[0025] 其中，步骤⑵中接种于96孔板中的细胞密度的范围为：2X 104-4X 104个/mL，优 选为3X104个/mL。
[0026] 其中，步骤（3)中待测样品的浓度范围为：1X l(T4-2. 4X 104nM。
[0027] 其中，步骤⑷中加入的待测样品与细胞的作用时间范围为2_6h，优选为4h。
[0028] 其中，步骤（5)中细胞经裂解后，其与化学发光底物的作用时间范围为： 10min-lh，优选为 15min〇
[0029] 其中，步骤（7)中由原始数据绘制而成的量效曲线采用四参数法拟合并计算EC5(i 值。
[0030] 本方法的精密度和准确度较高，同时专属性强，耐用性良好，可用于测定GLP-1R 激动剂的受体亲和力，以实现对该类药物的快速评价与筛选。
【附图说明】：
[0031] 图1为几种不同的GLP-1受体激动剂的受体亲和力测定的拟合曲线。
[0032] 图2为以mPEG2Qk-Ex4C为测试样品，本方法的方法学验证中专属性考察试验所得 的拟合曲线。其中，a :不添加CH0-GLP-1R-CRE-Luc+细胞试验；b :阴性对照细胞株试验；c : 空白溶剂试验；d :PEG干扰试验。
[0033] 图3为以mPEG2(lk_Ex4C为测试样品，本方法的方法学的方法学验证中线性与范围 考察试验所得的拟合曲线。
[0034] 图4为以mPEG2Qk-Ex4C为测试样品，本方法的方法学验证中准确度考察试验所得 的拟合曲线。
[0035] 图5为以mPEG2Qk-Ex4C为测试样品，本方法的方法学验证中耐用性考察试验所得 的拟合曲线。其中，a :细胞密度考察试验；b :药物与细胞作用时间考察试验；c :细胞裂解液 与发光底物不同作用时间考察试验；d :细胞代数考察试验。
【具体实施方式】
[0036] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但不意味着以任何方式限制本发明的范 围。
[0037] 实施例
[0038] 用本法测定5种不同种类的GLP-1R激动剂的受体亲和力
[0039] 5种GLP-1R激动剂为：Exendin-4和4种不同分子量的聚乙二醇定点修饰 Exendin-4类似物的产物。通过在Exendin-4的C端加入一个半胱氨酸等到Exendin-4 类似物（简称Ex4C)，分别使用分子量为5kDa、10kDa、20kDa和40kDa的单甲氧基聚乙二 醇-马来酰亚胺（mPEG-MAL)与Ex4C反应后经纯化得到4种修饰产物，分别为mPEG 5k-Ex4C、 mPEG1(lk-Ex4C、mPEG2Qk-Ex4C和mPEG 4Qk-Ex4C。以上5种GLP-1R激动剂的受体亲和力的测定 步骤如下：<