促进血管新生的甲状腺激素类似物的制作方法

专利名称：促进血管新生的甲状腺激素类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及到甲状腺激素，甲状腺激素类似物和它的衍生物，和它的聚合物形态。使用这些化合物的方法和包含它们的药物组合物也被公开。本发明也涉及到制备这些化合物的方法。

背景技术：
甲状腺激素，L-甲状腺素(T4)和L-三碘甲状腺氨酸(T3)，在脊椎动物不同组织中调节许多不同的生理学的过程。甲状腺激素的大部分作用是通过甲状腺激素受体(“TR”)作媒介的，TR是活性配基转录调节子的核受体总科的一员。这个总科也包括类固醇激素，类维生素A，和1，25-二羟基维生素D3的受体。这些受体是能调节各种各样的组织中特殊基因的表达的转录因子并且能够作为普遍使用的药物的目标，所述的普遍使用的药物例如它莫西芬，一个雌激素受体部分拮抗物。有两个不同的基因，他们编码两个不同的TR，即TRα和TRβ。这两个TR经常在不同的组织里在不同的水平上共表达。大部分的甲状腺激素不会区别这两个TR并都以相似的亲和力结合。
在老鼠身上的基因敲除研究表明TRβ在听觉系统的发育和通过垂体内的T3的甲状腺有刺激性的激素的负反馈中发挥作用，而TRα调节热量产生和心血管系统的甲状腺激素的效果。TR拮抗物的鉴定在将来甲状腺功能减退症的治疗过程中起到很重要的作用。通过直接拮抗在受体水平上甲状腺激素的效果，这些分子可以迅速地见效，这对于需要外科手术、有心脏病，或处在威胁生命地甲状腺毒性风暴的危险中的患者是一个显著地进步。因此，保留了化合物的发展的需要，这些化合物通过甲状腺激素受体(TRs)的相同形态选择性的激动药剂或拮抗物起作用来有选择性的调节甲状腺激素行为，将证明对医学治疗是有用的。近来的成就集中在作为潜在的治疗药剂和化学探针的甲状腺激素(T3/T4)拮抗物设计和合成上。这也需要拟甲状腺素药的化合物的发展，这比天然的激素和潜在的有用的受体结合与激活性质更容易达到。
甲状腺激素受体优选地结合3，5，3’-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)，一种来自组织循环的L-甲状腺素(T4)的脱碘作用的激素类似物。可是，作为独立的TR，T4和T3激活胞内信号转导级联的能力，最近已被几个实验室所描述。作为独立的TR起作用，甲状腺激素也调节突触体的质膜Na+/H+交换器，Ca2+-刺激的ATP酶，集合其他的离子泵或渠道，和GTP酶的活动。从这几个实验室的研究证明了甲状腺激素激活MAPK信号转导级联的能力。这些途径有代表性地被通过细胞表面的物理和化学信号激活。尽管甲状腺激素同质膜结合的动力学和类似物专一性已经被重复地报道，但是造成这些对于甲状腺激素TR独立的活动的细胞表面受体在以前还没有确定过。
我们实验室已经指出，在缺少功能性的TR的CV-I猴子成纤维细胞图线和其他的细胞里，T4激活促细胞分裂剂激活的蛋白激酶(MAPK；ERK112)信号的级联和促进MAPK的磷酸化作用和核易位，它比接下来的T4的生理学浓度的应用早10min。在甲状腺激素处理的细胞的核片断里，我们描述了有活性的MAPK和反式激活的核蛋白，它们是MAPK的丝氨酸激酶活性的底物。这些蛋白包括转录(STAT)-1α、STAT3、p53、雌激素受体(ER)-α和在包括TR细胞里，T3(TRβ1)的核甲状腺激素受体的信号的变换器和激活剂。这些蛋白的甲状腺激素控制的MAPK依赖的磷酸化作用增强了他们转录的能力。MAPK信号转导途径的抑制剂和四碘化甲状腺乙酸(tetrac)能够阻止T4诱导的MAPK活化作用效果，其中四碘化甲状腺乙酸(tetrac)是一种抑制Tq结合到细胞表面的甲状腺激素类似物。甲状腺激素活化的MAPK也可能作用在质膜上，例如，在N+/H+反向转运，胜于转移到细胞核的时候。目前还没有被确定与MAPK级联的活化作用相连接的T4的细胞表面受体。
整合素是一类横跨膜的糖蛋白，这种糖蛋白能够形成没有共价键的异二聚体。整合素的胞外区域与各种配体相互作用，这些配体包括胞外基质糖蛋白和细胞骨架连接到细胞内的区域。十年前甲状腺激素就被指出其影响整合素和胞外基质蛋白、层粘连蛋白的相互作用，但是机制还不清楚。整合素αVβ3有大量的胞外蛋白配体，包括生长因子，并且与配体结合能激活MAPK级联。一些整合素包含一种Arg-Gly-Asp(″RGD″)识别位点，它对基质和其他包含Arg-Gly-Asp序列的胞外蛋白的配合是非常重要的。
因此，非常希望鉴别和提供一个被甲状腺激素，或其类似物和聚合物处理过细胞内MAPK信号级联的初始位点，从而为调节生长因子和其他的多肽(它们的细胞表面受体聚在初始位点周围)提供方法。
据估计在美国有五百万人经受着慢性的稳定的咽炎的折磨。每年有200,000位65岁以下的人死于术语上所谓的“过早的缺血性心脏病”。尽管有医学治疗，许多人继续遭受着心肌梗塞和衰弱综合症，促进了采用经皮腔内冠状动脉血管成形术或冠状动脉旁路手术来重建血管的需要。假定救助心肌缺血的一条途径就是增强冠状侧枝循环。
在心肌梗塞的急性过程中体内冠状溶栓治疗的时可见的冠状侧副管(″collaterals″)在解剖学上的出现和肌酸激酶时间-活性曲线、梗塞尺寸和动脉瘤形态间的相互关系现在已被建立。这些研究证实了有冠状阻碍疾病的心脏中的冠状侧副管的保护性作用，与冠状侧副管不可见的患者相比较，显示较小的梗塞，较小的动脉瘤形状和改善的心室功能。当心脏的肌细胞呈现缺血性，冠状侧副管通过伴随着DNA的复制与内皮平滑肌细胞的有丝分裂的生长发展很活跃。一旦缺血发展，这些因子被激活并为受体占据变得可利用，在暴露到外源肝素后它可能引起血管新生。不幸的是，通过血管新生的发生，这个“自然”的过程不足以在几乎所有的有冠状动脉疾病的患者体内治愈缺血。
在缺血的过程中，通过ATP的分解腺苷被释放。腺苷参与许多保护心脏的生理学活动。腺苷在血液动力学的变化中起作用，例如心动过缓和血管舒张，并且已被证明腺苷在例如预处理和再灌注损伤中的可能性还原这样的不相关的现象中起作用(Ely andBerne，Circulation，85893(1992)。
血管新生是在已存在的血管上发展新的血管(Mousa，S.A.，Inangiogenesis Inhibitors and StimulatorsPotential TJierapeuticImplications，Landes Bioscience，Georgetown，Texas；Chapter1，(2000))。生理学上地，血管新生保证成熟生物体适当地发展，为卵植入子宫做好准备，并在伤口愈合起关键的作用。胚胎发生或正常情况和血管新生过程中血管网络的发展依靠生长因子和有胞外基质的细胞间的相互作用(Breier et al.，Trends in CellBiology 6454-456(1996)；Folkman，Nature Medicine 127-31(1995)；Risau，Nature 386671-674(1997)。在胚胎发生过程中血管通过两个途径产生血管发生和血管新生(Blood et al.，Bioch.Biophys.Acta 103289-118(1990)。血管新生是通过平衡前血管新生因子和抗血管新生因子进行控制的多步骤过程。这个过程的最后阶段包括内皮细胞的增殖和机体化形成管状结构。生长因子，比如FGF2和VEGF，被认为是促进内皮细胞生长和分化的关键参与者。
血管新生是一种复杂的过程，包括血管生长因子(PCarmeliet，Ann NY Acad Sci 902249-260，2000)，胞外基质，粘附分子和代谢因素(RJ Tomanek，GC Schatteman，Anat Rec 261126-135，2000)的本地释放。血管内部的机械力也可能起作用(OHudlicka，Molec Cell Biochem 14757-68，1995)。在新血管生长中涉及的内生生长因子的主要种类是成纤维细胞生长因子(FGF)家族和血管内生生长因子(VEGF)(G Pages，Ann NY Acad Sci902187-200，2000)。促细胞分裂剂激活的蛋白激酶(MAPK；ERK1/2)信号转导级联涉及到VEGF基因表达和血管内皮细胞增殖的控制。
固有的腺苷可以促进冠状流动响应而增加心肌氧的需要，从而调节心肌流动储备(Ethier et al.，Am.J.Physiol.，H131(1993)，这证实了生理学浓度的腺苷加入到人脐静脉内皮细胞培养物中，可能通过一种表面受体刺激增殖。腺苷可能是人内皮细胞生长因子和可能的血管新生因子。血管新生出现是为了保护患有例如冠状动脉疾病(“CAD”)的阻碍血液流动疾病的患者，但是血管生长的自然速率不足以治愈疾病。因此，增强和加速体内的自然的血管新生潜能的策略对患有CAD的病人是有好处的。
同样地，伤口愈合在许多发展中国家和地区是一个主要问题，且随着不断增加的各种各样的环氧合酶-2(CoX2)的使用糖尿病患者的伤口愈合能力被削弱且患有慢性炎症。血管新生对伤口修复是必要的，因为新血管提供营养支持活动的细胞，促进肉芽组织形成和促进残余物的清除。大约有60％的肉芽组织物由血管组成，它也提供了必要的氧来促进修复和血管的生长。它很好的证明了血管新生因子存在于伤口流体中且当血管新生抑制修复时促进修复。伤口血管新生是一种复杂的多步骤的过程。尽管对许多血管新生因子有详细的了解，但是在定义这些因子的来源，及包括在伤口血管新生中的调节活动方面，以及在促进修复的血管新生刺激物的临床使用方面进展很小。依赖于伤口的深度，伤口的类型(烧伤，创伤，等等)和位置(肌肉，皮肤，骨头，等等)的不同，修复机制和介质很可能是不同的，这一事实使对伤口血管新生的理解进一步复杂化。患者的情况和年龄(糖尿病患者，截瘫患者，类固醇治疗患者，年龄较大的婴幼儿，等等)也能决定血管新生因子修复和应答的速率。病人的性别和激素状态(绝经期前，绝经期后，等等)也会影响修复的机制和应答。削弱伤口愈合尤其会影响美国年龄较大的和1400万糖尿病患者中的许多人。因为减少血管新生经常是导致这些患者中伤口愈合难题的因素，定义伤口愈合中的重要的血管新生因子和发展阻止和/或纠正削弱的伤口愈合是很重要的。
因此，对通过血管新生试剂进行有效的治疗存在需要，在这里，血管新生试剂可以作为主要的或附加的治疗，以最小的副作用来促进伤口愈合，冠状血管新生或其它与血管新生相关的疾病。这种治疗对患有血管异常例如心肌梗死，撞击或外围的动脉疾病的患者特别有用，并且可以用来预防患有不良冠状循环的患者，其中，不良冠状循环使患者患有缺血和心肌梗死的高的危险。
甲状腺激素、类似物和聚合结合物在大脑的发育中有重要的作用。不断增加的证据表明在早期发育阶段聚合的甲状腺激素的缺失导致中枢神经系统中结构和功能的不足，但是这个潜在的精确的机制仍然难以明白。
哺乳动物的神经系统包括一种外围的神经系统(PNS)和一种中枢神经系统(CNS，包括大脑和脊髓)，且包括两种主要种类的细胞神经元细胞和神经胶质细胞。神经胶质细胞填满了神经元间的空间，滋养着他们并调节他们的功能。特定的神经胶质细胞，例如PNS中的Schwann细胞和CNS中的少突胶质细胞，也提供了一个髓鞘环绕在神经系统周围。髓鞘能沿着神经元迅速传导。在外围神经系统中，多重神经元的轴突可以捆在一起从而形成神经纤维。这些，依次相继地，可能结合到肌束或纤维束中。
在发育过程中，从中枢和外围的神经系统分化的神经元送出轴突，它生长并与特定目标细胞相联系。在一些情况下，轴突必须覆盖很大的距离；一些生长到外围，而其它的被限制在中枢神经系统中。在哺乳动物中，在生命的胚胎期神经形成的这个阶段是完全的，一旦它们完全分化神经元细胞不繁殖。
已经确认，一种神经病宿主能够影响神经系统。神经病可以影响神经元本身或相关联的神经胶质细胞，可以导致细胞代谢功能障碍，感染，暴露给毒物，自身免疫，营养不良，或缺血。在一些情况下，细胞的神经病被认为直接导致细胞死亡。在其它的情况下，神经病可以导致足够的组织坏死来刺激身体的免疫/炎症系统和对初始损伤的免疫应答然后摧毁神经通路。
由CNS轴突的损坏导致的神经通路损坏的地方，自体固有的外围神经移植被用于中枢神经系统从而连接损害并允许轴突使它回到它们正常的目标区域。与CNS神经元相比较，外围神经系统的神经元在对轴突损坏的应答时能延伸新的外围过程。外围神经系统轴突的这个再生的特性足够允许这些片段移植给轴突。但是成功的移植被许多的因素限制，这些因素包括关于发生在细胞体附近的成功的移植的旁路的CNS轴突损坏的长度，和从CNS神经细胞体到移植点的距离。
在外围神经系统内，神经元的这种细胞可再生性对一种受损的神经路径的修复功能有限制能力。特别地，新的轴突随机地延伸，且经常误导与不合适的目标联系，而导致反常的功能。例如，如果一种运动神经被损坏，再生的轴突可能联系错误的肌肉，导致瘫痪。另外，严重的神经过程导致一个比几毫米还长的间隙，例如大于10毫米(mm)，或者是由于神经再生无法生长必要的距离，或者是由于轴突生长错误的方向，不会发生适当的神经再生。通过外科手术的方法来修补外围神经损伤的努力会遇到多种结果，尤其是在损伤延伸超过很大距离的地方。在一些情况下，用来得到严重的神经末端正确的排列的缝合步骤刺激创伤组织的表达，所述创伤组织的表达被认为抑制了轴突的再生。即使创伤组织形成的地方已被减少，随着神经指导通道或其它管状修复的使用，成功的再生通常仍限制在距离小于10毫米的神经损伤上。另外，外围神经元很明显地抑制某一位置，在此位置损伤或神经病影响细胞体自身或导致末端轴突的广泛的退化。
哺乳动物神经系统的途径也会遇到由于新生性病变导致的损伤带来的危险。神经元和神经胶质细胞瘤形成已经被鉴定。神经源变形细胞一般失去了它们作为普通分化细胞拥有的能力，并由于功能损失能摧毁神经系统途径。另外，增生扩散的肿瘤可以通过扭曲正常神经组织结构，通过压缩神经系统抑制途径，抑制脑脊液或血液补给流动，和/或通过刺激身体的免疫应答来诱发伤害。肾上腺转移瘤是大脑和脊髓新生性病变的很重要的原因，类似地也可以损坏神经系统途径和诱使神经细胞死亡。
与神经系统的细胞生长，分化和发育相关联的一类形态可调节的分子是细胞粘附分子(“CAM”)，最特别的是神经细胞粘附分子(N-CAM)。这些CAM是免疫球蛋白超级家族的成员。它们通过同种结合，即在并列的细胞上的CAM-CAM结合调节发育或成熟的组织中的细胞与细胞间相互作用。已经确定出大量不同的CAM。其中，被研究的最彻底的是N-CAM和L-CAM(肝细胞粘附分子)，这两种在早期发育阶段的所有细胞上都已被鉴定，在不同的成年组织中也一样被鉴定。在神经组织发育中，N-CAM表达被认为在组织机体，神经元的迁移，神经系统-肌肉组织的粘附，视网膜的形成，突触发生和神经变性中是很重要的。减少的N-CAM的表达也被认为是与神经系统功能障碍相关联。例如，在一种脱髓鞘突变的鼠体内，N-CAM，N-CAM-180的至少一种形式的表达有所减少。Bhat，Brain Res.452373-377(1988)。N-CAM水平的减少也也与脑积水的正常压力和II型精神分裂症有关，分别参见文献Werdelin，Acta Neurol.Scand.79177-181(1989)和Lyons，et al.，Biol.Psychiatry 23769-775(1988)。另外，N-CAM的抗体已表明可中断受损的神经系统中的功能性恢复。Remsen，Exp.Neurobiol.110268-273(1990)。
目前不存在修复运动神经元外在的损伤和运动神经元的疾病导致的损害的令人满意的方法。在美国每年有15,000到18,000新的脊髓损伤的新病例。另外，大约有200,000脊髓损伤患者。每年照顾这些病人的花费超过了7亿美元。伴随急性脊髓创伤的病理生理学是一个复杂的和没有完全弄清楚的机制。机械创伤导致的主要的组织损伤立刻发生且不可逆。Allen，J.Am.Med.Assoc.57878-880(1911)。实验证据表明许多创伤后的组织损伤是作用过程的结果，这一作用过程在损伤后数分钟开始并延续数天或数星期。Janssen，et al.，Spine 1423-32(1989)and Panter，etal.，(1992)。这个严重的，自破坏性的过程包括病理生理学的机制，例如出血，创伤后缺血，水肿，突触和神经元坏死，和伴随胞囊形成和梗死形成的髓鞘化。参见Tator，et al.，J.Neurosurg，7515-26(1991)和Faden，Crit.Rev.Neurobiol.7175-186(1993)。被提议的有害的因子包括电解质变化由此增加的胞内钙引起活动的级联(Young，J.Neurotrauma 9，Suppl.1S9-S25(1992)andYoung，J.Emerg.Med 1113-22(1993))，伴有未受控制的传导物释放的生物化学变化(Liu，et al.，Cell 66807-815(1991)和Yanase，et al.，J.Neurosurg 83884-8 88(1995)，花生四烯酸的释放，自由基的生产，脂质的过氧化反应(Braughler，et al.，J.Neurotrauma 9，Suppl.1S1-S7(1992)，类花生酸生产(Demediuk，et al.，J.Neurosci.Res.20115-121(1988)，内源阿片样物质(Faden，et al.，Ann Neurol.17386-390(1985)，代谢变化包括氧和葡萄糖的改变(Faden，Crit.Rev.Neurobiol.7175-186(1993))，炎症变化(Blight，J.Neurotrauma 9，Suppl.1S83-S91(1992)，和星形水肿(Kimelberg，J.Neurotrauma 9，Suppl.1S71-S81(1992)。在过去的400年里外科手术的方法包括伴随着融合的椎板切除术和减压，其已成为最普通的熟练的处理策略。Hansebout，″EarlyManagement of Acute spinal cord Injury″，pp.181-196(1982)andJanssen，et al.，Spine 1423-32(1989)。但是，这些过程不包括关于增加脊髓组织再生特性的技术的应用。
一种运动神经元疾病的宿主已经被确定，包括髓鞘化疾病，脊髓病，和如肌肉萎缩神经侧索硬化症(“ALS”)这样的运动神经元的疾病。INTERNAL MEDICINE，ch.121-123(4th ed.，J.H.Stein，ed.，Mosby，1994)。多发性硬化(“MS”)是最常见的中枢神经系统的髓鞘化混乱，引起大脑和脊髓内硬化的斑点(例如，斑块)。依赖于斑块的位置和尺寸，多发性硬化有多种临床表现。典型的综合症包括视力的降低，复视，眼震，发音困难，虚弱，感觉异常，膀胱畸形，和情绪的改变。已经提出无数的治疗方法来治疗这种长期变化的疾病。被提议的方法包括从饮食到电击到针灸，情感支持，和免疫抑制疗法的各种形式。没有一个证明是满意的。
在一些疾病(例如，初期的侧面硬化，脊髓肌肉萎缩，良性的局灶性肌萎缩)中发生低级和高级神经元的严重损失。但是，ALS是运动神经元疾病最常见的的形式。低级和高级神经元损失在ALS中都发生。症状包括更严重的骨骼肌肉消瘦，虚弱，gasciculations，和cramping。一些病例主要牵连脑干运动神经元(进行性延髓麻痹)。不幸的是，运动神经元和相关疾病的治疗主要依赖于这点。INTERNAL MEDICINE，ch.123 (4th ed.，J.H.Stein，ed.，Mosby，1994)。
因而，本领域很需要能够治疗运动神经元混乱和损伤，和神经功能的相关的缺陷的办法。因此，本发明的目标在于，为刺激血管新生，诱使神经元分化，和阻止神经元细胞的死亡或退化提供组成物和方法。
酪氨酸在一个(单碘化酪氨酸)或两个(二碘化酪氨酸)位点被碘化，并且然后结合形成有活性的激素(二碘化酪氨酸+二碘化酪氨酸→四碘甲腺原氨酸，[甲状腺素，T4]；二碘化酪氨酸+单碘化酪氨酸→三碘甲腺原氨酸[T3])。包括甲状腺体在内的T3的另一来源是通过含硒酶I型5’-脱碘酶(5’D-I)的T4的外环脱碘作用的结果。甲状腺球蛋白，一种包含T3和T4及其基质在内的糖蛋白，被甲状腺细胞作为胶体微滴从小囊中吸收。
溶酶体包含蛋白酶从甲状腺球蛋白中切开T3和T4，导致游离的T3和T4的释放。碘化酪氨酸(单碘化酪氨酸和二碘化酪氨酸)也从甲状腺球蛋白中释放，但是仅有非常小量到达血流。通过胞内脱碘作用从它们中移去碘，这些碘通过甲状腺体被使用。
通过蛋白水解从甲状腺释放的T4和T3到达血流，为了运输在这它们与结合了甲状腺激素的血清蛋白相结合。主要的甲状腺激素结合蛋白是甲状腺素结合球蛋白(“TBG”)，它有高的亲和力但低的T4和T3的容量。TBG通常约占结合激素的75％。其它的甲状腺激素-结合蛋白——主要的甲状腺素-结合前清蛋白也叫转甲腺素蛋白(“TTR”)，它有很高的亲和性但是低的T4的容量，而清蛋白则由于结合血清甲状腺激素的残留而具有有低的亲和力但高的T4和T3的容量。大约占总血清0.03％的T4和占总血清0.3％的T3是游离的并与结合的激素相平衡。只能利用游离的T4和T3对外围组织起到甲状腺激素作用。
甲状腺激素有两个主要的生理影响(1)它们实质上增加了每个体组织的蛋白合成。(T3和T4进入细胞，在细胞中来源于循环的T3和细胞里由T4转换而来的T3，能够与不连续的核受体相结合并影响mRNA的形成。)(2)通过不断增加Na+，K+-ATP酶(Na泵)活性，T3增加了O2的消耗，这是造成主要在组织中基本的O2消耗的原因(例如，肝，肾，心脏核骨骼肌)。增加的Na+，K+-ATP酶的活力对这个酶的不断合成是次要的；因此，不断增加的O2的消耗也可能与甲状腺激素的核结合有关。但是，线粒体上T3的直接的作用还没有排除。尽管T4本身也可能具有生物学活性，但是T3被认为是有活性的甲状腺激素。
对激素的生物学作用起重要作用的甲状腺素库是游离的甲状腺激素库。通过摄取/释放甲状腺激素进/出细胞和通过甲状腺激素结合蛋白结合/释放甲状腺激素，在短的时间周期内可以确定这个库的大小。这些蛋白的比例和绝对浓度在血浆和脑脊髓的流体(“CSF”)中是不同的。最明确的区别发现是转甲腺素蛋白(“TTR”)，它是仅有的在大脑中合成的结合甲状腺激素的血浆蛋白(Schreiber G，Southwell BR，Richardson SJ.Hormone deliverysystems to the brain-transthyretin.Exp Clin Endocrinol Diabetes.1995；103(2)75-80)。TTR与没有遗传缺陷的人体中其它的两种甲状腺激素-结合血浆蛋白是截然不同的。TTR基因的表达开始于大脑的进化过程中，更早于在肝中的进化过程。与甲状腺素(TR)T4结合相关的TTR的域的结构已经完整地保存了3亿5千万年。这些观察结果表明大脑TTR的特殊功能意义。根据推断这决定了在脑的细胞外的空间游离的T4水平。由特殊的脱碘酶在脑中T4能转换成三碘甲腺原氨酸T3。这种T3在细胞核中可以与受体相互作用，调节基因转录。
阿尔茨海默氏病是一种严重的神经变性的病症，并且当前大约有4百万美国人遭受这个疾病的困扰。随着老年人口增大，除非找到治疗或阻止的办法到下一个世纪的中期这个数目可以达到14百万。目前，还没有对这个疾病的早期诊断的灵敏的和特殊的premortem测试。当前阿尔茨海默氏病是根据认知的降低、伴随着那些症状的其他的可能的原因的系统消除来诊断的。可能的阿尔茨海默氏病的临床诊断的确认只能通过死后的脑的检验来得到。阿尔茨海默氏病的脑特征在于在担负学习和记忆的地区(例如，大脑皮层和海马)出现的两个不同的异常的蛋白质的沉淀物。这些沉淀物是细胞外的类淀粉斑块和细胞内的神经原纤维缠结(“NFTs”)，其中细胞外的类淀粉斑块是阿尔茨海默氏病的特征，细胞内的神经原纤维缠结在其他的神经变性的病症中也可以发现。淀粉状的肽一般是40或42长度的氨基酸(分别是“A1-40”或“A1-42”，)，由一种较大的与膜相关的未知功能的、淀粉状蛋白(“APP”)的蛋白异常的过程形成。普遍认为这些肽的寡聚聚集体能够毒害神经，最终导致突触的退化和神经元的损失。淀粉状的沉淀的数值大致与在死亡时症状的厉害程度相关联。
在过去，进行了一些尝试来设计能被用来作为阿尔茨海默氏病的premortem诊断剂的放射性药物。Bornebroek等表明采用123I标记的淀粉状的关联蛋白血清淀粉状的P组分(SAP)，在带有脑的淀粉状蛋白病的病人的大脑皮层、可能在管壁中以低的水平积累(Bornebroek，M.，et al.，Nucl.Med.Commun.(1996)，Vol.17，pp.929-933)。
Saito等建议通过血-脑屏障输送123I标记的A1-40。据报导碘化了的A1-40在组织切片中结合一种淀粉状的斑块(Saito，Y.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995，Vol.92，pp.10227-10231)。美国专利第5,231,000号公开了带有在阿尔茨海默氏病病人脑中发现的A4淀粉状多肽的专一性的抗体。然而，穿过血脑屏障传递这些抗体的方法还没有被公开。Zhen等描述了结合淀粉状的被称为“刚果红.TM.”的染料改良法，和这些带有锝和铼的改进的分子复合物。传闻声称带有放射性的离子的复合物是阿尔茨海默氏病的可能的成像试剂(Zhen et al.，J.Med.Chem.(1999)，Vol.42，pp.2805-2815)。然而，复合物通过血-脑屏障的潜力是有限的。
美国宾夕法尼亚大学的一个小组(Skovronsky，M.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.2000，Vol.97，pp.7609-7614)开发了刚果红的荧光标记的衍生物，具有脑可透性，而且可以非特异的结合到淀粉状的物质上(也就是说，折叠片构造的肽)。在临床试验前，这种化合物需要被放射性标记然后进行临床前的药物动力学和毒性扫描。相反，我们的发明利用仅自然发生的物质的衍生物或其组合来诊断防止、和治疗阿尔茨海默氏病。Klunk等报道了采用刚果红.TM.、柯胺G(“CG”)的衍生物的试验。据报导CG在活体外较好地结合人造的淀粉状体，并通过正常的老鼠的血-脑屏障(Klunk et al.，Neurobiol.Aging(1994)，Vol.15，No.6，pp.691-698)。Bergstrom等给出了一个带有123I标记的化合物作为阿尔茨海默氏病中的M1和M2型毒蕈碱型乙酰胆碱受体可能的可显影放射性配体(Bergstrom et al.，Eur.J.Nucl.Med.(1999)，Vol.26，pp.1482-1485)。
最近，已经发现带有阿尔茨海默氏病的病人的脑中某些特殊的趋化因子受体上调(Horuk，R. et al.，J.Immunol.(1997)，Vol.158，pp.2882-2890)；Xia et al.，J.NeuroVirol(1999)，Vol.5，pp.32-41)。另外，最近已经表明趋化因子受体CCR1在带有晚期的阿尔茨海默氏病和正常的年龄的脑的病人中均被上调。(Halks-Miller et al，CCR1 Immunoreactivity in Alzheimer′s DiseaseBrains，Society for Neuroscience Meeting Abstract，#787.6，Volume24，1998)。在PCT专利申请WO98/56771中已描述了CCR1受体拮抗物和它们作为消炎剂的作用。
上面描述的所有提议都没有成为阿尔茨海默氏病的早期诊断的显影剂的临床的进展。因此，仍需要一种临床的诊断剂，它能被使用作阿尔茨海默氏病的可靠的和早期的诊断。另外，建议的策略对带有阿尔茨海默氏病的病人中淀粉状的斑块形成或积累的抑制也很有用。因此，本发明的一个目标是提供为早期诊断、防止、和治疗神经变性的疾病的化合物和方法，例如，阿尔茨海默氏病。
有趣的是，已经注意到血管新生也存在于其他的不受欢迎的情况，包括固体瘤的生长和新陈代谢；变形性关节炎；牛皮癣；硬皮病；和造成盲的-糖尿病性视网膜病、晶状体后纤维增生症和新生血管性青光眼的共同原因(事实上，眼睛的疾病大致总是伴随着血管新生)。事实上创伤处血管新生过程与肿瘤血管新生有许多共同的特征。因而，有某些病况不欢迎血管新生，例如糖尿病性视网膜病或其主要的症状或肾上腺转移瘤。因此，仍需要某些方法，这些方法可被用来抑制血管新生制剂的作用从而治疗癌症。


发明内容
本发明在某种程度上基于某种发现，这种发现是甲状腺激素、甲状腺激素类似物和它们的多聚体形式，在细胞膜水平上起作用并具有与甲状腺激素作用相独立的前血管新生性质。因此，这些甲状腺激素类似物和多聚体形式(也就是，血管新生剂)可用于治疗各式各样的病症。同样地，该发明也基于甲状腺激素类似物的拮抗物抑制这些类似物的前血管新生作用的发现，该发明还可以用于治疗各种各样的病症。
因此，一方面本发明以治疗服从促进血管增生治疗的疾病的方法为特点，通过向需要的患者给药适量的多聚体形式的甲状腺激素、或甲状腺激素类似物，有效促进血管新生。这里提供了服从促进血管新生治疗的例子，包括闭塞的血管病、冠状动脉硬化性心脏病、勃起的机能障碍、心肌梗死、缺血、撞击、外周动脉血管的病症和伤口。
甲状腺激素类似物的例子在这里也被提供可以包括三碘甲腺原氨酸(T3)、左旋甲状腺素(T4)、3，5-二甲基-4-(4′-羟基-3′-异丙基苯甲基)-苯氧乙酸(GC-I)、或3，5-二碘甲状腺丙酸(DITPA)四碘甲腺乙酸四碘甲状腺乙酸(TETRAC)、和三碘甲状腺乙酸(TRIAC)。
在一种实施方案中，甲状腺激素、甲状腺激素类似物、或其多聚体形式由肠胃外、口直肠、或局部的方法、或其组合方式来给药。肠胃外的给药方式包括，例如，皮下的、腹膜内的、肌肉的、或静脉内的给药方式，例如用导管。局部的给药方式可以包括绷带帮助。
在另一种实施方案中，甲状腺激素、甲状腺激素类似物、或其多聚体形式可以被装入胶囊或整合入微粒、脂质体、或聚合体中。聚合体可以包括，例如，多聚糖脂类、聚丙交酯、或它们的共聚体。脂质体或微粒的大小大约小于200纳米、并可以通过一个或一个以上肠胃外的途径、或别的给药方式来给药。在另一种实施方案中，脂质体或微粒可以存放在缺血性组织周围的毛细血管层、或通过一种导管把其应用到血管内部。
根据本发明甲状腺激素、甲状腺激素类似物、或其多聚体形式还可以随着一个或一个以上生理活性物质共同给药，这些生理活性物质可以包括，例如生长因子、血管扩张剂、抗凝血剂、抗病毒剂、抗细菌剂、抗发炎剂、免疫的抑制剂、止痛剂、血管化试剂、或细胞粘着分子、或其组合。在一个实施方案中，甲状腺激素类似物或多聚体形式先于或后于给一个或一个以上生理活性物质作注射给药。
生长因子可以包括，例如，转换生长因子α(“TGFα”)、转换生长因子β(″TGFβ″)、基本成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子上皮生长因子、神经生长因子、血小板衍生生长因子、和血管通透因子。血管扩张剂可以包括，例如腺苷、腺苷衍生物、或其组合。抗凝血剂包括，但是不被限制在，肝素、肝素衍生物、抗因子分解Xa、抗凝血酶、乙酰水杨酸、氯吡格雷、或其组合。
本发明的另一个方面，提供了促进血管沿着或围绕医疗器材生成的方法，根据本发明，所述方法包括在将装置插入病人体内之前，用甲状腺激素、甲状腺激素类似物或其聚合体形式包覆装置。包覆步骤可以进一步地包括用一个或一个以上生理活性物质包覆医疗器材，所述生物活性物质例如，而不限于，生长因子、血管扩张剂、抗凝血剂、或其结合物。根据本发明，可以被甲状腺激素类似物或其多聚体形式包覆的医疗器材包括血管扩张器、导管、套管或电极。
在进一步方面，本发明提供了用于治疗服从抑制血管生成疗法的病况的方法，所述方法包括对所需患者给药一定量的抗血管生成剂，在所述患者体内有效的抑制血管生成。服从抑制血管生成治疗的病况的例子包括，但是不限制于，主要的或肾上腺转移瘤、糖尿病性视网膜病、和相关的状况。本发明也提供了用来抑制血管新生的的抗血管生成剂的例子并包括、但是不限制于，四碘甲状腺乙酸(TETRAC)、三碘甲状腺乙酸(TRIAC)、单克隆抗体LM609、XT199或其结合物。这种抗血管生成剂可以在细胞表面起到抑制前血管新生剂的作用。
在一种实施方案中，抗血管生成剂由肠胃外的、口的、直肠的、或局部的方式、或其组合的方式给药。在另一种实施方案中，抗血管生成剂可以与一种或一种以上其他抗血管生成治疗剂或化疗剂一起共同给药。
在更进一步的方面，本发明提供了包括甲状腺激素、和其与聚合物结合的类似物的组合物(即血管新生剂)。可以通过共价键或非共价键结合。例如，共价键可以发生在一个酯或酐键间。本发明还提供了甲状腺激素类似物的例子，包括左旋甲状腺素(T4)、三碘甲腺原氨酸(T3)、3，5-二甲基-4-(4′-羟基-3′-异丙基苯甲基)-苯氧乙酸(GC-I)、或3，5-二碘甲状腺丙酸。在一种实施方案中，聚合体可以包括，但是不限制于聚乙烯醇、丙烯酸乙烯共聚体、聚乳酸、或琼脂糖。
另一方面，本发明提供了药物制剂，该药物制剂包括在药学上可接受载体中的根据本发明的血管新生剂。在一种实施方案中，药物制剂还可以包括一个或一个以上药学上可接受的赋形剂。
根据本发明，药物制剂可以装入胶囊或结合进一个脂质体、微粒、或聚合体中。脂质体或微粒的大小小于大约200纳米。根据本发明，任何药物制剂可以通过肠胃外的、口头的、直肠的、或局部的给药方法、或其组合的方式给药。在另一种实施方案中，药物制剂可以与一个或一个以上生理活性物质共同给药需要的病人。这些生理活性物质包括但不限于生长因子、血管扩张剂、抗凝血剂、或其结合物。
在其它方面，本发明关于聚合的甲状腺激素类似物和包含所述激素的药物制剂的应用，来恢复神经元的功能和提高神经细胞的存活。为了实现本发明的目的，神经元的功能被采用平均集体的生理学的、生物化学的和解剖的机制，这个机制允许在胚胎和产后期间神经系统的发育，而且在成年的动物中，当中枢神经系统一些部分退化和不能革新的时候，这个机制是中枢神经系统适应的能力和损害神经元的再生机制的基础。
所以，下列过程发生是是为了获得神经元的功能神经切除术、神经移植术、突触发生、突触的抑制、突触的扩充、轴突的萌芽、神经中枢的再生、神经中枢路径的发育和组织和回路去替换损坏的部分。所以根据本发明，适于用聚合的甲状腺激素类似物或其组合处理的病人是患有中枢神经系统(像阿尔茨海默氏病的老年性痴呆、帕金森神经机能障碍、亨廷顿氏舞蹈病、小脑的-脊骨的肾上腺脑白质营养不良)、外伤和脑缺血的退化的病人。
在一种优选的实施方案中，本发明的方法是为了治疗运动神经元缺陷，包括肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化、和脊髓伤害，该方法包括给药与生长因子、神经生长因子或其他的前血管新生或神经发生因子相结合的聚合的甲状腺激素类似物、或其结合体。脊髓伤害包括由肿瘤、机械性创伤、和化学的外伤引起的伤害。相同的或类似的方法被用来修复在有肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化、或脊髓伤害的哺乳动物的运动机能。单独给药的上述的聚合的甲状腺激素类似物或与神经生长因子或其他的神经发生因子结合给药，也能够提供预防的功能。这样的给药在患有或有患有肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化、或脊髓伤害的危险的哺乳动物中有保护运动机能的作用。也根据本发明，单独给药聚合的甲状腺激素类似物或与神经生长因子或其他的神经发生因子结合给药，保护的黑质-纹状体通路完整性。
特别地，本发明治疗(前或后征兆地)肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化、或脊髓伤害的方法包括，单独给药的聚合的甲状腺激素类似物或与神经生长因子或其他的神经发生因子联合给药。在一种特别优选的实施方案中，单独的聚合甲状腺激素类似物或与神经生长因子或其他的因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物是一种可溶性复合物、包含至少一种单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物。
在一方面，本发明以组合物和治疗方法为特征，其中治疗方法包括对伤害到神经中枢途径、或可以预见这种伤害的哺乳动物给药治疗有效量的促骨生成蛋白(“单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物”)，如这里所定义的，在足够维持神经途径，包括修复受损途径或抑制附加损伤的浓度下保持一定时间。
在另一个方面，本发明以维持神经中枢途径的组合物和治疗方法为特征。这样的治疗方法包括对伤害到神经中枢的途径或预期的这样的伤害的哺乳动物给药一种化合物，这种化合物能够刺激治疗有效浓度的内生的聚合甲状腺激素类似物。这些化合物在这里做为单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子-刺激剂结合在一起的聚合甲状腺激素类似物有关，并且可以理解的是，这种化合物包括一种物质，这种物质在对哺乳动物给药时，能够作用于组织或器官正常地负责、或产生单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物和/或分泌单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物，这种物质还能致使单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物内呼吸水平改变。
特别是，本发明提供了保护神经元免受与身体对神经伤害的免疫和发炎反应相关的组织损伤作用的方法。本发明也提供了刺激神经元维持它们的不同的表现型的方法，不同的表现型包括诱导神经元的起源的转换的细胞再分化到未转换的神经元形态学特征。在一种实施方案中，本发明提供了方法来刺激细胞粘着分子，特别是神经细胞粘着分子(“N-CAM”) 的产生。本发明也提供了方法、组合物与设备来刺激损坏的神经元和神经中枢的途径的细胞修复作用，这里的损坏的神经元和神经中枢的途径，包括再生的损坏树枝状大分子或轴突。另外，本发明也提供了方法来评价神经组织的状况，并且通过监视单独聚合的甲状腺激素类似物或和聚合甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子水平的波动来检测和监测神经病。
在本发明的一个方面，这里描述的单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物可以用来修复外周神经系统的神经途径损伤。尤其是单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物能够有效地修复包括神经纤维切断或损伤的神经途径损伤。特别的，单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物能够刺激完整地突轴神经再生，包括冠状动脉血流和髓鞘再生。优选的，将在生物相容的、生物再吸收的载体中的单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物提供到受伤的位置，在该位置能维持单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物，并且，在必要处，严重的神经元从近端的到远端的结束直接的轴突的生长方法。例如，在神经再生的地方可能需要直接的轴突的生长方法将被诱导超过一扩大的距离，例如大于10毫米。预计了多种能够提供这种功能的载体。例如，有效的载体包括在这里公开的制备物质或粘稠溶液，包括层粘连蛋白、透明质酸或胶原、或其他的适合的人造的、生物相容的聚合的物质例如聚乳酸、聚羟基乙酸或聚丁酸和/或其共聚物。一种优选的载体包括衍生的细胞外基质组合物，例如，得自老鼠肉瘤细胞。
在一种特别地优选的实施方案中，单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物放置在一种神经引导渠道中，这个神经引导渠道横跨损坏的途径。这个渠道既作为一种防护罩又作为一种指导轴突生长的一种自然的方法。有用的渠道包括一种生物相容的膜，它的结构可能是管状的，其尺寸足够跨过所需修复的神经的缺口，并且有空缺去适合接收严重的神经末端。这种膜可能是由任何生物相容的、无刺激性的物质制成的，例如硅树脂或一种生物相容的聚合体，例如聚乙烯或聚乙烯醋酸乙烯酯。肠衣也可能是由生物相容的生物可再吸收的聚合物组成的，例如，胶原、透明质酸、聚乳酸、聚丁酸和聚羟基乙酸。在一种优选的实施方案，该渠道的外表面实质上是不通透的。
单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物可能是放置在与一种生物相容的运载物质相联系的渠道中，或可能被吸附到或关联到肠衣的内表面，如美国专利号5,011,486所描述的，该专利指出单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物易到达严重的神经末端。
在本发明的另一个方面，这里所描述的单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物具有有效的保护作用，从而免受与身体对神经组织最初伤害的免疫/发炎应答有关的损害。这样的应答可能沿着创伤到神经组织，致使，通过自身免疫的功能障碍、新生性病变、传染、化学的或机械性创伤、病原，通过神经元或胶质细胞的血流间断，或通过神经或围绕物质的其他创伤。例如，由氧不足或随着神经中枢的血液供给的闭塞处的缺血-再灌注引起的主要的损伤，例如脑栓塞被认为是与免疫地关联的。另外，与许多主要的脑肿瘤有关的至少部分的损伤也好象是与免疫相关联的。单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物的应用，直接地或系统地减轻和/或抑制免疫有关的应答神经中枢的伤害。作为选择，也可以使用给药优选地在损伤的位置，给药能刺激活体内单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物表达和/或分泌的药剂。当在外科手术或其他的主动的临床治疗期间，在发生损伤的位置，在创伤发生之前给药单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物或药剂，能够为有危险的神经组织提供一种神经保护作用。
通常，在本发明的方法和组合物中有用的单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物是蛋白二聚体，这些蛋白二聚体诱导一个或一个以上的真核(例如，哺乳动物)细胞、组织或器官的形态发生。组织形态发生包括从头或再生的组织形成，例如在发育期间发生在一种脊椎动物的胚胎。特别重要的是单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物，它们诱导组织-特异性至少是骨或神经中枢组织的形态发生。在这里做为规定，单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物包含一对多肽，当它们折叠时，形成蛋白二聚体从而在显有甲状腺受体的细胞和组织中引起形态发生的应答。也就是说，单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物一般地诱导一种事件的级联，该事件包括在一种形态发生地许可的环境中所有下列情况刺激起源细胞的增殖；刺激起源细胞的分化；刺激分化的细胞的增殖；和，支持分化的细胞的生长与维持。“起源”细胞是未定型的细胞，依靠它们的基因组全部功能和在形态发生被诱导的许可的环境的组织专一性，这些细胞有能力分化成一个或一个以上特殊类型地的分化的细胞。一种典型的起源细胞是一种造血干细胞、一种间充质干细胞、一种基底上皮细胞、一种神经脊细胞、等等。更进一步，单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物可以延迟或缓和衰老的开始-或静止-与表现型和/或组织功能有关地损失。更进一步，单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物可以刺激一种分化的细胞类型的表型表达，包括新陈代谢的和/或功能的的表达，例如，分泌，和其性状。另外，单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物可以诱导在适当的状况下的定型细胞的分化(例如，成骨细胞、成神经细胞、等等)。在这里特别重要的是，单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物诱导至少骨或神经中枢的组织的分化、和/或支持生长、维持和/或神经中枢的组织的功能性。
特别重要的是，当单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物提供到哺乳动物的一种特异的组织时，它们诱导组织-特异的形态发生或维持分化的正常状态和组织的生长。在优选的实施方案中，存在的单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物诱导脊椎动物(例如，鸟类或哺乳动物)身体组织的形成，例如但不限于神经、眼睛、骨、软骨、骨髓、韧带、牙齿、牙周组织、肝、肾、肺、心脏、或胃肠的内层。优选的方法在正在发育的胚胎组织地环境中、或在防腐剂、在后-胚胎组织无疮疤的伤口位置可能进行。
本发明的其他方面包括组合物和使用地甲状腺激素类似物和其聚合体对神经变性的病症的成像和诊断的用法，例如，阿尔茨海默氏病。例如，在一方面，本发明以在体内对患者给药时对靶点具有高特异性的T4类似物为特征。优选的T4类似物表现的靶点和非靶点的比率至少为4∶1，在给药后1小时内活体内稳定和实质上定位到目标。在另一个方面，本发明的特征药物组合物由附着于锝、铟地的甲状腺素类似物一种连接体组成，锝、铟用于单光子发射(“SPECT”)做γ成像和用造影剂来核磁共振成像。另外，结合TTR的卤代类似物可以抑制淀粉状原纤维的形成，因此可以被利用的来防止和治疗阿尔茨海默氏病。这样的化合物还可以被用于电子发射断层扫描(“PET”)成像方法。
在其它方面，本发明也包括用于调节生长因子及其他多肽的组合物和方法，这些多肽的细胞表面受体聚集着整合素αVβ3、或包含氨基酸顺序为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(“RGD”)的其他的细胞表面受体。可以被调整的多肽包括，例如，胰岛素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子和干扰素-γ。
本发明的一个或一个以上的具体的实施方案在下面的补充描述中已经阐明。尽管任何与下面描述相似或相等的方法和材料都可以用于实现或检测本发明，但这里描述的是优选的方法和材料。本发明的其他的特征、目标和优点经过说明书和权利要求书的描述而变得显而易见。除非上下文明确指出，在说明书和所附权利要求书中使用的单数形式包括复数的意思。除非另有规定，在这里使用的所有的科技术语与本发明所属技术领域普通技术人员通常的理解有相同的意思。本说明书中引用的所有专利和出版物通过在此引证全部并入本文。



图1.在鸡CAM试验中测定的L-T4和L-T3对血管新生的影响。A，对照样品暴露于PBS中，附加样品暴露于1nM T3或0.1μmol/L T4中三天。从2个实验典型的图像中可见，两种激素都导致血管支流增加。B，由在实验期间从3个实验中取出已存在的血管形成的新支流±SEM的平均数列表，每个实验包括9个CAM分析。在显示的浓度处，T3和T4产生类似的效果(支流形成分别增加了1.9倍和2.5倍)。**比较处理过的激素和处理CAM样品的PBS，通过单因子变异数分析P＜0.001。
图2.通过T4和琼脂糖连接的T4(T4-ag)Tetrac抑制血管新生的增加。A，在暴露于0.1μmol/L T4 3天在典型的CAM标本中支流血管形成增加2.5倍。在3个相似的实验中，也存在2.3倍的增加。激素的这个效果是由tetrac(0.1μmol/L)抑制的，tetrac是一种在前面已说过的抑制T4的质膜活动的T4类似物。先前已说过T4类似物抑制T4的质膜活动。单独的13 Tetrac没有刺激血管新生(C)。B，T4-ag(0.1μmol/L)，刺激血管新生增长2.3倍(在3个实验中为2.9倍)，通过tetrac其效果也被阻止。检测tetrac、T4-ag、和T4在CAM测定中的作用的3个实验结果的摘要信息。数据(平均±SEM)可从3个实验的每个实验中每个实验条件的10个图像中获得。**处理过的T4和T4-琼脂糖处理过的样品与PBS处理过的对照样品相比较，通过变量分析P＜0.001。
图3.FGF2和T4前血管生成效果的比较。在次最大浓度中T4(0.05μmol/L)和FGF2(μg/mL)的串联效果在CAM测定中和如用FGF2(1μg/mL，在T4不存在的情况下)的血管新生相等水平是加成的。B，作为在A中CAM测定中检验FGF2和T4的活动的3个实验产生的摘要信息。处理过的样品结果与3个实验中那些采用PBS处理过的对照样品相比较，*P＜0.05；**P＜0.001。
图4.由T4或外源的FGF2所引起的关于血管新生的抗FGF2的效果。FGF2在3个实验中的CAM模型中的血管新生2倍增加，抑制的效果通过对FGF2(8μg)的抗体进行。T4也刺激血管新生1.5倍增加，这个效果也被FGF2抗体抑制，表明CAM模型中的甲状腺激素的活动由FGF2的自分泌/旁分泌作用来调节，因为T4和T3促使FGF2 CAM模型中的细胞释放FGF2(表1)。我们在前面已指出，非特异性的IgG抗体在CAM测定中对血管新生没有影响。B，研究当FGF2或T4存在时FGF2-ab的活动的3个CAM实验结果的摘要信息。P＜0.01；**P＜0.001，研究甲状腺激素和FGF2关于血管新生的作用和在FGF2的抗体存在时这些作用的损失表明3个实验中的显著的效果。
图5.PD98059，一种由T4、T3和FGF2诱导的关于血管新生的MAPK(ERK1/2)信号转导级联抑制剂的作用。由T4(0.1μmol/L)和T3(1nmol/L)共同刺激的血管新生完全被PD98059(3μmol/L)抑制。B，由FGF2(1μg mL)诱导的血管新生也被PD98059抑制，表明生长因子的活动也取决于ERK1/2途径的活化。包括T4-琼脂糖(T4-ag)和tetrac(图2)的实验的上下文中表明T4在细胞膜引发前血管生成作用，A和B中所示的结果与甲状腺激素的前血管生成活动中由MAPK参加的2因子是一致的ERK1/2转换激素的早期信号，这个信号导致FGF2的加工作用和转换FGF2的关于血管新生的后来的活动。C，3个实验的摘要信息，通过A和B描述，显示了PD98059关于T4和FGF2在CAM模型中的活动的作用。*P＜0.01；**P＜0.001，显示了关于3个实验的数据的变量分析结果。
图6.T4和FGF2在ECV304内皮细胞中活化MAPK。带有0.25％激素-消耗的血清的M1 99培养基中制备细胞，并用T4(0.1umol/L)处理15分钟到6小时。细胞的收获和核碎片的制备如前所述。经凝胶电泳分离的核蛋白，用抗体免疫印迹到磷酸化MAPK(pERK1和pERK2，分别为44和42kDa)，接着通过第二个抗体连接到荧光-检测系统。核碎片免疫印迹的一种β-肌动蛋白用作对装填到该图每一部分中的凝胶的控制。每个免疫印迹对3实验是有代表性的。A，T4引起ECV304细胞中ERK1/2磷酸化作用的增加和核易位。尽管该作用能保持＞6小时，该作用在30分钟时最大。B，ECV304细胞在所述的细胞样品中添加10-7MT415分钟后，用ERK1/2活化抑制剂PD98059或PKC抑制剂CGP41251(CGP；100nmol/L)30分钟。收获细胞核，这个典型的实验表明了通过T4(条带4)，ERK1/2磷酸化作用(活化)的增加，该磷酸化作用可被两种抑制剂(条带5和6)阻断，表明PKC活动对在内皮细胞中通过T4的MAPK活化是必需的。C，ECV304细胞或者用T4(10-7mol/L)、FGF2(10ng/mL)、或两种都采用，处理15分钟，本图显示了pERK1/2在用激素或生长因子治疗的核中的积累或用同时用激素和生长因子治疗提高核中pERK1/2的积累。
图7.T4增加ECV304内皮细胞中FGF2 cDNA的积累。用T4(10-7mol/L)和FGF2和从各细胞试样中分离到的GAPDHcDNA处理细胞6到48小时。FGF2cDNA的水平，如顶端的印迹所示，对GAPDH cDNA成分中的变化是正确的，如底部印迹所示，FGF2校正水平在下面的图表中阐明(平均数的±SE平均数；n＝2个实验)。从在所有的时间点用T4处理的细胞中提取的RNA中FGF2转录增加了许多。*P＜0.05；**P＜0.01，指出了，在每个检验值的每个时间点通过变量分析的比较。
图8.鸡胚瘤日生长模型。瘤植入的鸡绒毛尿囊膜(CAM)模型的图解。
图9.T4刺激3D伤口愈合。暴露与T4和根据这里所描述的3D伤口愈合测定控制的人皮肤成纤维细胞的照像。
图10.T4的剂量-依赖增加了伤口愈合，第3天。根据图表可知，T4以浓度在0.1μM到1.0uM间的剂量-依赖方式增加伤口愈合(由迁移细胞调节)。同样的增加在T4的浓度在1.0μM到3.0μM间是看不到的。
图11.结合到纯化的整合蛋白的I-125-T4的未标记的T4和T3的效果。将未标记的T4(10-4M到10-11M)或T3(10-4M到10-8M)加入到纯净的αVβ3整合蛋白(2μg/样品)并在室温下培养30分钟。在每个样品中加入两微居里的I-125标记的T4。样品培养20分钟。在室温下，与上样染料混合，然后在5％自然的凝胶上在4℃、45mA条件下跑24小时。电泳后，把凝胶包在塑料中暴露显影。结合到纯净的αVβ3的I-125-T4不受10-11M到10-7M范围的未标记的T4的影响。但是被浓度为10-6M的未标记的T4以剂量-依赖的方式竞争出。结合到整合蛋白的高放射性的T4几乎完全被10-4M未标记的T4所取代。与竞争出结合到整合素的T4相比，T3没有那么有效，在10-6M，10-5M，和10-4MT3时，信号分别减弱11％，16％，和28％。
图12.Tetrac和包含RGD的肽，而不是包含RGE的肽竞争出结合到纯净的αVβ3的T4。A)Tetrac加入到纯净的αVβ3以剂量依赖方式减少了结合到整合蛋白的高放射性的T4。在10-7M和10-5M tetrac存在下T4和αVβ3的结合分别减少了38％和90％。10-5M的RGD肽的加入竞争出结合到αVβ3上的T4。10-5M和10-4M RGE肽的应用，作为对RGD肽的控制，不能减少结合纯净的αVβ3上的高放射性的T4。B)由图片A的tetrac和RGD数据的图形表示。数据点见通过3个独立实验的平均数±标准偏差。
图13.单克隆抗体LM609关于T4结合到αVβ3的效果。A)在指明浓度下将LM609加入到αVβ3。每样品1μgLM609使结合到整合蛋白的T4减少了52％。当LM609的浓度为2μg/样品并用高达8μg抗体浓度维持时结合到整合蛋白的T4达到最大抑制。作为对抗体专一性的控制，10μg/样品的Cox-2mAB和10μg/样品的鼠免疫免疫球蛋白G在用T4培养之前加到αVβ3中。B)由图片A的数据图形表示。数据点见通过3个独立实验的平均数±标准偏差。
图14.RGD、RGE、tetrac、和mAB LM609关于T4-诱导的MAPK活化的效果。A)CV-1细胞(50-70％覆盖)用10-7M T4(10-7M总浓度，10-7M游离浓度)处理30分钟。选择的样品在加入T4之前用指明浓度的包含RGD的肽、包含的肽、tetrac、或LM609处理16小时。核蛋白用SDS-PAGE分离并用抗磷酸MAPK(pERK1/2)抗体免疫印迹。pERK1/2的核积累在用10-6M或更高浓度的RGD肽处理的样品中减少了，而在用10-4M RGE处理的样品中不是显著的改变。pERK1/2积累在用10-6M tetrac处理的CV1细胞中减少了76％，当tetrac的浓度在10-5M和更高时降低pERK1/2的积累到类似未处理的对照样品水平。当αVβ3LM609的单克隆抗体用于CV1细胞培养浓度为1μg/ml时降低核中活化的MAPK的积累。B)RGD、RGE、和tetrac的资料的图形表示见图片A。数据点用通过3个独立实验的平均数±标准偏差来表示。
图15.对关于T4诱导MAPK活化的αV和β3基因沉默的效果。用CVI细胞采用基因沉默技术转染αV、β3、或αV和β3一起。转染两天后，细胞用10-7MT4处理。A)从每个转染组分离到的RNA进行RT-PCR来检验每个基因沉默的专一性和功能性。B)从每个转染中分离核内蛋白并进行SDS-PAGE电泳。
图16.CAM模型中关于T4-刺激的血管新生的αVβ3 mAB(LM609)的抑制效果。A)样品暴露于PBS，T4(0.1μM)，or T4加10mg/ml LM609中3天。通过T4刺激的血管新生通过αVβ3单克隆抗体LM609的加入被充分的抑制。B)在实验期间从存在的血管形成新分支的平均数±SEM的列表。数据从3个独立的实验得到，其中每个实验包含每个处理组中的9个样品。C、D)通过T4或FGF2刺激的血管新生也由于αVβ3单克隆抗体LM609或XT 199的加入而被抑制。
图17.甲状腺激素类似物-利用聚乙烯醇通过酯键聚合结合的聚合物组成。在这个制备中市场上可买到的聚乙烯醇(或相关共聚合体)可以通过用甲状腺激素类似物的酰基氯，也就是酰基氯形式来处理进行酯化。加入三乙胺形成盐酸三乙胺中和氢氯化物盐，盐酸三乙胺在不同的类似物的甲状腺激素酯聚合体形式的沉淀上可以用水冲走。聚合体的酯键可以在体内进行水解来释放活性的前血管新生甲状腺激素类似物。
图18.甲状腺激素类似物-利用丙烯酸乙烯共聚体通过酐键聚合结合的聚合物组成。这与前面的聚合体共价结合相似然而这时候是通过一酐键也就是说来源于丙烯酸共聚体的反应。这个酐键也对体内水解敏感而释放甲状腺激素类似物。伴随着用三乙胺的处理盐酸被中和，随后的用水洗涤沉淀的聚酐除去副产品盐酸三乙胺。这个反应将导致甲状腺激素类似物丙烯酸共聚体+三乙胺的形成。在体内水解作用下，甲状腺激素类似物将随时间的过去而释放，这可以加丙烯酸乙烯共聚体来控制。
图19.甲状腺激素类似物-在聚乳酸中的包埋的聚合物组成。聚乳酸聚酯高聚物(PLA)在体内进行水解得到乳酸单体，这已经开发作为人体药物输送系统的载体。不同于前面的两种共价方法，这是一个将甲状腺激素类似物装入PLA聚合体珠胶囊的非共价方法，其中这两种共价方法种甲状腺激素类似物通过一化学键连接到聚合体。这种反应将导致在水中包含PLA珠的甲状腺激素类似物的形成。过滤和洗涤将引起包含PLA珠的甲状腺激素类似物形成，它在体内水解将导致甲状腺激素加乳酸的对照水平的产生。
图20.甲状腺激素类似物能与各式各样的聚合体结合。A-D表明取代要求得到各式各样的甲状腺激素类似物，这些甲状腺激素类似物可以共轭来产生本发明的甲状腺激素类似物的多聚体形式。
图21.体外三维血管新生测定。图21是对覆有纤维蛋白的珠子上人微血管的内皮体外三维发芽测定的方法和说明。
图22.三维纤维蛋白中HOMEC的体外发芽血管新生。图22是在不同的放大条件下人微血管的内皮细胞发芽的说明。
图23A-E.在低水平胶原条件下血小板-引起的伤口愈合因子的释放。
图24A-B.未标记T4和T3从纯净的整合蛋白取代[125I]-T4。在加入[125I]-T4之前将未标记的T4(10-11M到10-4M)或T3(10-8M到10-4M)加入到纯净的αVβ3整合蛋白(2μg/样品)。(a)[125I]-T4键合到纯净的αVβ3不受10-11M到10-7M范围内未标记的T4的影响，但是被＞10-6M浓度未标记T4以浓度-依赖的方式取代。T3在取代T4键合αVβ3的效果差一些。(b)T4和T3数据的图解说明见3个独立实验的平均值±标准偏差。
图25A-B.Tetrac和包含RGD的肽、而不是包含RGE的肽取代T4键合纯净的αVβ3。(a)用tetrac或包含RGD的肽预培养纯净的αVβ3以剂量-依赖的方式降低整联蛋白和[125I]-T4之间的相互作用。应用10-5M到10-4M RGE肽，作为RGD肽的对照，没有减少标记的T4键合到纯净的αVβ3。(b)tetrac和RGD数据的图解说明显示了由3个独立实验引起的平均值±标准偏差。
图26 A-B.整联蛋白抗体抑制T4键合到αVβ3。在加入[125I]-T4之前将抗体LM609和SC7312在指出的浓度(μg/ml)加入到αVβ330分钟。当LM609浓度为2μg/ml并维持抗体浓度高达8μg/ml时达到对T4键合整联蛋白的最大抑制。当2μg/mlL抗体/样品和8μg/ml抗体存在时SC73 12对T4键合到αVβ3分别减少了58％和46％。作为抗体专一性的对照，10μg/ml抗αVβ3mAb(P1F6)和10μg/ml鼠免疫球蛋白G在用T4培养之前加入到αVβ3。图表显示了从3个独立的SC7312实验的数据的平均值±标准偏差。
图27A-B.RGD和RGE肽、tetrac、和mAb LM609关于T4-诱导MAPK活化的效果。(a)用10-6M或更高的RGD肽处理的样品中pERK1/2的核的积累减少，但直到10-4M RGE处理的样品中没有显著的改变。用10-5M tetrac和T4处理的CV-1细胞中pERK1/2的积累与未处理的对照样品中观察到的水平相似。LM609，αVβ3的单克隆抗体，当它以1μg/ml浓度应用于CV-1培养时降低核内活化的MAPK的积累。(b)图表显示了从3个独立的SC7312实验的数据的平均值±标准偏差。用α-微管蛋白抗体免疫印迹分析包括上样凝胶的控制。
图28A-B.基因沉默对αV和β3关于T4-诱导MAPK活化的效果。用CV1细胞采用小干扰RNA(终浓度为100nM)转染αV、β3、或αV和β3一起。转染两天后，细胞用10-7MT4或对照载体处理30分钟。(a)从每个转染组分离到的RNA进行RT-PCR来检验每个小干扰RNA的专一性和功能性。B)从每批转染细胞中分离到核蛋白并进行SDS-PAGE电泳，在有或没有用T4处理的条件下作为pERK1/2的探针。在母系细胞和那些用小干扰RNA干扰处理的细胞内，带有T4的pERK1/2的核内积累很明显。用小干扰RNA对αV或β3处理的细胞表明没有T4存在时pERK1/2增加，在有T4处理时pERK1/2降低。包含αV和β3的小干扰RNA对T4的处理不响应。
图29A-B.CAM模型终αVβ3 mAb(LM609)关于T4-刺激的血管新生的抑制效果。CAM暴露于滤光盘用PBS、T4(10-7M)、或T4加10μg/ml LM609处理3天。(a)由T4刺激的血管新生实质上用加入αVβ3单克隆抗体LM609抑制。(b)在实验周期期间从存在的血管形成新分支的平均值±SEM如表所示。***P＜0.001，比较3个分开的实验中用T4-处理的样品和T4/LM609-处理的样品的结果，每处理组包含9个图像。统计分析采用单因子变异数分析。

具体实施例方式 本发明的特征及其他细节将更多特别地被补充图形的参考所描述，和通过权利要求指出。为方便起见，这里收集了在说明书、实施例和权利要求书中使用的特定术语。除非规定否则，在这里使用的所有的学术上的和科学的术语与本发明所属领域普通技术人员通常的理解有相同的意思。
如在这里所使用的，术语“血管新生剂”包括那些促进或促使血管新生的任何化合物或物质，不管是单独的或和联合在一起的另一个物质。实例包括，但是不局限于T3、T4、T3或T4-琼脂糖、T3的聚合的类似物、T4、3，5-二甲基-4-(4′-羟基-3′-异丙基苯甲基)-苯氧乙酸(GC-I)、或DITPA。相反，提到的抑制或阻止血管新生的任何化合物或物质的术语“抗血管新生剂”或“抗血管生成剂”，不管是单独的或和联合在一起的另一个物质。实例包括，但是不局限于，TETRAC，TRIAC，XT 199，和mAb LM609。
如这里所使用的，术语“心肌缺血”定义为一种由减少的心血管的容量所引起到心肌的血液供给不足。如这里所使用的，术语“冠状动脉硬化性心脏病”被称为由于心肌的功能和为正常功能供给充分的血流的冠状血管的容量之间不平衡导致的心脏功能的疾病/病症。可以用在这里描述的组合物和方法处理的与冠状动脉硬化性心脏病有关的特殊的冠状的疾病/病症包括心肌缺血、心绞痛、冠状动脉瘤、冠状动脉血栓症、冠状动脉痉挛、冠心病、心肌梗塞和冠状狭窄症。
如这里所使用的术语“闭塞的周围性血管疾病”(又名外周的动脉的闭塞的病症)是一种血管的病症-包括在颈动脉或股骨的动脉的堵塞，包括回肠的动脉。股骨的动脉堵塞导致疼痛和限制的运动。与闭塞的周围性血管疾病有关的一种特殊的病症是糖尿病足，它影响糖尿病患者，经常导致足的切除。
如这里所使用的术语“血管的再生”、“血管新生”、“血管的再形成”和“增大侧支循环”(或大意是这些词汇)被认为是同义的。术语“药物地可接受的”当涉及一种自然的或合成代用品意味着鉴于它的更多地有益的作用该物质有一可接受的毒性效应，同时相关的术语，“生理地可接受的”意味着该物质有相对低地毒性。术语，“共同给药”意思指大约同时或接近地时序给病人两个或两个以上药物以便它们的作用大致同时或实质上重叠地进行。这个术语包括连续的以及同时的药物给药。
“药物地可接受的盐类”涉及甲状腺激素类似物、多聚体形式和衍生物的药物地可接受的盐类，它的盐类源自于本技术领域众所周知的各种各样的有机的和无机的反离子，包括，单独地举例来说，钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵、等等；当该分子包含一种基本官团、有机的或无机酸的盐类，例如氢氯化物、氢溴化物、酒石酸盐、甲磺酸盐、醋酸盐、顺丁烯二酸盐、草酸酯等等能被用作药物地可接受的盐类。该术语也既包括酸有包括碱结合的盐类。
“药物地可接受的酸结合盐类”涉及那些保持生物有效性和游离碱的性状的盐类，它们不是生物学上或相反不受欢迎的，它们是由无机酸例如例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等，和有机酸例如乙酸、丙酸、丙酮酸、马来酸、丙二酸、丁二酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、安息香酸、扁桃酸、甲磺酸、乙基磺酸、p-甲苯磺酸、水杨酸等等形成的。本发明特别地优选的化合物的盐类是一氯化物盐类和二氯化合物盐类。
“药物地可接受的碱结合盐类”涉及那些保持生物有效性和游离酸的性状的盐类，它们不是生物学上或相反不受欢迎的。这些盐类从无机碱或有机碱与游离酸结合来制备。这些盐类来源于无机碱包括，但是不局限于钠、钾、锂、铵、钙、镁、锌、铝的盐类等等。优选的无机盐是铵、钠、钾、钙、和镁盐。这些盐类来源于有机碱包括，但是不局限于，伯胺、仲胺和叔胺的盐类，胺类的代替物包括自然地产生的胺类代替物、环胺类和阳离子交换树脂，例如异丙胺三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2二乙氨基乙醇、三乙醇胺、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海葱次苷、胆碱、甜菜碱、2-乙二胺葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、多胺树脂等等。特别地优选的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。
“脲基”涉及基本的结构式-N(H)-C(O)-NH2 从上面的定义和实例可以知道那些用于包含一种替代的烷基的基团的在其上的任何置换在烷基的任何碳上发生。本发明的化合物、或它们的药物地可接受的盐类，在它们的结构上也许有不对称碳原子。本发明的化合物和它们的药物地可接受的盐类可以以单一的对映体、非对映异构物、外消旋酒石酸盐、对映体和非对映异构体的混合物形态存在。所有这些单一的对映体、非对映异构物外消旋酒石酸盐和其混合物确定为在本发明范畴内。化合物内部的某些碳原子的绝对构型、如果已知，通过适当的绝对的描述符R或S来指出。
分离对映异构体可以通过使用旋光活性的开始和/或中间的物质或通过使用惯用的拆分技术例如，酶催化的拆分或手性的HPLC。
如这里所使用的，惯用语“生长因子”或“神经发生因子”涉及对CNS或PNS的细胞有生长、增殖、分化、营养的作用的蛋白、肽或其他的分子。这样的因子可能被用来诱导增殖或分化，可以包括，例如，允许CNS或PNS的细胞增殖的任何营养因子，包括绑定细胞表面的受体上对细胞发挥营养的或生长-诱导作用的任何分子。优选的因子包括但是不局限于，神经生长因子(“NGF”)、表皮生长因子(“EGF”)、血小板衍生生长因子(“PDGF”)、类似胰岛素的生长因子(“IGF”)、酸性的成纤维细胞生长因子(“aFGF”或“FGF-I”)、基本的成纤维细胞生长因子(“bFGF”或“FGF-2”)和转换生长因子-α和转换生长因子-β(“TGF-α”或“TGF-β”)。
“患者”包括活生物例如人、猴子、奶牛、羊、马类、猪、家牛、山羊、狗、猫、耗子、鼠、从此的培养细胞和其转基因的物种。在一种优选的实施方案，患者是人。采用本发明的组合物给药给要治疗的患者可以使用已知的程序、剂量和时段来有效的治疗患者的疾病。为获得治疗的作用所必需的治疗的化合物的有效量可以根据因素而变化，例如年龄、性别、和患者的体重、和患者体内处理外来的治疗的化合物药剂的能力。可以调节给药方案来提供最佳的治疗的响应。例如，可能每日给药几个分开的剂量或可能由据显示的治疗的位置的紧急相应地减少剂量。
“给药”包括允许本发明的组合物施行它们的预期功能的给药途径、例如，促进血管新生。各种各样的给药途径可能包括，而没有必要限于肠胃外的(例如，静脉内的、动脉内的、肌肉的、皮下注射)、口的(例如，饮食的)、局部的、鼻的、直肠的、或通过依赖疾病或待治疗的健康情况的缓释微载体。口的、肠胃外的和静脉内的给药是优选的给药方式。用于给药的化合物的制剂根据被选择的给药途径(例如，溶液、乳剂、凝胶剂、气雾剂、胶囊剂)变化。包含用于给药的化合物的适当的组合物可以制成生理地可接受的运载体或载体和可选择的佐药和防腐剂。对于溶液或乳剂、合适的载体包括，例如，水的或乙醇的/水溶液、乳剂或悬浊液，包括盐的和缓冲液媒介、无菌水、奶油、软膏、洗液、油剂、糊剂和固体载体。肠胃外的运载体可以包括氯化钠溶液、R型葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、R型乳酸盐或不挥发性油类。静脉内的运载体可以包括许多的添加剂防腐剂、或流体、营养品或电解质补充物(一般地参见，Remington′s Pharmaceutical Science，16thEdition，Mack，Ed.(1980))。
“有效量”包括允许施行它的预期功能的前血管生成或抗血管生成化合物的总量，例如，这里所描述的促进或抑制血管新生相关的病症。该有效量取决于许多因素，包括生物活性、年龄、体重、性别、总的健康情况、待治疗疾病的严重程度，和合适的药物动力学的性质。例如，该活性物质的剂量可能从大约0.01mg/kg/日到大约500mg/kg/日、有利地从大约0.1mg/kg/日到大约100mg/kg/日。该活性物质的治疗地有效量可以通过适当途径单一剂量或多倍的剂量给药。更进一步，该活性物质的剂量可以据显示的治疗的或预防的位置的紧急性相应地增加或减少。
“药物地可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌的和抗真菌剂、等渗的和吸收延迟剂等等，它们与该化合物的活动是协调的，对患者是生理地可接受的。药物地可接受的载体的一个实例是缓冲的生理盐水(0.15M NaCl)。对于药物地活性物质的这些媒介和药剂的使用在本领域是大家熟知的。除了到任何惯用的媒介或药剂与该治疗的化合物不相容的程度，适合于药物给药的组合物中它们的使用是预期的。补充的活性化合物也可以合并入组合物。
“辅助的配料”包括，但是不局限于，下列的一个或一个以上赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；粒化和分裂剂；粘合剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理地可降解的组合物例如白明胶；水的运载体和溶剂；油的运载体和溶剂；悬浮剂；分散或润湿剂；乳化剂、镇痛剂；缓冲液；盐类；稠化剂；填料；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；和药物地可接受的聚合的或疏水性的物质。包括本发明的药物组合物在内的其他的“辅助的配料”在本技术领域和已描述的是已知的，例如，雷氏药学大全。
组合物 血管生成剂包含甲状腺激素、其类似物、和激素和它们的类似物的聚合体结合物在这里被公开。公开的组合物能被用来促进血管新生从而治疗病症，在病症的位置血管新生是有益的。另外，这些甲状腺激素、类似物和聚合体结合物的抑制可用于抑制与不希望有的血管新生有关的治疗病症的血管新生。如这里所使用的，术语“血管生成剂”包括那些促进或促使血管新生的任何化合物或物质，不管是单独的还是和联合在一起的另外的物质。实例包括，但是不局限于，T3 T4、T3或T4-琼脂糖、T3的聚合的类似物、T4、3，5-二甲基-4-(4′-羟基-3′-异丙基苯甲基)-苯氧乙酸(GC-I)、或DITPA。
聚合体结合物用于改善药物存活期。同时许多老和新的疗法有好的耐药力，许多化合物必须提高药物显示技术来减少毒性、增大循环时间、或改进生物分布。改善药物存活期的一种策略是对水溶性聚合物的利用。许多的水溶性聚合物已经表明可以改进生物分布、改善细胞摄取方式、改变穿过生理障碍的渗透性、和改进穿过身体的间隙的比率。为获得或者一个目标或支撑-释放作用，包含药物部分的水溶性聚合物已经合成，药物部分作为末端基团、做为脊椎的一部分、或者做为聚合体链上的侧基。
本发明的典型的组合物包括甲状腺激素或类似物由此的聚合体结合物。聚合体结合物可以是或者通过共价的或非共价的连接键。在优选的实施方案，该聚合体结合物可以通过一酯键或一酸酐键而存在。使用聚乙烯醇通过一酯键聚合体结合物的一个实例如图17所示。在这些预备市场上可买到的聚乙烯醇(或相关的共聚体)可以通过用甲状腺激素的酰基氯处理来酯化，包括酰基氯的形式。通过加入三乙胺给予盐酸三乙胺氢氯化物盐类被中和，它们可以在对于不同的类似物的甲状腺激素酯聚合体形式的沉淀上用水冲走。该聚合体的酯键可以生体内进行水解来释放活性的前血管新生甲状腺激素类似物。
通过一酸酐键使用丙烯酸乙烯共聚体的聚合体结合物的实例如图18所示。这与上述的聚合体共价的结合物相似，然而，这时候它通过一酸酐键连接也就是说来源于丙烯酸共聚体的反应。这个酸酐键也对在体内水解敏感而释放甲状腺激素类似物。通过用三乙胺的处理和后来的用水除去盐酸三乙胺副产品的沉淀的聚酐聚合体的洗涤完成了盐酸的中和。这些反应将导致甲状腺激素类似物丙烯酸共聚体+三乙胺的形成。在体内水解下，随着时间的过去甲状腺激素类似物将释放，它可以加丙烯酸乙烯共聚体来控制。
别的典型的聚合体结合物包括甲状腺激素或它的与聚乙二醇(PEG)结合的类似物。许多药物、蛋白和脂质体的PEG的附着已经表明改善停留时间和减少毒性。PEG可以与活化剂通过链末端的羟基和其他的化学的方法系在一起。PEG本身，然而，限于两个活化剂每分子。在一个不同的方法，PEG和氨基酸的共聚物做为新的生物材料被研究，它们将保持PEG的生物适合性性质，但是它们有许多固定点每分子的附加的优点和它们可以设计合成来适合各种各样的应用。
别的典型的聚合体结合物包括甲状腺激素或它的聚合体的非共价的结合物的类似物。这个详述见图19所示。一个优选的非共价的结合物是在聚乳酸聚合体内的甲状腺激素或其类似物的包埋。聚乳酸聚酯聚合物(PLA)在体内进行水解成乳酸单体并使用作人体内药物传送系统运载体。不同于先前的两个共价的方法，这个是那些将甲状腺激素类似物装入PLA聚合体颗粒胶囊的非共价的方法，在这两个共价的方法甲状腺激素类似物通过一个化学键与聚合体相连接。过滤和洗涤将导致包含PLA颗粒的甲状腺激素类似物的形成，它们在体内水解将引起甲状腺激素多余的乳酸的控制的的水平的发生。
更进一步，本发明的组合物包括与视黄醇结合的甲状腺激素类似物(例如，视黄酸(即，维生素A))，它们结合到甲状腺激素结合蛋白转甲腺素蛋白(“TTR”)和维生素A结合蛋白(“RBP”)。甲状腺激素类似物还可以用卤代己烯雌酚、单独的或和联合在一起的视黄酸结合，供来检测和抑制淀粉状的斑块。这些类似物兼备T4-TTR的有益的性质，也就是，它们的快速的摄取和延长在脑和淀粉状体的滞留，带有卤素取代基的性质，包括对PET成像有用的某些卤素同位素，这些卤素同位素包括氟-18、碘-123、碘-124、碘-131、溴-75、溴-76、溴-77和溴-82。
此外，纳米技术能被使用创造纳米尺度大小的有用物质和结构。具有生理活性物质的主要的缺陷是易碎性。纳米刻度的物质可以与这样的生理活性物质结合来显著地改善该物质的持久性，产生该物质局部的高浓度和通过最小化损失降低成本。所以，辅助的聚合的结合物包括甲状腺激素和其类似物的纳米颗粒制剂。在这个实施方案，纳米聚合体和纳米粒子能被用作甲状腺激素和它的类似物的本地传送的基质。这将在控制传送进细胞的和组织目标的时间给予帮助。
本发明的组合物既包括甲状腺激素、类似物又包括衍生物或者单独的或带有聚合体的共价的或非共价的结合物。典型的类似物和衍生物的实例如图20、表A-D所示。表A显示了T2、T3、T4、和溴代衍生物。表B显示了丙氨酰侧链修饰。表C显示了羟基、二苯酯键、和D-结合物。表D显示了酪氨酸类似物。
术语“抗血管新生剂”或“抗血管生成剂”涉及抑制或阻止血管新生的任何化合物或物质，不管是单独的还是和联合在一起的别的物质。实例包括，但是不局限于，TETRAC TRIAC、XT 199、和mAb LM609。
甲状腺激素、类似物和聚合的结合物在促进血管新生的作用 甲状腺激素类似物或多聚体形式的前血管生成作用取决于一个非基因组的启动，通过对MAPK信号转导途径的药理学的抑制剂的减少的激素作用的敏感性来检测。这样的结果表明通过甲状腺激素的MAPK的活化的别的结果是新血管的生长。后者是非基因组地开始的，但是当然，需要一个跟着发生的复合物基因转录程序。甲状腺激素的环境浓度是相对稳定的。CAM模型、当我们检测它的时候，是甲状腺缺乏的和因此可能被认为是一个体系，它们不会再生出完整的有机体。
对血管新生的鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)试验的有效性已经提供一个模型，在这个模型中测定血管新生和研究可能机制涉及通过新血管生长的甲状腺激素的诱导。目前的申请公开了在FGF2的CAM模型中那些近似的和可以提高接近最佳的剂量的作用的T4的前血管生成作用。更进一步公开了激素的前血管生成作用是在质膜上开始的，取决于通过MAPK信号转导途径T4的活化作用。像上面提出的，治疗闭塞的周围性血管疾病和冠状的疾病的方法，特别是，冠状血管的闭塞、和与外周的脉管系统和/或冠状血管的闭塞有关的病症也被公开。病人体内需要的促进血管新生和/或补充并行的血管的组合物和其方法也被公开。该组合物包括一有效量的甲状腺激素类似物、多聚体形式和衍生物。该方法包括一有效量的甲状腺激素类似物、多聚体形式、和低的衍生物的共同给药、带有其他的标准前血管新生生长因子、血管扩张剂、抗凝血剂、溶解血栓的或其他的血管的-相关的疗法的持续一星期或以上的每日的剂量。
CAM试验已经被用于确认被认为促进血管新生的各种各样的生长因子和化合物的血管生成活动。例如，生理学的浓度的T4被证明在体外模型里有前血管生成和在一个摩尔的碱上有FGF2的活动。丙硫尿嘧啶的存在没有减少甲状腺素的作用，表明那些为产生T3的T4的去-碘化作用在这个模型不是先决条件。各式各样的甲状腺激素类似物的前血管新生作用的摘要信息已列入表1。
表1CAM模型中的各式各样的甲状腺激素类似物前血管新生作用 n＝8/组 这个模型中新血管的生长的出现需要几日，表明那些甲状腺激素的作用是完全取决于对带有激素的甲状腺激素(TR)核的受体的交互作用。那些需要带有自然的配体的TR核内的络合、T3的碘化甲状腺氨酸的活动，通过定义是基因组的，在基因表达中达到顶点。另一方面，这个模型系统对T4而不是T3的优先的应答，TR的自然的配体一升高的可能性和在那些需要基因转录的作用下达到顶点，这个可能性指那些血管新生可能通过T4在质膜非基因组地开始的。T4的非基因组的活动已经广泛地描述了，通常在质膜上开始和可能通过信号转导途径传递。它们不需要碘化甲状腺氨酸和TR的核内的配体，但是可能协调或调整基因转录。类固醇的非基因组的活动也已经很好的描述了，并已知道类固醇或其他的化合物协调基因组的活动。带有T4和tetrac或带有琼脂糖-T4进行的实验表明T4的前血管生成作用实际上很可能是在质膜上开始的。Tetrac阻断T4的膜-开始的作用，但是本身不活化激活信号转导。因此，它是一个对甲状腺激素的非基因组活动的探针。琼脂糖-T4被认为不是细胞内部的获得入口并已经用于检查对该激素的可能细胞表面-开始的活动的模型。在鸡绒毛尿囊膜(“CAM”)模型中甲状腺激素的前血管生成作用的研究证明从存在的血管的新血管的生成通过1O″7-10″9M的或者左旋甲状腺素(T4)或3，5，3′-三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)被促进两到三倍。更多有趣地是，T4-琼脂糖、一个不通过细胞膜的甲状腺激素类似物，产生一个比得上那些由T3或T4得到的有效的前血管新生作用。
部分地，本发明提供了对患者体内需要的促进血管新生的组合物和其方法。服从通过促进血管新生治疗的疾病包括，例如，闭塞的周围性血管疾病和冠状的疾病，特别是，闭塞的冠状血管、和与外周的脉管系统和/或冠状血管的闭塞有关的病症、勃起的功能障碍、中风、和创伤。对在病人体内需要的促进血管新生和/或补充并行的血管的组合物和其方法也已公开。该组合物包括一有效量的甲状腺激素类似物和衍生物的多聚体形式和一有效量的腺苷和/或氧化氮供体。该组合物可以是一种无菌的、可注射的、药物制剂的形式，其中药物制剂包括一血管生成地有效量的在生理地和药物地可接受的载体里似甲状腺激素的物质和腺苷衍生物，选择性地带有一个或一个以上赋形剂。
心肌梗死 伴随着急性的心肌梗死的心力衰竭的一种主要的原因是新血管形成的不充分的应答，那就是说，血管新生。甲状腺激素和它的类似物在心脏衰竭和刺激冠状的血管新生里是有益的。本发明的方法包括，部分地，在梗死形成的时候或者通过直接注入进心肌、或者通过通过间歇的主动脉的结扎的冠状动脉的注射的模拟来产生暂时的等容收缩提供甲状腺激素类似物的单一疗法来获得血管新生和/或心室的改型。
因此，本发明的特征方法的一方面，这个特征方法通过给需要的患者适量的多聚体形式的甲状腺激素、或其类似物、有效的促进血管新生来促进血管新生来治疗闭塞的血管病、冠状动脉硬化性心脏病、心肌梗死、缺血、中风、和/或外周的动脉血管的病症。
甲状腺激素类似物的多聚体形式的实例在这里也被提供并且可以包括结合到聚乙烯醇、丙烯酸乙烯共聚体、聚乳酸、或琼脂糖的三碘甲腺原氨酸(T3)、左旋甲状腺素(T4)、(GC-I)、或3，5-二碘甲状腺丙酸(DITPA)。
该方法也包括一有效量的似甲状腺激素的物质和一有效量的腺苷和/或低的NO供体，持续一星期或以上的每日的剂量的共同给药。一种或两种组分都可以通过导管局部地输送。在体内的甲状腺激素类似物和衍生物通过在适当地大小的脂质体或微粒中的化合物的结合可以输送到围绕缺血性的组织的毛细血管床。甲状腺激素类似物、多聚体形式和衍生物通过带有一种合适的抗体的共价键可以靶向到缺血性的组织。
该方法可能用作心肌梗死后修复心脏功能的一种疗法。该方法也可能用作改善带有冠状动脉疾病的病人，这些病人遭受着从心肌缺血或局部缺血到除了心的区域包括，例如，闭塞的周围性血管疾病(又名外周的动脉阻塞性疾病)、勃起的功能障碍。
伤口愈合 伤口的血管新生是愈合的增生期的重要的的一部分。除了特大的表面所有皮肤伤口的愈合在没有血管新生时不可能发生。不仅任何损伤的脉管系统需要被修复，而且为治愈所必需的增殖的局部细胞的活动需要从血流中得到增多的营养的供给。此外，形成血管的内层的内皮细胞对组织自身和愈合的调节者是很重要的。
因此，血管新生提供了一种新的微循环支持创伤的愈合。损伤后四日新血管在伤口空间内部就变成临床上明显的。血管的内皮细胞、成纤维细胞、和平滑肌细胞所有的增殖与支持伤口肉芽发生相协调。同时，上皮再形成发生来重建上皮的覆盖层。从创伤边缘或从深的毛囊的上皮细胞迁移横穿伤口并且在肉芽组织和临时基质上形成他们自身。生长因子例如角化细胞生长因子(KGF)调节这个过程。上皮形成的几模型(滑动对比滚动细胞)存在。
像甲状腺激素调节代谢率，当由于甲状腺机能减退新陈代谢减慢时，伤口愈合也减慢。所以在伤口愈合中局部地应用甲状腺激素类似物或多聚体形式的作用提出了一种加速新的策略，这个策略加速了糖尿病患者和带有损伤了的伤口愈合能力的非糖尿病患者的伤口愈合。局部的给药可以采用绷带帮助的附着形式。另外，纳米聚合体和纳米颗粒能被用作甲状腺激素和它的类似物的本地输送的基质。这将帮助定时控制的输送进细胞的和组织目标。
因此，通过给药给需要的患者以适量的多聚体形式的甲状腺激素、或其类似物、有效的促进血管新生的通过促进血管新生来治疗创伤的本发明的特征方法的别的实施方案。对于其详述，参见实例9A和9B。
诱导和维持神经元的细胞的甲状腺激素、类似物、和和聚合甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子的聚合的结合物的作用 与传统的神经中枢的诱导的认识相反，本发明部分地以意外的发现为基础，这个发现是，开始和维持血管新生的机制是神经发生的有效的促进者和支持者。这些方法和组合物是有用的，例如、对于运动神经元损伤和创伤中的神经病、损伤和神经元的混乱的疗法。这个发明公开了各种各样的单独的前血管新生策略或和聚合甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子的使用。前血管新生因子包括像在这里阐述的聚合的甲状腺激素类似物。在本技术领域已知的和带有神经生长触器或其他的神经发生因子的聚合的甲状腺激素类似物和它的单独的聚合的结合物或和联合在一起的其他的前血管新生生长因子可以结合用于最佳的神经发生。
在哺乳动物中用于维持神经中枢途径的治疗方法、组合物和设备，包括提高担快死的风险的神经元的存活、诱导损伤神经元和神经中枢的途径的细胞的修复、和刺激神经元维持它们的分化表型。另外，包含聚合的甲状腺激素类似物、和其组合的组合物，在抗氧化剂和/或消炎剂存在的情况下证实了神经元的再生和保护。
本发明也提供了甲状腺激素、类似物、和聚合的结合物、单独的或和聚合甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子来提高神经元的存活和维持神经中枢途径。如同这里所描述的，单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物能够提高神经元的存活、刺激神经元的CAM表达、维持分化的神经元的表型表达、诱导神经中枢的起源的转换细胞的再分化、和刺激在神经中枢的过程的断处上轴突的生长，特别是在轴突里的大的缺口。成形基因也防止与免疫地相关的神经组织损伤有关的组织破坏。最终，单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物可能用作用来监视哺乳动物中神经组织的存活期的方法的一部分。
本发明也提供了关于在培养鼠表层神经元之间的神经突触形成的聚合的甲状腺激素的作用，使用一种体系评价体外功能的神经突触形成。暴露在10-9M聚合的甲状腺激素、3，5，3′-三碘甲腺原氨酸或甲状腺素，引起细胞内的钙浓度的自发的同步的振荡的变化的频率增加，这与神经突触形成的数目有关系。通过免疫的细胞化学的和免疫印迹分析对与突触囊泡关联的蛋白的检测也证实暴露在甲状腺素促进了神经突触的形成。乙胺碘呋酮，5′-脱碘酶的抑制剂、或氨三唑，一种除草剂的存在，在甲状腺素存在的情况下抑制了神经突触的形成。因此，本发明也提供一种有用的体外试验体系来筛选那些通过分裂聚合的甲状腺系统来干扰发育的CNS中的神经突触的形成。
通常，本发明的方法可能用于治疗在危险中的哺乳动物的患者或被神经中枢组织的损伤或神经病所烦扰的患者。本发明适合于治疗所有的灵长类动物，优选地较高等的灵长类动物例如人。另外，然而、本发明可能应用于对那些作为人的同伴来供养的家养哺乳动物的治疗(例如，狗、猫、马)，它们有重要的商业价值(例如，山羊、猪、羊、家牛、运动的或耕畜)，它们有重要的科学价值(例如，濒危物种的捕获的或自由的标本、或近亲交配或基因工程的动物种类)，或不然它们有价值。
这里描述的单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物提高了细胞的存活，特别是处于将死的危险中的神经元的细胞。例如，完全分化的神经元是非有丝分裂的，并且，当使用本技术领域所知的化学合成培养基或低的血清培养基在低于标准哺乳动物细胞培养条件体外培养时会死去。参见，例如，Charness，J.Biol.Chem.263164-3169(1986)and Freese，et al.，Brain Res.521254-264(1990)。然而，如果非有丝分裂的神经元细胞的原代培养用单独的聚合甲状腺类似物或和甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子处理，对这些细胞的存活有较大地提高。例如，从成年鼠脑的黑质中分离的纹状体的基底神经节的原代培养使用标准程序来制备，例如，通过由带有黑质组织的巴斯德吸管研碎来离解，使用标准组织培养方案，和在低的血清培养基中生长，例如，包含50％DMEM(Dulbecco改进的伊格尔培养基)、50％F-12培养基、补充有青霉素/链霉素和4g/L葡萄糖的加热灭活的马血清。在低于标准的培养条件下，当培养在游离血清培养基中这些细胞到三星期会进行显著的细胞死亡。通过细胞无能力保持附着和通过它们的超级结构特征的变化细胞死亡在形式上很明显。，例如，通过染色质凝块和细胞器解体。特别地，细胞保持附着和延伸至维持活的分化的神经元的形态。在没有单独的甲状腺类似物或和甲状腺类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子治疗的情况下，大多数培养细胞分解并进行细胞坏死。
黑质的基底神经节中的功能障碍与体内的亨廷顿氏舞蹈病和帕金森病有关。这里定义的单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物提高神经元存活的能力表明这些单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物作为提高在体内处于死亡危险中的神经元的细胞存活的疗法的一部分将很有用，例如，对神经病或，化学的或机械性创伤。本发明进一步提出这些单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物提供了一种治疗神经病有用的治疗剂，这种神经病影响纹状体的基底神经节，包括亨廷顿氏舞蹈病和帕金森病。对于临床应用，单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物可能被用来给药或，换句话说，单独的聚合甲状腺激素类似物或和甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子-刺激剂可能被用来给药。
这里描述的甲状腺激素化合物还可以用于保护受过化学的创伤的神经组织。这里描述的单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物提高诱导神经元的细胞存活和再分化细胞中的细胞聚集和细胞-细胞粘着的能力，表明单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物作为通过保护细胞限定的途径防止由化学创伤所引起的损伤来维持神经中枢途径的治疗剂将很有用处。特别地，单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物可以保护神经元，包括发育中的神经元，防止众所周知的抑制神经元的增殖和迁移和干涉细胞-细胞粘着的毒素的影响。这样的毒素的实例包括乙醇，一个或一个以上的毒素存在于香烟烟雾和各种各样的镇静剂中。关于发育中的神经元的乙醇的有毒影响在胎儿乙醇综合症中诱导神经学上的显然的损伤。单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物还保护神经元防止与兴奋性氨基酸例如谷氨酸有关的细胞毒素的影响。
例如，当提供25-50mM的单独的聚合甲状腺类似物或和甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子给NG108-15细胞来治疗这些细胞，乙醇抑制单独的聚合甲状腺类似物或和甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子诱导的细胞-细胞粘着作用。按照单一酒精饮料的摄取在一个成年人体内的血酒精浓度，带有5-10mM乙醇就可获得半最大抑制。乙醇可能干涉细胞间CAM的同种结合，而不是它们的诱导，如同单独的聚合甲状腺类似物或和甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子——诱导N-CAM水平不受乙醇的影响。此外，抑制效果与单独的聚合甲状腺类似物或和甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子的浓度成反比。因此，可以预见，单独的聚合甲状腺类似物或和甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子或单独的聚合的甲状腺类似物或和甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子的给药——对神经元、特别是发育中的神经元、暴露在毒素例如乙醇中的损伤危险的刺激剂，通过克服毒素抑制的影响保护这些细胞免于神经组织损伤。这里描述的单独的聚合甲状腺类似物或和甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子对由于暴露在毒素中诱导的神经病引起的治疗损伤的神经中枢途径的疗法也很有用。
这里描述的单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物在体内的活动在如同这里所描述的动物模型里也很容易评价。一种合适的动物，优选地显示出神经组织损伤，例如，遗传地或环境上地诱导，向脑内注射带有有效量的以一种合适的治疗制剂的形式的单独的聚合甲状腺激素类似物或和甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子，例如磷酸盐缓冲盐水、pH7。单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物优选地注射到受影响的神经元的区域内部。在随后的时间点和由形态上和/或由合适的生物化学标记物(例如，由单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物或N-CAM局部化；或通过测量剂量-依赖的关于生物化学的标记物对CNS神经营养的活动或对于CNS组织损伤的影响)的作用的组织的评价，受影响的组织被切除，使用的实例如，神经胶质纤丝酸性蛋白做为标记物。其剂量和保温时间随待检测的动物而变化。对于不同物种的合适的剂量范围可能通过和建立的动物模型比较来确定。下面提出的是对于鼠脑刺伤模型的一个典型的方案。
简言之，从标准商业的来源获得的雄性Long Evans大鼠，使其麻醉并对头部区域准备外科手术。使用标准外科手术方法和使用0.035K电线仅仅刺穿头骨对每叶的中心钻一个洞使头骨暴露。包含或者单独的聚合甲状腺类似物或和甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子(例如，OP-I，25毫克)或PBS的25毫升溶液通过汉密尔顿注射器注射到每个洞中。溶液被输送到表面以下大约深3毫米处，进入下层皮层、胼胝体和海马。然后缝合皮肤使动物复原。
手术后三日，牺牲大鼠切下头部并对它们的脑部进行切片。通过对神经胶质纤丝酸性蛋白免疫荧光着色的办法来评价瘢痕组织的形成，神经胶质纤丝酸性蛋白是一种为神经胶质伤痕定性地确定瘢痕程度的蛋白标记物。神经胶质纤丝酸性蛋白抗体商业上可得到，例如，从美国密苏里州圣路易的Sigma化学公司。切片也可以用带有抗OP-1抗体确定OP-1的存在来探测。神经胶质纤丝酸性蛋白的降低的水平在用单独的聚合甲状腺类似物或和甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子处理的动物的组织切片中是预期的，证明了单独的聚合甲状腺类似物或和甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子抑制神经胶质瘢痕和刺激神经再生的能力。
用于神经变性疾病的脑显象、诊断和治疗的甲状腺激素、类似物、和聚合结合物的作用 本发明涉及对神经变性疾病的早期诊断、防止和治疗有用的新的药物和放射性药物，比如，例如，阿尔茨海默氏病。本发明也包括新的结合在生物系统中和能用于电子发射断层扫描(PET)、单光子发射(SPECT)成象方法、和磁共振(MRI)成像方法的化合物。T4及其他甲状腺激素类似物在体内结合到局部化配体的能力使利用这样的化合物经PET、SPECT、MRI和类似的成像方法原位成像成为可能。基本上，关于配体的自然状态没有必要知道，只要结合发生，并且这样的结合对所关心的这些细胞、器官、组织或受体是特殊的。
借助带有正电子-发射同位素标记的含示踪原子的化合物PET成像得以完成(Goodman，M.M.临床的电子发射断层扫描，莫斯比年鉴，1992，K.F.Hubner et al.，Chapter 14)。对于大多数生物材料，合适的同位素很少。碳同位素11C，已经被用于PET，但是它的20.5分钟的短暂半衰期限制了它对那些可以很快地合成和纯化的化合物的用处，并限制了设备也就是说产生C11前体原材料的地方贴紧着回旋加速器。其他的同位素半衰期更短。N13的半衰期只有10分钟，O15的半衰期更短，只有2分钟。两者的发射比C11要更多的能量。然而，已经可以用这些同位素进行PET研究(Hubner，K.F.，i临床的电子发射断层扫描，莫斯比年鉴，1992，K.F.Hubner，et al.，Chapter 2)。一种更有用的同位素，18F，半衰期有110分钟。这允许有充分的时间来并入放射性标记的示踪物、纯化和给人或动物患者给药。另外，设备更远离回旋加速器，直到大约200英里周围，可以使用F标记的化合物。18F的缺点是与自然地-存在生物材料功能上等价的氟化类似物相对来说比较稀少，而且用回旋加速器有效地利用原材料产生的合成方法设计很困难。这样的原材料可以是或者氟化物离子或者氟气体。在后者中双分子的气体实际上仅一个氟原子是放射性核素，所以气体指定为F-F18。使用F-F18反应做为原材料从而利用K.F18做为原材料的充裕的反应使产生的产品仅有一半放射性核素。另一方面，F18可以按居里量制备做为氟化物离子用于并入使用游离载体亲核取代反应时理论上为1.7Ci/nmol的高比放射性的放射性药物化合物。F18的能量辐射为0.635兆电子伏，在组织中产生一相对短的，平均2.4毫米正电子范围，允许高分辨率PET成像。
SPECT成像使用那些发射高能光子的同位素示踪物(γ-发射极)。有用同位素的范围比用于PET的大，但是SPECT提供较低的三维分辨力。虽然如此，SPECT广泛用于获得临床上显著的关于结合的类似物、局部化和间隙比率的信息。一个对SPECT成像有用的同位素是I123α-γ-发射极，它有13.3小时的半衰期。带有I123标记的化合物可以从制造的位置运到大约1000英里远的地方，或同位素本身可以运送到该地点合成。百分之八十五的同位素发射有159千电子伏光子，通过SPECT装置很容易调节它。目前已使用。本发明的化合物可以是带有锝的标记。锝-99m是大家都知道的对于SPECT成像有用的放射性核素。本发明的T4类似物通过4-6个碳链加入到锝-99m金属簇，该碳链可以是饱和的或拥有双键或三键。
PET中使用的F18标记化合物限于几个类似的化合物。最显著地，18F-氟去氧葡萄糖已经广泛用于葡萄糖代谢和与大脑活动有关的局部葡萄糖摄取的研究。18F-L-氟多巴及其他多巴胺受体类似物也已用于多巴胺受体分布作图。
其他的卤素同位素可用于PET或SPECT成像，或常用的示踪物标记。这些卤素同位素包括有可用的半衰期和发射特性的75Br、76Br、77Br和82Br。通常，存在化学方法为所描述的同位素替代任何卤素部分。所以，所描述的化合物的任何卤代同族体生物化学的生理学的活动现在可被本领域熟练技术人员使用，包括稳定的同位素卤素同族体。砹可以用于替代其他的卤素同种型。210At，例如，发射α-粒子，半衰期为8.3小时。其他的同位素也发射α-粒子并有有用的半衰期。所以，砹-取代化合物可用于脑部治疗，在那结合是充足地脑-特异的。
大量的研究证明碳水化合物和氨基酸结合进恶性脑细胞中增多。这些累积与促进这些细胞增殖和蛋白质合成有关。葡萄糖类似物18F-2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖(2-FDG)已经被用来很好地从正常的脑组织或良性生长中辨别恶性脑的脑髓。(DiChiro，G.et al.(1982)Neurology(NY)321323-1329)。然而，氟-18标记的2-FDG不是对检测低级脑的脑髓的好的选择试剂，因为正常组织中高的摄取可以掩盖脑的存在。另外，因为在传染性的组织和在膀胱中各自的2-FDG放射性高的摄取量，氟-18标记的2-FDG不是对从传染性的组织或检测卵巢的癌中辨别肺脑髓的理想放射性药物。天然存在的氨基酸甲硫氨酸、带有碳-11标记，也已用于从正常的组织中辨别恶性的组织。但是它在正常的组织中也有比较高的摄取量。此外，碳-11的半衰期仅20分钟；所以C-11甲硫氨酸不能长时间储存。
脑脊液(“CSF”)转甲腺素蛋白(“TTR”)，鼠和人中主要的CSF甲状腺素(T4)载体蛋白在脉络丛(“CP”)中合成。在鼠中延迟注射125I-T4，放射性的T4先在CP中积累，然后在脑脊液中随后在脑中积累(Chanoine JP，Braverman LE.转甲腺素蛋白在甲状腺激素运送到脑脊液和脑髓中的作用.Acta Med Austriaca.1992；19 Suppl 125-8)。
本发明的化合物实质上提供了改善对有淀粉状蛋白质尤其脑的淀粉状蛋白质的体内区域的PET成像。可以并入生物学上的活性化合物的所有的可利用的发射正电子的同位素有短暂的半衰期。因此这些标记化合物实际应用取决于标记化合物能多快合成、合成的产率和最终产品的放射化学纯度。甚至从同位素源、回旋加速器设备、到可以进行PET成像的医院或实验室的装运时间，是有限的。有效的距离的概算是半衰期内每分钟大约两英里。因此，C11，半衰期为20.5分钟，被限制在其来源大约方圆40英里范围内而带有F18标记的化合物能在大约方圆200英里范围内使用。18F标记化合物的进一步的要求是它对受体或目标分子有结合专一性，这些受体或目标分子是用来结合，那些充分低来区分靶向和非靶向结合的与其他的目标的非特异的结合，和那些在测试环境中避免和其他的物质交换的测试的条件下是稳定的标记。更特别地，本发明的化合物必须展示充分的结合到所要求的目标同时与其他的组织或细胞不能结合到任何可比较的程度。
本发明的化合物实质上提供了改善对有淀粉状蛋白质尤其脑部的淀粉状蛋白质的区域的PET成像办法。对PET成像精确的要求的一个局部解决办法是在SPECT成像中使用发射γ射线的同位素。I123是一个对SPECT通常使用的同位素标记物，它有13小时的半衰期和由此而来的从合成位置超过1000英里的有效范围。本发明的化合物可以迅速地和有效地用I标记供做为可以代替PET成像的SPECT分析来使用。此外，因为相同的化合物可以用每一个同位素标记，使通过使用相同的示踪物的PET和SPECT获得的结果进行比较第一次变得有可能。
脑结合的专一性也提供了本发明的I-取代化合物的应用。这样的化合物可以用短寿命的123I标记来进行SPECT成像或用寿命较长的125I来进行长期的研究比如监视一系列疗法。其他碘和溴的同位素可以被替代那些例证中的同位素。
因此，本发明的化合物提供改善使用PET和SPECT对脑显象的方法。该方法必然伴有给患者(它们可以是人或动物，用于实验的和/或诊断的目的)给药，本发明的化合物的成像生成数量和带有合适的同位素标记然后通过PET或SPECT测量混合物的分布，其中如果使用F18或其他的阳电子辐射体就采用PET，如果使用I123或γ辐射源，则采用SPECT。考虑到扫描器的检测灵敏度和噪音水平、同位素的寿命、患者的身体大小和给药途径，所有这些对于已知的和经过本技术领域熟练人员不用过多的试验即可知道的计算和测量可解释的典型的可变量，成像生成数量是PET或SPECT扫描器中能提供的最小的数量。
很清楚，本发明的化合物可以带有任何原子或在结构中结合有这些原子的同位素标记。同时F18、I123和I125由于特别地可用于PET、SPECT和示踪分析在这里已经被强调，其他的使用预计包括那些来自稳定同位素同族体的生理学或药理学性质，这对本技术领域的熟练人员来说是显而易见的。
本发明也提供了通过锝络合物的锝标记。锝的同位素，特别地Tc99m，已经被用于脑显象。本发明提供本发明的化合物的锝-配合的络合物，它们对脑显象很有用。该络合物是通过4-6个碳链加到环状氨基酸中的锝-配位络合物，这里的碳链可以是饱和的或拥有一个双键或三键。在双键存在的地方，E(反式)或Z(顺式)异构体可以被合成，每一个异构体可以被使用。合成中描述了最后一步加入99mTc同位素以达到该同位素的最大使用年限。
下列方法已在这里报道方法过程中应用。利用在95％富集18O的水中和11MeV质子的18O(p，n)18F反应从西门子回旋加速器中产生18F-氟化物。所有的溶剂和化学药品是分析纯并且在使用时没有进一步的纯化。化合物的熔点由使用Buchi公司SP系列装置在毛细管中测定。采用250毫米厚的硅胶G PF-254涂层于铝(从Analtech公司处获得)上进行薄层色谱分析(TLC)。采用60-200目硅胶(aldrich公司)进行柱色谱。红外光谱(IR)记录在带有NaCl镀层的Beckman 18A分光光度计上。质子核磁共振波谱(IH NMR)用带有尼高力的高分辨率仪器在300兆赫处获得。
在别的方面，本发明指导使用本发明的化合物的方法来生产诊断人的阿尔茨海默氏病的放射性药物。在别的方面，本发明指导本发明的化合物制备的方法。
这里所描述的本发明的化合物是甲状腺激素类似物或其他的TTR结合配体，它们结合到TTR并且有能力通过血-脑屏障。因此，该化合物适合做为阿尔茨海默氏病的成像的体内诊断剂。根据本技术领域众所周知的方法过程进行放射性的检测，或者通过γ照相，或者通过电子发射断层扫描(PET)。
优选地，本发明的化合物的游离碱或药物地可接受的盐类形式，例如，一氯化物或二氯化合物盐类，用于草药制剂做为诊断剂。该草药制剂包含本发明的化合物，选择性地包含本技术领域已知的佐剂，例如缓冲液、氯化钠、乳酸、表面活性剂等等。在使用之前可能要在无菌的条件下对该草药进行过滤灭菌。
每次操作放射剂量在1到100mCi范围内，优选地5到30mCi，最优选地5到20mCi。
本发明的各种各样的方面中，某些特定的化合物(例如，实例16-20中公开的化合物)是优选的。特别优选的是在电子发射断层扫描(PET)中用作诊断剂的化合物。
本发明的化合物可能由任何合适的途径给药，优选地采用适合这一途径的药物组合物形式，和在脑中以一结合到TTR的有效剂量从而通过γ照相或PET来检测。典型地，给药是肠胃外的，例如，静脉内、进入腹膜腔内地、皮下地、皮内地、或肌内注射。静脉给药是优选的。因此，例如，本发明提供了对肠胃外给药地组合物，它们包含溶解了造影剂的溶液或可接受的载体中的悬浮液，例如，血清或生理的氯化钠溶液。
水相载体包括水、乙醇的/水溶液、盐水溶液，肠胃外的运载体比如氯化钠、R型葡萄糖等等。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯比如油酸乙酯。其他的药物地可接受的载体、无毒的赋形剂，包括盐类、防腐剂、缓冲剂等等，已被描述，例如，在雷氏药物大全，15.sup.th Ed.EastonMackPublishing Co.，pp.1405-1412 and 1461-1487(1975)和国家药典XIV.，14.sup.th Ed.华盛顿美国药物联合会(1975)中。水相载体是优选的。
本发明的药物组合物通过悬浮或溶解本发明的化合物——选择性地与在草本制剂药学——在水相介质中常用地的添加剂结合，然后选择性地对悬浊液或溶液灭菌来生产，某种意义上本质上是已知的。合适的添加剂是，例如，生理地可接受的缓冲液(比如，例如，氨基丁三醇)、络合剂的添加(例如，二乙基三胺五乙酸)或～如果需要-电解质，例如，氯化钠或～必要时-抗氧化剂，比如抗坏血酸。
如果水中或生理盐溶液中地本发明的化合物的悬浊液或溶液对肠衣给药或其他的目的是值得要的，按照草本制剂药学中的惯例，它们与一个或几个助剂(例如，甲基纤维素、乳糖、甘露醇)和/或表面活性剂(例如，卵磷脂、“吐温”、“Myri”)和/或调味剂相混合来改善味道(例如，有高度挥发性的油类)。
该组合物可能通过传统的、众所周知的灭菌方法来灭菌、可能采用过滤除菌。得到的水溶液可能采用冻干、在给药之前与无菌溶液结合冻干制备包装起来使用。本组合物可以包含根据需要的近似的生理情况药物地可接受的辅助的物质，比如pH调节和缓冲剂、张性调节剂、润湿剂等等，例如，醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂酸山梨醇酐酯、油酸三乙醇胺酯等等。
对于根据本发明有放射性卤素的化合物，这些化合物可以作为“热的”化合物来运输，也就是说，在该化合物中带有放射性的卤素和在例如，生理地可接受的盐水溶液中给药。就金属配合物来说，这些化合物作为“冷的”化合物来运输，也就是说，不带放射性的离子，然后和Tc-信号的洗出液或铼-信号的洗出液相混合。
甲状腺激素、类似物、和聚合结合物在调节多肽活动的作用，其中多肽的细胞表面受体聚集在整合素αβ3、或其他的包含RGD的化合物周围整合素αVβ3是一种带有几个细胞外基质蛋白质配位体的异二聚体质膜蛋白质，包含一氨基酸顺序为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(“RGD”)。使用纯化的整合素，我们发现整合素αVβ3结合T4而且这个交互作用被αVβ3拮抗物扰乱。放射性配体-结合得到研究表明纯化的αVβ3用高的亲合力结合T4(EC50，371pM)、并且似乎在T3上选择性地结合T4。这与前面地报道是一致的，这些报道表明通过T4的MAPK活化和核易位，还有激素-诱导血管生成可与T3相比拟。整合素αVβ3拮抗物抑制T4结合到整合素上，重要地，防止经MAPK信号级联的T4的活化。这个功能的结果-MAPK活化-激素结合到整合素上，通过整合素αVβ3拮抗物与甲状腺激素MAPK-依赖的前血管生成活动的抑制一起，允许我们描述关于作为受体的整合素的碘化甲状腺氨酸-结合部位。注意到，3-iodothyronamine，一种甲状腺激素衍生物，最近已经被Scanlan等弄清楚，它结合酪胺受体(TARI)，但是，有趣地是，这个类似物的作用，与T4和T3的作用正相反。
整合素传统的配位体是蛋白。小分子甲状腺激素，也是整合素的一种配位体，这是一个新的发现。本发明也公开了，白藜芦醇、一种有雌激素的活动的多酚，结合到整合素αVβ3上具有一种功能的细胞后果，即凋亡，不同于那些由甲状腺激素的结合引起的。T4结合处得到整合素的位置位于或者接近异二聚体整合素的RGD结合沟。有可能，然而，αVβ3在蛋白质上的其他地方结合T4，并且被tetrac或RGD占据的RGD识别位点-包含肽别构阻断T4结合位点或在致使T4位点不能利用的整合素内部引起构象变化。因此，由层粘连蛋白的T4的调节——星形胶质细胞的整合素交互作用可能是激素结合到整合素的结果。因此，细胞外部甲状腺激素通过除层粘连蛋白之外的胞外基质蛋白质的整合素αVβ3可能影响配位体，这种可能性是存在的。
机制中是非基因组的T4的活动今年来在很多文献中发表。许多这些活动是MAPK-调节的。我们已经指出，通过甲状腺激素的MAPK级联的活化中的起始步骤，包括蛋白激酶C的活化，对GTPγS和百日咳毒素是很灵敏的，表明，对于甲状腺激素的质膜受体是蛋白G-敏感的。注意到，通过整合素αVβ3调节的某些细胞功能已经有人指出是蛋白质G-调节的。例如，RGD结合区域的定点诱变消除了核苷酸受体P2Y2活化Go的能力，当Gq活化时，核苷酸受体P2Y2活化Go的能力不受影响。王等人证实了整合素-关联的蛋白质，IAP/CD47，通过Gi-调节的MAPK活化的抑制诱导平滑肌细胞迁移。
除由整合素αVβ3对特定的胞内信号转导途径的活化连接T4及其他类似物的结合外，本发明也公开了，经过整合素的激素配位体对通过MAPK-依赖的血管新生的T4诱导来说是必需的。在CAM模型中，T4治疗后48-72小时血管显著的生长，表明T4的质膜作用可以导致复杂的转录变化。因此，细胞表面T4的激素-转导的非基因组的活动的引发——与使新血管形成达到顶点中激素的的基因组作用连接。甲状腺激素的非基因组的和基因组的活动的相互关系在前面已有描述，例如，在TRβ1的丝氨酸-142位点的MAPK-依赖的磷酸化作用，也就是说，通过T4在细胞表面上引发而且通过共阻遏物蛋白和共激活剂的补充的TR引起脱落。直接的发明了也公开了，通过MAPK-依赖的机制T4刺激C-6胶质细胞的生长，也就是说，通过RGD肽抑制，而且通过我们现在已知的由RGD肽抑制的方法过程，甲状腺激素引起MCF-7细胞中核的雌激素受体(ERa)的MAPK-调节的丝氨酸-磷酸化作用。在几个细胞系中的这些发现都支持整合素在细胞对甲状腺激素的功能的应答的参与。
作为对于整合素的交互作用的甲状腺激素指示物的临床意义和血管新生下游的的结果的膜受体的αVβ3的识别。例如，αVβ3在许多肿瘤中过表达并且这些过表达看起来似乎在肿瘤侵入和生长中起作用。甲状腺激素相对固定循环水平可以促进肿瘤-关联的血管新生。除证明这里和其它地方的CAM模型中T4的前血管生成活动外，本发明也公开了，人表皮微脉管内皮细胞当暴露于甲状腺激素时也形成新血管。肿瘤细胞周围的αVβ3拮抗物或tetrac的本地输送可能抑制甲状腺激素-刺激的血管新生。尽管tetrac缺乏许多甲状腺激素的生物活动，它可以进入某些细胞的内部。对非免疫原性底物(琼脂糖或聚合体)的tetrac的锚定、或特定的RGD拮抗物排除了化合物可以穿过质膜而仍保持这里所示的阻止T4-诱导的血管新生的能力的可能性。因此，用于现在的研究中的琼脂糖-T4是对有特定的细胞的作用但是不能进入细胞内部的甲状腺激素类似物的新家族的原型。
因此，这里的实例如作为对甲状腺激素(左旋甲状腺素、T4)的细胞表面受体和作为对胞内信号级联的T4-诱导的活化的起始位点的整合素αVβ3。αVβ3可分离地带有高亲合力的结合放射性标记的T4；放射性配体-结合通过四碘甲腺乙酸(tetrac)、αVβ3抗体和通过整合素RGD识别位点肽来替换。CV-I细胞缺乏核的甲状腺激素受体但是产生质膜αVβ3；用生理学的浓度的T4活化MAPK途径来治疗这些细胞，其效果被tetrac、RGD肽和αVβ3抗体抑制。T4-结合到整合素的抑制剂也阻断MAPK-调节的T4的前血管生成活动。T4-诱导的MAPK磷酸化作用被αV和β3的siRNA基因沉默阻断。这些发现表明T4结合到αVβ3附近的RGD识别位点，并显示激素结合到αVβ3上有生理的结果。
甲状腺激素、类似物和聚合结合物在抑制血管新生中的作用 在另一部分，本发明也提供了对需要它的患者体内抑制血管新生的组合物和方法。通过抑制血管新生来治疗的疾病包括，例如，初期的或肾上腺转移瘤和糖尿病性视网膜病。该组合物可以包括一有效量的TETRAC、TRIAC或mAb LM609。该组合物可以是无菌的、可注射的的形式，药物剂型包括一抗血管生成有效量的抗血管生成物质，该物质在生理地和药物地可接受的载体并选择性地带有一或一个以上的赋形剂中。
在更进一步的方面，本发明提供通过给需要它的患者适量的对抑制血管新生有效的抗血管生成剂给药来抑制血管新生从而治疗疾病。
用来抑制血管新生的抗血管生成剂的实例通过本发明也已提供，包括但是不局限于，四碘甲腺乙酸(TETRAC)、三碘甲腺乙酸(TRIAC)、单克隆抗体LM609，或其结合物。这样的抗血管生成剂可以在细胞表面起作用来抑制原血管新生剂。
肿瘤-有关的新血管生长 通过抑制血管新生来治疗的疾病的实例包括，但是不局限于，初期的或肾上腺转移瘤、包括但不限于神经胶质瘤和乳癌。在这种方法中，抑制甲状腺激素-诱导的血管生成作用的化合物用于抑制血管新生。这种方法的细节在实施例12中阐明。
糖尿病性视网膜病 通过抑制血管新生来治疗的疾病包括，但是不局限于糖尿病性视网膜病和相关的疾病。在这种方法中，抑制甲状腺激素-诱导的血管生成作用的化合物用于抑制血管新生。这种方法的细节在实施例8A和B中阐明。
大家都知道通过氧不足(胜于糖尿病)依赖alphaV(αV)整合素表达诱导的增殖期视网膜病变(E Chavakis et al.，Diabetologia 45262-267，2002)。在这当中建议，特定的整合素阿尔法V贝塔-3(αVβ3)上甲状腺激素的活动在糖尿病性视网膜病发展的过程中是允许的。整合素αVβ3在这里作为对甲状腺激素的细胞表面受体是确定的。甲状腺激素、它的类似物和聚合体结合物通过这些受体来诱导血管新生起作用。
疗法和剂型 甲状腺激素类似物、多聚体形式，和衍生物可用于一种在需要的它的病人体内促进血管新生的方法。本方法包括一有效量的甲状腺激素类似物、多聚体形式和衍生物以低的每日的剂量持续一星期或一星期以上的共同给药。本方法可能用作心肌梗死后修复心脏功能的一种治疗方法。本方法可能也用于改善有冠状动脉疾病遭受心肌缺血或除了心脏区域的局部缺血的病人的血流，这种局部缺血的例子如，周围性血管疾病，例如，外周的动脉阻塞性疾病，在这个地方血流的减少是一个难题。
本化合物可以通过任何医疗地有效方法来给药，这个有效的方法适合于给药的本化合物，包括口的、直肠的、局部的或肠胃外的包括皮下的、肌肉的和静脉内的)给药。例如，腺苷有一个很短的半衰期。为此，它是静脉内给药优选的。然而，腺苷A.sub.2拮抗剂已经发展了，有更长的半衰期并且可以通过其他的方法给药。甲状腺激素类似物、多聚体形式和衍生物可以采用，例如，静脉内、口的、局部的、鼻内的给药方式来给药。
在一些实施方案，甲状腺激素类似物、多聚体形式和衍生物通过不同的方法来给药。
在刺激血管新生中所要求的有效的甲状腺激素、它的类似物、多聚体形式、和衍生物的用量，当然，随待治疗的个体而变化并且最终依照医师的指导。所需考虑的因素包括待治疗病人的健康情况、所使用的特别的腺苷A2受体拮抗剂的功效、剂型的性质和病人的体重。甲状腺激素类似物或它的多聚体形式和衍生物治疗闭塞的剂量是可以提供所希望的效果的任何剂量。
如上所述的化合物是包括和对给药的方式可接受的载体一起的甲状腺激素类似物或它的多聚体形式和衍生物的剂型来给药优选的。如为本技术领域那些熟练人员所知道的，可以使用包含适合于使用目的的活性成分的任何剂型或药物输送系统。为口的、直肠的、局部的或肠胃外的包括皮下的、腹膜内的、肌肉的和静脉内的)给药所适当的药物地可接受的载体是本领域那些熟练人员所知道的。在适合其它剂型的组分或对其容器无害的意义上该载体必须是药物地可接受的。
适合于方便地肠胃外给药的剂型包括灭菌水制备的活性化合物，它和该容器的血是优选地等渗的。因此，这样方便的剂型可能包含蒸馏水、5％葡萄糖蒸馏水溶液或盐溶液。有用的剂型也包括包含配方(I)的化合物地浓溶液或固体，它用以适当的溶剂稀释提供一个适合上面的母本给药的溶液。
对于肠衣给药，化合物可以以分散的单元并入惰性载体中，例如蒴果、扁囊剂、药片或糖锭，每个包含一种预先确定用量的活性化合物；作成粉末或颗粒；或悬浮液或溶于水溶液或非水溶液中，例如，一种糖浆、一种甘香制剂、一种乳剂或一种气雾剂。适当的载体可能是淀粉或糖和包括润滑剂、调味剂、粘合剂及其他相同性质的物质。
可以通过压缩或模具，选择性地带有一或一个以上的附加的组分来制作药片。压片可以通过在一种合适的机器中以自由流动的形式挤压活性化合物来制备，例如，一种粉末或颗粒，选择性地与助剂混合，例如，粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性的或分散剂。模片可以通过在一种合适的机器中将带有任何适当的载体的粉末的混合物模具造型来制得。
糖浆或悬浮液可以通过添加活性化合物到浓缩的糖的水溶液中制得，例如，蔗糖，对此也可以添加任何助剂。这样的助剂可以包括调味剂，一种延迟糖的结晶得试剂或增加任何其它组分可溶性的试剂，例如，如多元醇，例如，甘油或山梨糖醇。
对于直肠给药的剂型可以作为带有传统的载体的栓剂来提供，例如，可可脂或Witepsol S55(德国炸药诺贝尔化学的商标)，作为一种栓剂基质。
做为选择，该化合物可以以脂质体或微球体(或微粒)方式给药。用于制备脂质体和微球体为病人给药的方法对本领域技术人员是众所周知的。U.S.Pat.No.4,789,734，通过引用由此并入本文，描述了将生物物质装入脂质体胶囊的方法。本质上，该物质溶于水溶液，添加适当的磷脂和类脂物，如果需要再一起加入表面活性剂，根据需要对该物质进行透析或超声波处理。已知方法的评论参见G.Gregoriadis，Chapter 14，″Liposomes，″Drug Carriers inBiology and Medicine，pp.287-34 1(Academic Press，1979)。
由聚合体或蛋白形成微球体是本领域技术人员众所周知的，并且可以对通过胃肠道直接进入血流的路径来修整。做为选择，该化合物可以合并和该微球体、或微球体的合成物，植入在数天到数月时间内来缓释。参见，例如，U.S.Pat.Nos.4,906,474，4,925,673 and 3,625,214，and Jein，TIPS 19155-157(1998)，通过引证在此并入本文。
在一个实施方案中，甲状腺激素类似物或它的多聚体形式和腺苷衍生物可以配制成一种脂质体或微粒，脂质体或微粒大小合适能随静脉内给药进入并固定在毛细管床。当脂质体或微粒进入并固定在围绕缺血性组织的毛细管床、该药剂可以局部地给药到最有效的位点。对目标的缺血性组织的合适的脂质体通常小于大约200纳米，代表性地如公开的单层微脂体，参见Baldeschweiler的U.S.Pat.No.5,593,688，题名为“缺血性组织的脂质体靶向”，其内容通过引证在此并入本文。
优选的微粒由可生物降解的聚合物来制备，例如聚糖酯、聚交酯和其共聚物。本领域技术人员可以很容易确定一依赖于多种因素适当的载体系统，这些因素包括药物释放和要求的剂量所要求的比率。
在一个实施方案，该剂型通过导管直接到血管内部给药。例如，给药可以通过导管中的洞进行。在那些实施方案中，该剂型可以被归入生物可降解的聚合水凝胶，例如在Hubbell等申请的美国专利No.5,410,016中所公开的，这些实施方案中活性化合物有一个较长时间的半衰期(大约1日到一周或以上)。这些聚合水凝胶可以输送到组织管腔内部并且随着时间活性化合物释放作为该聚合体降解物。如果需要，该聚合水凝胶可以是微粒或脂质体，这些微粒或脂质体中包括分散的活性化合物，以提供对活性化合物的控释的其它机制。
该剂型可以很方便地以单位剂量形式存在并可能通过任何药剂学领域技术人员所熟知的方法来制备。所有的方法包括促使活性化合物变成和载体联合的步骤，它们构成了一或一个以上的附加的组分通常，该剂型通过均一地和紧密地促使活性化合物变成和液体载体或磨碎的固体载体联合然后，如果必要，将产品成型为所要求单位剂量的形式来制备。
该剂型可以选择性地包括附加的组分，例如各式各样的生理活性物质例如生长因子(包括TGF-β，基本成纤维细胞生长因子(FGF2)、上皮生长因子(EGF)、转换生长因子α和β(TGFα和β)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、和血管内皮生长因子/血管通透因子(VEGF/VPF))、抗病毒的、抗菌的、抗炎的、免疫抑制剂、止痛的、血管化剂、和细胞粘着分子。
除前面提到过的组分之外，该剂型可以更进一步的包括一或一个以上的可选的药物剂型领域技术人员所利用的佐剂，例如，稀释剂、缓冲剂、调味剂、粘合剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、悬浮剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等等。
治疗的剂型和方法 单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物的诱导物、或本发明的单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物受体的拮抗剂可以通过适合使用特别的单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物、诱导物、或拮抗剂的任何路径来给药。因此，视情况而定，给药可以是口的或肠胃外的，包括静脉内的和腹腔进入的给药路线。另外、给药可以通过该单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物、诱导物或拮抗剂的丸药定期的注射来进行，或可以通过由储液器的储液器静脉内的或腹膜内的更多的连续给药，这个储液器是外部的(例如，i.v.袋)或内部的(例如，生物可降解植入物、或植入产生单独的聚合甲状腺类似物或和聚合甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子的细胞群落)。
本发明的治疗剂(即，单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物、单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物受体的诱导物或拮抗剂)可以通过任何合适的方法提供给个体，直接地(例如，局部地，如通过注射、植入或局部的给药到组织位点)或系统地(例如，肠胃外地或口地)。在试剂可以通过肠胃外提供，例如通过静脉内的、皮下的、分子内的、眼科的、腹膜内的、肌肉的、面颊的、直肠的、阴道的、眶内的、脑内、颅内的、脊柱内的、心室内的、鞘内的、脑池内的、囊内的、鼻内的或通过烟雾剂给药，优选的试剂包含水溶液或生理地适合的悬浮液或溶液。因此，单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物载体或运输是生理地可接受的以便除给病人输送所要求地试剂之外，还不用考虑对病人的电解质和/或平衡体积的不利影响。该试剂地液体培养基因此可以包含正常的生理盐水(例如，9.85％NaCl水溶液，0.15M，pH7-7.4)。
带有聚合甲状腺激素类似物替代区域的二聚物的联合产生聚合甲状腺激素类似物的替代形式，它典型地比相应成熟形式更多的可溶于生理溶液。
对肠胃外给药有用的溶液可以通过任何本领域技术人员所熟知的任何方法来制备，例如，参见雷氏药物大全(Gennaro，A.，ed.)，Mack Pub.，1990中的描述。本发明的治疗剂的剂型可以包括，例如，聚二醇如聚乙二醇、植物油、氢化萘等等。直接给药的剂型，特别是，可以包括甘油及其他高粘度的组合物来帮助维持试剂在要求的位点。生物相容的，优选的生物可降解的聚合体包括，例如透明质酸、胶原、磷酸三钙、聚丁酸、丙交酯、和乙交酯聚合体和丙交酯/乙交酯共聚物、控制试剂体内释放可能有用的赋形剂。对这些试剂其他的可能地有用的肠胃外的输送系统包括乙烯-醋酸乙烯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的输液系统、和脂质体。吸入剂给药的剂型包含如赋形剂，例如，乳糖，或可能的水溶液包含，例如，聚氧化乙烯-9-月桂基醚、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐、或油溶液以滴鼻剂、或作为凝胶应用于鼻内的形式来给药。肠胃外给药的剂型也可以包括对面颊给药的甘胆酸盐、对直肠给药的甲氧基水杨酸甲酯、或对阴道给药的柠檬酸。对直肠给药的栓剂也可以通过混合单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物、诱导物或拮抗剂来制备，这些单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物、诱导物或拮抗剂带有一种无刺激性的赋形剂例如可可脂或其他的组合物，它们在室温下是固体并且在体温下是液体。
局部给药到皮肤表面的剂型可以通过将单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物、诱导物或拮抗剂分散在皮肤病学上可接受的载体如饮料、奶油、软膏或皂中。特别有用的是能在皮肤上形成膜或层定位应用并且抑制脱离的载体。对内部组织表面局部给药，本试剂可能分散在一种液体组织粘合剂或其他的已知的提高组织表面吸附的物质。例如，使用羟丙基纤维素或纤维蛋白原/凝血酶溶液可能更有好处。做为选择，可使用组织-涂层溶液，如果包含果胶的剂型。
做为选择，这里所描述的试剂可以口服给药。作为治疗剂的蛋白口服给药通常没有实践，因为大多数蛋白容易被消化酶降解并且在它们可以吸收到血液中以前哺乳动物消化系统中是酸性的。然而，典型地这里所描述的单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物是酸稳定的并且抗蛋白酶的(参见，例如，U.S.Pat.No.4,968,590)。另外，OP-I、已经在乳腺提出物、初乳和57天的牛奶中识别。从乳腺提出物中纯化的OP-I是形态发生活性的并且也在血液中检测到。通过摄取奶的母性给药，是TGF-β超家族蛋白的一种自然输送路径。Letterio，et al.，Science 2641936-1938(1994)报道，TGF-β存在于鼠奶中，而且放射性同位素标记的TGF-β通过幼年哺乳动物胃肠的粘膜来吸收。标签的、摄取的TGF-β迅速地在幼体身体组织中以完整的形式出现，这些组织包括肺、心脏和肝。最终，可溶解的形式的单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物，例如，成熟期有或者没有抗氧化剂或抗炎剂的单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物。这些发现，和在下面实例中那些公开的，表明口服和肠胃外给药是对包括单独的聚合甲状腺类似物或和聚合甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子的TGF-β超家族蛋白给药到个体的办法可行的。另外，典型地这里所描述的某些单独的聚合甲状腺类似物和聚合甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子的成熟形式是微溶的，奶(并且乳腺提出物和初乳)中发现的单独的聚合甲状腺类似物或和聚合甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子形式是易溶的，可能通过带有部分或所有的表达的全长的多肽序列的替代域的成熟的、形态发生的-活性形式的联合和/或通过带有一或一个以上的奶组分的联合。因此，在这里提供的化合物也与能提高它们在体外或体内的溶解度的分子有关。
单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物打算用于对CNS异常的治疗剂时，一增加的问题必须解决克服血脑屏障，脑毛细血管壁结构有效地筛除所有除了存在于血中所选择的种类物质，阻止他们进入脑中的途径。血脑屏障可以通过向脑中直接输注聚合甲状腺激素、或通过鼻内给药或适合于吸收剂型的吸入剂和通过嗅觉神经元的逆行运输来有效地绕过。做为选择，聚合甲状腺激素类似物可以修饰来提高它穿过血脑屏障的运输。例如，单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物的平头形式或单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物——刺激剂可以非常成功的。做为选择，使用本领域技术人员所知的标准方法，这里所提供的单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物、诱导物或拮抗剂可以衍生或共轭到亲脂性的部分或积极运输穿过血脑屏障的物质上。例如，参见，Pardridge，Endocrine Reviews 7314-330(1986)and U.S.Pat.No.4,801,575。
这里提供的化合物也可能与能靶向结合单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物、诱导物或拮抗剂到要求的组织有关。例如，可以使用那些与特定的带有所要求组织的细胞表面分子互相作用的抗体、抗体碎片、其他的结合蛋白。可以设计有用的靶向分子，例如，使用U.S.Pat.No.5,091,513中公开的单链结合位点技术。靶向分子可以是共价的或非共价的与单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物、诱导物或拮抗剂相关联。
作为一个本领域普通技术人员应该理解的是，配制的组合物包含治疗-有效的量的单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物、诱导物或它的拮抗剂。也就是说，它们包含一数量，这个数量提供该试剂的适当的浓度来暂时死亡影响神经系统组织使其足够刺激削弱的中央的或外周神经系统功能的可检测的恢复，直到和包括它的完全的恢复。作为本领域熟练技术人员高兴的是，这些浓度的变化依赖许多因子，包括选择的试剂的生物学的功效、该特定的试剂的化学特性(例如，疏水性)、它的剂型，包括一种带有一或一个以上的赋形剂的混合物、给药途经、和治疗前景，包括不管活性成分直接给药到组织位点、或系统地给药。给药优选的剂量也可能依靠可变量如疾病或损伤组织的健康状况、和特定的哺乳动物的全面健康状态。作为一般的物质，0.00001-1000mg的单独的聚合甲状腺类似物或和聚合甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子的单一的、每日的、每两周或每周的剂量在抗氧化剂和/或消炎剂存在的情况下是充足的，优选0.0001-100毫克，并且更优选0.001到10毫克。做为选择，0.01-1000.mu.g/公斤体重的单一的、每日的、每两周的或每周的剂量，更优选的0.01-10mg/公斤体重，可以有利地使用。如特定的环境下所要求的或考虑适当的，提供的有效剂量可以以单一剂量或多次(两个或更多)分期的剂量。一种快速浓注或扩散输注剂型能被使用。如果希望促进重复或频繁的输注，半永久性的扩张(例如静脉内的、腹膜内的、脑池内的或囊内的)的的植入可能是可行的。
本发明的单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物、诱导物或拮抗剂可以、当然，单独的给药或和聚合甲状腺激素类似物结合在一起的已知的治疗这里所描述的的疾病中有益的其他分子一起给药。例如，各式各样的众所周知的生长因子、激素、酶、治疗剂组合物、抗生素、或其他的生理活性试剂也可以和单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物一起给药。因此，各式各样的已知的生长因子如NGF、EGF、PDGF、IGF、FGF、TGF-α、和TGF-β，又如酶、酶抑制剂、抗氧化剂、消炎剂、自由基清除剂、抗生素和/或趋化/趋化因子，可以归入提供的单独的聚合甲状腺激素类似物或和神经生长因子或其他的神经发生因子结合在一起的聚合甲状腺激素类似物剂型。
材料和方法 试剂所有的试剂是化学纯级别，购自Sigma化学试剂公司(St.Louis，MO)或通过VWR科学(Bridgeport，NJ)。醋酸可的松、牛血清白蛋白BSA)和明胶溶液(来自牛皮的2％类型B)购自Sigma化学试剂公司。授精鸡蛋购自Charles River实验室、SPAFAS鸟类的产品和维护North Franklin，CT)。T4、3，5，3′-三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)、四碘甲腺乙酸tetrac)、T4-琼脂糖、6-N-丙基-2-硫尿嘧啶(PTU)、包含RGD的肽包含RGE的肽从Sigma获得；PD 98059购自Calbiochem；CGP41251是NovartisPharma(巴塞尔、瑞士)馈赠的。多克隆的抗FGF2和单克隆抗β-肌动蛋白是从圣克鲁斯厂生物技术公司获得和人重组体FGF2和VEGF来自Invitrogen公司。磷酸化ERK1/2的多克隆抗体来自新英格兰生物实验室，山羊抗兔IgG来自DAKO。对αVβ3(SC73 12)和α-微管蛋白(E9)的单克隆抗体购自圣克鲁斯厂生物技术公司(圣克鲁斯厂，CA)。正常的老鼠IgG和HRP-共轭的山羊抗兔Ig购自Dako Cytomation(Carpinteria，CA)。对αVβ3(LM609)和αVβ5(P1F6)的单克隆抗体，又和纯化αVβ3，购买chemicon(Temecula、CA)。L-[125I]-T4(比放射性，1250μCi/μg)从Perkin Elmer生命科学(波士顿、MA)处获得。
血管新生的绒毛尿囊膜(CAM)模型体内新血管形成通过以前所描述的方法来检测。9-12十日龄的鸡胚购自SPAFAS(Preston、CT)，37℃、相对湿度55％条件下孵化。用皮下注射器针头在壳上隐藏气囊上制造一个小孔，第二个孔直接在通过蜡烛鉴别得胚胎的薄膜得无血管部分的蛋的宽边制得。一个漏气囊在第一个洞处通过使用负压在第二个洞下面创造，引起CAM从壳中分离。用一种小的手工制作的砂轮在掉下的CAM切出大约1.0平方厘米的口(Dremel，Emerson Electric Co分离)、允许在下面的CAM直接存取。FGF2(1μg/毫升)用作标准前血管生成试剂来诱导十日龄胚胎的CAM上的新血管支流。1号滤纸的无菌圆片用3毫克/毫升醋酸可的松和1mmol/L PTU并在无菌条件下风干进行预处理。然后将甲状腺激素、激素类似物、FGF2或对照溶剂、和抑制剂应用于圆片和允许干燥的圆片。然后将圆片悬浮在PBS中并放置在生长的CAM上。用T4或FGF2处理的过滤器放在3天孵化的第一天上，用对FGF2的抗体加入30分钟后选择样品作为指示。24小时时，、MAPK级联抑制剂PD 98059通过过滤圆片也全加到CAM上。
CAM部分的显微分析37℃相对湿度55％条件下孵化3日，直接从控制和处理的CAM样品中切除在每个过滤圆片下面的CAM组织。用PBS洗涤组织3次，放入35毫米皮氏培养皿(NalgeNunc)，在SV6立体显微镜(Zeiss)下放大50倍检验。暴露于过滤器的CAM部分的数字成像使用一个3电荷耦合器彩色摄像机系统(东芝)来收集并用图像前处理软件(媒体控制学)来分析。计数包含等于每个过滤圆片面积的圆形区域的血管分支点数目。在每个CAM制备中计入图像，从8到10个CAM制备中发现来分析每种治疗的疾病(甲状腺激素或类似物、FGF2、FGF2抗体、PD 98059)。另外，每个实验执行3次。产生的血管新生指数是每套样品种新分支点的平均±SEM。
FGF2测定ECV304内皮细胞培养于补充10％胎儿牛血清的M1 99培养基中。ECV304细胞(106细胞)铺于0.2％凝胶-涂层的24孔板在完全培养基中过夜，然后将细胞用游离血清培养基洗涤并用T4和T3处理作为指示。72小时后，收获上层清液使用商业ELISA体系(R&D系统)对没有稀释的FGF进行测定。
MAPK活化ECV304内皮细胞培养于0.25％激素的血清13的M199培养基2日耗尽激素。然后用T4(10-7mol/L)处理细胞15分钟到6小时。在另外的实验中，用T4或者FGF2或用PD98059或CGP41251存在时用T4处理细胞。核的碎片通过前面我们报道的方法从所有样品中预先清除，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，并且转入薄膜用对磷酸化ERK1/2的抗体来免疫印迹。核磷酸化的ERK1/2的出现表明通过T4这些MAPK同种型的活化。
反转录-聚合酶链反应10cm平皿中汇合的ECV304细胞用T4(10-7mol/L)6到48小时并且使用胍盐异硫氰酸盐提取总RNA(Biotecx实验室)。使用Access RT-PCR系统(Promega)取RNA(1μg)进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)。在48℃45分钟然后94℃变性2分钟，总RNA反转录为cDNA。第二条链合成和PCR扩增执行40个循环，循环条件为94℃变性30秒、60℃退火60秒、并且68℃延伸120秒，在所有循环完成后再在68℃下延伸7分钟。对FGF2的PCR引物如下FGF2正义链5′-TGGTATGTGGCACTGAAACG-3′(SEQ ID NO2)；FGF2反义链5′-CTCAATGACCTGGCGAAGAC-3′(SEQ IDNO2)；PCR产物的长度是734bp。对GAPDH引物包括正义链5′-AAGGTCATCCCTGAGCTGAACG 3′(SEQIDNO3)、和反义链5′-GGGTGTCGCTGTTGAAGTCAGA-3′(SEQ IDNO4)；PCR产物的长度是218bp。RT-PCR的产物通过1.5％琼脂糖凝胶电泳并加入溴化乙锭使其可见来分离。凝胶的目标条带使用Lablmage软件(Kapelan)来定量，并且FGF2/GAPDH X10的值适合于每次时间点。
统计分析通过单因子变异数分析(变量分析)比较实验组和各个控制组来进行统计分析，基于此计算得到的统计显著性P＜0.05。
Matrigel FGF2或者老鼠中癌细胞系植入物中的体内血管新生体内鼠的血管新生模型鼠的matrigel模型按照以前所描述的方法实施(Grant等，1991；Okada等，1995)并且在我们的实验室中实施(Powel等，2000)。简短地，生长因子游离matrigel(Becton Dickinson，Bedford MA)在4℃置于冰上解冻过夜。分装的matrigel放在冷的聚丙烯管中并且将FGF2、甲状腺激素类似物或者癌细胞(1×106细胞)加入matrigel。将带有盐水、FGF2、甲状腺激素类似物或者癌细胞的matrigel以不同的剂量皮下注射。对照的和实验的凝胶植入物放入一个含有0.5毫升的细胞裂解液(Sigma，St.Louis，MO)的微型离心管中并且用杵压碎，将该管在4℃孵化过夜并且在第二天1500g离心15分钟。对每个样品将200μl分装的细胞裂解液加入到1.3毫升的Drabkin试剂溶液(Sigma，St.Louis，MO)。此溶液在540纳米下用分光光度计分析。光的吸收与包含于样品中的血红蛋白的数量成比例。
肿瘤植入物的肿瘤生长和代谢-鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型本方案在前面已描述(Kim等，2001)。简短地、1×107肿瘤细胞放在每个CAM表面(7日龄胚胎)孵化一个星期。切除产生的肿瘤并切成50毫克的碎片。这些碎片放在增加的10CAM/群上并在随后的几天全部用25μl溶于PBS的化合物(A-D)来处理。七天后，将肿瘤从蛋中切除，肿瘤重量将确定每个CAM。图8是一个简图，它表明CAM中涉及体内肿瘤生长模型的步骤。
关于肿瘤生长率、肿瘤血管新生、和癌细胞系的肿瘤代谢的TETRAC、TRIAC、和甲状腺激素拮抗物的作用可以确定。
老鼠的肿瘤生长和代谢-肿瘤异种移植模型该模型的描述参见我们的出版物，Kerr et al.，2000；Van Waes et al.，2000；AIi et al.，2001；and AIi et al.，2001，这些出版物中的每一个通过引用在这里全面地并入全文。可以确定和比较对TETRAC、TRIAC、及其他甲状腺激素拮抗物在不同的剂量和抗不同肿瘤类型的抗肿瘤效果。
肿瘤生长和代谢-代谢的实验模型该模型的描述参见我们近期的出版物(Mousa，2002；Amirkhosravi et al.，2003a and 2003b，这些出版物中的每一个通过引用在这里全面地并入全文)。简短地，B16鼠的恶性黑色素瘤细胞(ATCC，Rockville，MD)及其他肿瘤系在补充有10％胎牛血清、青霉素和链霉素(Sigma，St.Louis，MO)的RPMI 1640(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养。细胞培养到70％克隆率并用胰蛋白酶-EDTA(Sigma)收获，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次。细胞在PBS中重悬浮，为了代谢实验使其浓度在2.0×105细胞/毫升。动物称重为18-21克的C57/BL6鼠(Harlan，印第安纳波利斯，印地安那州)将用于这些研究。所有程序与IACUC和实验指南一致。可以确定和比较对TETRAC、TRIAC、及其他甲状腺激素拮抗物在不同的剂量和抗不同的肿瘤类型的抗肿瘤效果。
关于血管新生的甲状腺激素类似物的作用。
T4诱导CAM模型中血管新生指数(基础上的成倍增加)显著的增加。同通过1μg的FGF2的血管新生指数中2-3倍增加来说，0.001-1.0μM的T3或者0.1-1.0μM的T4在获得最大效果在血管新生指数产生2-2.5倍的增加。(表格1和图1a和1b)。T4促进血管新生的效果(血管新生指数的2-2.5倍增加)是在有或没有PTU存在的情况下达到的，其中PTU抑制T4到T3的转化。在CAM模型中T3本身(91-100nM)诱导的有效的前血管生成作用。T4琼脂糖产生同通过T4获得的类似的前血管新生作用。T4或T4-琼脂糖的前血管生成作用通过TETRAC或TRIAC可以100％阻断。
通过次最大浓度的T4的FGF2的前血管生成活动的增强。
次最大浓度处T4和FGF2的结合引起血管新生指数中一附加的增长直到像FGF2或T4的最大前血管新生效果相同的水平(图2)。
关于CAM模型中T4和FGf2的前血管生成活动的MAPK级联抑制剂的效果。T4或FGF2的前血管新生效果通过0.8-8μg的PD98059完全阻断(图3)。
关于CAM模型中T4和FGf2的前血管生成活动的特定的整合素αVβ3拮抗物的效果。T4或FGF2的前血管新生效果通过10μg的特定的单克隆抗体LM609完全被阻断(图4a和4b)。
CAM测定已经用于证实各种各样的生长因子及其他血管新生的助催化剂或抑制剂的血管生成活动。在目前的研究中，生理学的浓度的T4被证明有前血管生成，与FGF2类似的活动。PTU的存在减低了T4的效果，表明T4的去碘化作用产生T3在这个模型中不是先决条件。因为在这个模型中新血管的出现需要几日，我们假定甲状腺激素的效果完全取决于该核的受体对甲状腺激素(TR)的交互作用。那些需要核内的TR与自然的配位体、T3的络合的碘化甲状腺氨酸的活动，通过定义是基因组的，并在基因表达中达到顶点。另一方面，这个模型系统对T4而不是T3的优选的应答，TR的自然的配位体增加了血管新生可能通过T4在质膜上非基因组的引发并达到那些需要基因转录的效果顶点的可能性。已经广泛描述的T4的非基因组活动，通常在质膜上引发，并可以通过信号转导途径调节。它们不需要碘化甲状腺氨酸和TR的核内的配体结合，但是可以协调或调整基因转录。也已被很好的描述的类固醇的非基因组活动并已知道协调类固醇或其他的化合物的基因组活动。用T4和tetrac或用琼脂糖-T4进行的实验表明实际上T4的前血管生成效果很可能是在质膜上引发的。我们在别处已指出tetrac阻断T4的膜-引发的效果，但是它本身不活化信号转导。因此，它是对甲状腺激素的非基因组活动的一个探针。琼脂糖-T4被认为不能到达细胞内部入口并被我们和他人用来检验对激素可能的细胞表面-引发的活动模型。
这些结果表明通过甲状腺激素MAPK活化的另一结果是新血管的生长。后者被非基因组的引发，但是理所当然需要一个必然的复杂的基因转录程序。
甲状腺激素的环境浓度相对是稳定的。CAM模型，当我们检验它的时候，是thyroprival和因此可以被认为是一个体系，这个体系不能复制完整的有机体。我们认为T4的循环水平和各种各样的其他的调节器来用于调整血管对内生的血管生成因子，如VEGF和FGF2的敏感性。
三维血管新生测定 培养于涂有纤维蛋白的微载体珠上的人表皮微血管内皮细胞的体外三维发芽的血管新生用白明胶-涂层的Cytodex-3珠以每珠40个细胞(24孔板，150-200珠每孔)的比率和HDMEC(路径5-10)混合在一块，用5毫升EBM+15％正常人血清悬浮，，前4小时每小时轻轻的混合，然后置于CO2培养箱培养过夜。次日，加入10毫升新鲜的EBM+5％HS，将此混合物继续培养3小时。进行实验之前，检查EC-珠的培养；然后加入500ulPBS到24孔板中的每个孔，再将100ul的EC-珠培养液加到PBS中。计数珠的数目，并计算EC/珠的浓度。
准备有或者没有血管新生因子或试验因子的EBM培养基中的纤维蛋白原溶液(1毫克/毫升)。阳性对照，使用50ng/mlVEGF+25ng/ml FGF2。EC-珠用EBM培养基洗涤两次，并将EC-珠加到纤维蛋白原溶液中。对每种疾病实验分三组进行。EC-珠轻轻地混入纤维蛋白原溶液中，并将2.5ul人凝血酶(0.05U/ul)加入到1毫升纤维蛋白原溶液中；立即向24孔板每个孔中加入300ul混合溶液。纤维蛋白原溶液在5-10分钟内聚合；20分钟后，我们添加EBM+20％正常人血清+10ug/ml抑蛋白酶肽。平皿置于CO2培养箱中培养。对HDMEC大约需要花费24-48小时来侵入纤维蛋白凝胶和形成的管。
对以前设计用来研究在牛纤维蛋白凝胶中牛肺动脉内皮细胞血管生成行为的体外血管新生测定的微载体(Nehls andDrenckhahn，1995a，b)进行修饰用来研究三维ECM环境中人微脉管内皮细胞的血管新生。(图1和2)。简短地，如前面所描述的(Feng等，1999)分离到的人纤维蛋白酶原，溶于M199培养基中，浓度为1mg/ml(pH7.4)并用0.22微孔过滤器过滤灭菌。1.5等渗透压的1.5mg/ml胶原溶液通过无菌的Vitrogen 100混入5×M199培养基和蒸馏水中制得。在某些实验中，生长因子和ECM蛋白(如VEGF、bFGF、PDGF-BB、血清、白明胶和粘连蛋白)加入到纤维蛋白原或胶原溶液中。随后，EC-珠-胶原或EC-珠-纤维蛋白原悬浮液(500EC-珠/毫升)加到24孔板上，每孔300ul。EC-珠-胶原在37℃培养形成凝胶。加入凝血酶至终浓度为0.5U/毫升后，EC-珠-纤维蛋白培养物在室温下不到5分钟产生凝胶。凝胶化后，往每个孔中加入1毫升新鲜的测定培养基(对HDMEC补充有20％正常人血清的EBM或补充有10％胎牛血清的EBM)。血管生成应答通过视频图像俘获可以可见的监视并记录。特别地，用配备有Nikon NP-2恒温器和Sheldon#2004二氧化碳流体混合器的怛温培养室的Nikon Diaphot-TMD倒置显微镜(Nikon公司；Melville，NY)，可以观察和记录毛细血管发芽形成。该显微镜直接连接到由Dage-MTI CCD-72S摄像机和连接到Macintosh G3电脑的索尼12″PVM-122屏幕显示器组成的视频系统。使用Adobe Photoshop以各种放大倍数捕获图像。关于发芽的血管新生的血管生成因子的效果通过测定带有毛细管发芽的EC-珠的数目和百分比来可见地定量。计数每个试验条件下三组孔中每个孔中地100个珠(五到六个随机的低倍视野)。所有的实验至少重复三次。
细胞培养。
非洲绿猴成纤维细胞系，CV-I(ATCC、Manassas，VA)，它缺乏对甲状腺激素的核受体，以5000细胞/平方厘米平铺并维持在补充有10％(v/v)加热钝化的FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、和2mM L-谷氨酰胺的DMEM中。所有的培养试剂购自Invitrogen公司(Carlsbad，CA)。在5％CO2、37℃加湿室中培养。每三天更换一次培养基并在80％克隆率时传代。对实验的处理，将细胞铺在10厘米细胞培养皿(康宁公司，康宁，NY)并允许在包含10％FBS的培养基中生长24小时。用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗细胞两次并补充补充有青霉素、链霉素和HEPES的游离血清的DMEM。在游离血清培养基中培养48小时后，细胞用载体控制(带有0.4％聚乙二醇(v/v)的终浓度为0.004 N KOH)或T4(终浓度为10-7M)处理30分钟；然后收集培养基并通过酶免疫测定来确定游离T4水平。有10-7M总T4的培养物中有10-9到10-10游离的T4。随后的处理，如以前所描述的方法来收获细胞和制备核内蛋白。
用siRNA瞬时转染。
将CV-I细胞铺于10厘米平板上(150,000细胞/平板)并在补充有10％FBS的DMEM中培养24小时。在OPTI MEM(Ambion，Austin，TX)中漂洗细胞并根据厂商的指导使用siPORT用siRNA(100nM最终浓度)转染到αV、β3、或一块的αV和β3。CV-I细胞用扰乱siRNA转染，作为一个阴性对照。转染后四小时，加入7毫升包含10％FBS的培养基到平板中并允许培养过夜。然后用PBS漂洗细胞并在用T4处理前放入释放血清DMEM中48小时。
RT-PCR的RNA分离 根据厂商的指导使用购自Qiagen(巴伦西亚，美国)的RKeasy试剂盒从转染后的72小时细胞培养物中提取总RNA。根据厂商的指导使用Access RT-PCR系统(Promega，Madison，WI)对二百纳克总RNA进行反转录。基于发表的种特异性的序列的引物αV(登记号NM-002210)F-5′-TGGGATTGTGGAAGGAG和R-51-AAATCCCTGTCCATCAGCAT(319bp产物)，β3(NM000212)F-5′-GTGTGAGTGCTCAGAGGAG和R-5′-CTGACTCAATCTCGTCACGG(515bp产物)，和GAPDH(AF261085)F-5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT和R-51-TGAGCTTGACMGTGGTCG(212bp产物)。在TECHNE公司(Burlington，NJ)的Flexigene热循环仪中进行RT-PCR。95℃培育2分钟后，对下面的步骤进行25个循环94℃变性1分钟、57℃退火1分钟、68℃延伸1分钟，并进行25个循环。PCR产物采用溴化乙锭着色在1.8％(w/v)琼脂糖凝胶上可见。
Western印迹。
分装的核内蛋白(10μg/条带)混有Laemmli样品缓冲液并通过SDS-PAGE(10％分离胶)分离然后转到硝酸纤维素膜上。用5％脱脂奶在包含1％Tween-20(TBST)的Tris缓冲液30分钟阻断后，用1∶1000稀释的对磷酸化p44/42 MAP激酶(细胞信号技术，Beverly，MA)的单克隆抗体和膜在有5％牛奶的TBST中4℃培养过夜。该膜在TBST中洗涤3×5分钟，并采用化学发光(ECL，Amersham)来检测免疫活性蛋白。谱带强度由使用VersaDoc 5000成像系统(Bio-Rad，Hercules CA)来确定。
放射性配体结合的检测。
2μg纯化的αVβ3与标明浓度的试验化合物混合并允许在室温下培养30分钟。然后加入[125I]-T4(2μCi)，该混合物允许在20℃下再培养30分钟。将样品样品缓冲液(50％甘油、0.1MTris-HCl、pH6.8、和溴酚蓝)混合，于冷的环境中在5％基础-自然的凝胶上45mA跑胶24小时。拆开仪器并把凝胶放在滤纸上，包入塑料包中，暴露显影。条带强度使用VersaDoc 5000成像系统来确定。
鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)测定(αVβ3的研究)。
十日龄鸡胚购自￡tom SPAFAS(Preston，CT)并在37℃、相对湿度55％条件下培养。用皮下注射器针头在蛋的平头做一个小孔，第二个孔在该蛋的宽边，直接在胚胎膜无血管部分获得。从第一个孔轻微的吸取替换气囊并使CAM脱离蛋壳。使用一个Dremel模型手工制作的钻，在漏气的囊上的蛋壳中切开一个大约1.0平方厘米的口，从而可以得到CAM。1号滤纸的无菌圆片(Whatman、Clifton，NJ)用3mg/ml醋酸可的松和1mM PTU预处理并在无菌情况下风干。甲状腺激素、对照溶剂和mAb LM609被用于该圆片上，随后进行干燥。然后将该圆片悬浮在PBS中，并放置在生长的CAM上。培养3天后，切除过滤圆片下面的CAM并用PBS漂洗。每个膜置于35毫米皮氏培养皿中并在SV6立体显微镜下以50×放大倍数检查。采用图像前处理软件(Mediacybemetics)捕获和分析数字图像。计数包含等同于过滤圆片面积的圆形区域的血管分支点的数目。对为了每个治疗情况的8-10CAM标本的每一个图像进行计数，另外，每次实验进行3次。
本发明将在下面的非限制的实例中进一步阐述。
实施例 实施例1 甲状腺激素在血管生成中的作用如图IA所示和图IB的概括，L-T4和L-T3都能在CAM试验中提高血管生成。T4在介质中的生理总浓度为0.1μmol/L时，能够将血管支流形成提高2.5倍(PO.001)。T3(1nmol/L)也能刺激血管生成提高2倍。通过发现脱碘酶抑制剂PTU对T4造成的血管生成没有抑制效果，可以排除由于5′-单脱碘酶将T4转化为T3造成的T4是唯一有效的可能性。将PTU应用于CAM模型中使用的所有过滤片。因此，在早已被标准化用于生长因子试验的CAM模型中，T4和T3促进新血管支流的形成。
实施例2. T4-琼脂糖和Tetrac先前已经显示出T4-琼脂糖能够用和T4一样的方法刺激起始于原生质膜上的细胞信号转导途径，而且T4和T4-琼脂糖的作用被脱氨基碘化甲状腺氨酸同系物阻断，其中，已知脱氨基碘化甲状腺氨酸同系物tetrac能够抑制T4与原生质膜的结合。在CAM模型中，tetrac的加入(0.1μmol/L)能够抑制T4的作用(图2A)，但单独使用tetrac对血管生成没有影响(图2C)。当以0.1μmol/L的激素浓度添加时，T4-琼脂糖的作用比得上T4在CAM模型中的作用(图2B)，且T4-琼脂糖的作用也被tetrac的作用抑制(图2B；概括在2C中)。
实施例3.次最大浓度的T4增强FGF2的前血管生成活性 血管生成是一种复杂的过程，通常需要多肽生长因子的参与，CAM试验需要至少48小时才能表现出血管生长；因此，在此模型中的甲状腺激素的表观原生质膜作用很可能导致一种对于激素复杂的转录反应，已经确定无论FGF2是否包含于激素反应中且无论激素是否可能加强次生理水平的生长因子的作用。T4(0.05μmol/L)和FGF2(0.5μg/mL)分别刺激血管生成到适当的程度(图3)。通过次生理浓度的T4，能够将次最大浓度的FGF2的血管生成作用提高到单独使用1.0μgFGF2才能达到的水平。因此，次最大激素和生长因子浓度的作用好象是一种添加剂。为了更准确的定义FGF2在甲状腺激素刺激中的作用，向用FGF2或者T4处理过的过滤器中加入一种FGF2的多克隆抗体，72小时之后测量血管生成。图4显示，在没有外生FGF2的情况下，FGF2抗体抑制FGF2或T4刺激的血管生成，暗示FGF2表达能够调节T4在CAM试验中的作用。对照物IgG抗体在CAM试验中没有刺激作用或者抑制作用。
实施例4.通过甲状腺激素刺激FGF2从内皮细胞中释放 用T4(0.1μmol/L)或者T3(0.01μmol/L)处理ECV304内皮细胞3天，并以此ECV304内皮细胞为介质测定FGF2的水平。如表2所示，在介质中T3刺激的FGF2浓度增长3.6倍，而T4能够导致1.4倍的增长。这一发现表明，通过提高可以作用于内皮细胞的生长因子浓度，甲状腺激素可能提高，至少部分地提高FGF2的血管生成作用。
表2.T4和T3对FGF2从ECV304内皮细胞中释放的作用 *P＜0.001，将T3-处理的样本与ANOVA对照样品比较； F＜0.05，将T4-处理的样本与ANOVA对照样品比较。
实施例5.ERK1/2信号转导途径在通过甲状腺激素和FGF2刺激血管生成中的作用 T4对细胞发挥非免疫性作用的途径是MAPK信号传递链，具体地，是ERK1/2活化的信号传递链.已知T4能够通过表皮生长因子提高ERK1/2活化作用.通过利用PD 98059(2到20μmol/L)来检验MAPK途径在甲状腺激素刺激的FGF2表达中的作用，其中，PD 98059是一种通过酪氨酸-苏氨酸激酶MAPK激酶-1(MEK1)和MEK2来抑制ERK1/2活化作用的抑制剂.表中的数据表明，PD 98059有效地阻断FGF2从用T4或者T3处理的ECV304内皮细胞中移出.在CAM试验中进行ERK1/2的平行研究，图5表示了有代表性的结果.生理浓度的T3和T4的结合物致使血管分支增加2.4倍，通过3μmol/L PD98059(图5A)能够完全阻断此作用(图5A)。ERK1/2活化作用的抑制剂(图5B)能够有效地阻断FGF2刺激的分支形成(2.2-倍)。因此，甲状腺激素的前血管生成作用开始于原生质膜且包括ERK1/2途径的活化作用，从而促进FGF2从内皮细胞中释放。ERK1/2活化作用是传导FGF2信号和促成新血管形成的再次要求。
实施例6.在用T4(10″7mol/L)处理15分钟到6小时的ECV304细胞中研究甲状腺激素和FGF2对MAPK活化作用刺激的磷酸化作用和ERK1/2 MAPKs的核移位作用的影响 在用T4处理的15分钟内细胞核中出现磷酸化的ERK1/2，当处理30分钟时，磷酸化ERK1/2达到最大浓度，且持续存在6小时(图6A)。由于化合物通过MAPK激酶阻断ERK1/2的磷酸化作用，可以预见到的结果是通过PD 98059能够抑制激素的这种作用(图6B)。同我们所看到的T4在其他细胞系中的作用一样，传统的蛋白激酶C(PKC)-O、PKC-β、和PKC-γ抑制剂CGP41251也能阻断细胞中激素对MAPK活化作用的影响。甲状腺激素提高了几个细胞因子和生长因子的作用，例如干扰素-γ13和表皮生长因子。在ECV304细胞中，T4能够提高FGF2在15分钟共同培养过程中引起的MAPK活化作用(图6C)。通过在CAM模型中观测ECV304细胞，我们建议，激素导致血管生成的复杂的机理包括FGF2内皮细胞的释放和释放的FGF2自分泌作用对血管生成的增强。
实施例7.在用甲状腺激素处理的ECV304细胞中的RT-PCR 在研究T4对前血管生成影响的机理时提出的最终问题是激素是否可能导致FGF2基因表达。用T4(10″7mol/L)处理内皮细胞6到48小时，进行基于RT-PCR的FGF2和GAPDH RNA的估计(从cDNA测得的量推断；图7)。通过6小时的激素处理，FGF2 cDNA的量有明显增加且修正了GAPDH的内容，用激素处理48小时这一现象进一步提高。
实施例8A.小鼠(糖尿病的和非糖尿病的)体内视网膜新血管生成模型 为了评估试验物品对视网膜新血管生成的药理活性，将幼龄小鼠暴露于高氧环境下7天并且允许恢复，从而刺激视网膜上新血管的形成。对试验物品进行评价来确定视网膜新血管生成是否被抑制。用苏木精-伊红染液检查视网膜，有至少一个着色时，说明有新血管生成(通常是选择素染色)。也可以使用其他着色剂(例如PCNA、PAS、GFAP、血管生成的标记物，等等)。下面对此模型进行了概括 动物模型 将幼龄小鼠(p7)和它们的母畜放置于高氧环境(70-80％)下7天。
在P12，将小鼠从充氧环境下移走并且放入正常环境。
让小鼠恢复5-7天。
然后处死小鼠并采集眼睛。
视情况而定，将小鼠的眼睛或者冷冻或者固定。
用适当的组织化学染色剂对眼睛染色。
用适当的免疫组织化学染色剂对眼睛染色。
采集血、血浆、或者其他组织。
检查特别提到的具有微血管变更的眼睛，观察任何和所有发现。半定量的记录新血管生长，也可以使用图像分析。
实施例8B甲状腺激素和糖尿病性视网膜病 使用J de Ia Cruz et al.，J Pharmacol Exp Ther 280454-459，1997中公开的草案，对患有链脲佐菌素(STZ)导致的试验性糖尿病和糖尿病性视网膜病的小鼠给药Tetrac。给药终点是增生性视网膜病(血管生成)出现的Tetrac的抑制作用。
实施例9A.使用新型的甲状腺激素和类似物的药物聚合制剂使伤口愈合并进行止血治疗。
本发明还包括一种新颖的伤口愈合和止血疗法，包括一种固定的甲状腺激素类似物，优选T4类似物、氯化钙和胶原蛋白。在低水平胶原蛋白存在的情况下，这种新颖的制剂能够有效的控制静脉和动脉出血，降低出血时间，产生纤维蛋白/血小板栓，释放血小板衍生的伤口愈合因子，并且十分安全。这种伤口愈合和止血包扎的发展是很有价值的，能够短期或长期应用于战斗伤亡护理方面。可以优化固定的左旋甲状腺素(T4)和球状多聚己糖的药物制剂，该药物制剂以一种水凝胶或者覆盖物的方式存在，包含胶原蛋白和氯化钙。这种以水凝胶或者覆盖物的方式存在的新颖的伤口愈合和止血(WH制剂)疗法还可以包括杀菌剂的加入。
通过附着在细胞表面受体(整合素αvβ3)的活化作用导致胞内信号活化作用，结合到聚合物或者固定在琼脂糖上的左旋甲状腺素显示有效的血管生成刺激性，随后导致不同的生长因子产量的上调。另外，固定化T4导致上皮细胞、成纤维细胞和角化细胞的细胞迁移。固定化T4、而不是T3或其他类似物，能够提高胶原蛋白导致的血小板凝聚和分泌，这将促进主体本身的血小板栓形成。此外，固定化T4还能够促进白细胞迁徙，这是对抗传染病的关键。因此，固定化T4可以帮助身体产生更多用于再生血管的化合物，并且，固定化T4还能够提高白血球的数值，白血球在受伤位点产生丰富的自由基。自由基能够从创伤处清除潜伏地病原菌。
因此T4或者T4-琼脂糖(10-100nM)，而不是T3、DIPTA、或者GC-I，在提高血小板凝聚和分泌(去粒化作用)方面有效。因此，T4(或者类似物和其聚合结合物，例如，T4-琼脂糖)和10mM氯化钙相结合，在有或者没有胶原蛋白的情况下优选地用于伤口愈合。参见图23A-E。
凝血弹性描记法 自从1948年Hartert开发以来，凝血弹性描记法(TEG)已经被用于不同的医院装置中。TEG的原理以表示血块特征的物理粘弹性为基准。使用计算机化血栓弹性仪(TEG 3000型，Haemoscope，Skokie，IL)，在37℃下在振动的塑料圆柱电池(″杯″)和与平面有1mm间隙的同轴悬挂固定的活赛(″销″)中检测血块形成。杯每4.5秒向两侧振动一次，中间有一秒循环停留时间；产生0.1Hz的频率和最大0.1每秒的剪切速率。销被起到转矩传感器作用的扭丝悬吊起来。随着血块形成，纤维蛋白小纤维将杯和销物理地连接起来，并且，使用IBM兼容机家用计算机和定制软件(Haemoscope公司，Skokie，IL)可以在线显示杯受血块粘弹性影响的旋转。作为时间函数对销受到的扭矩(相对于杯的振荡)作图。
TEG通过测量不同的参数，例如凝结开始的等待时间(R)、固定的血块(k)的振幅开始为大约20mm的时间、通过斜率测定(α)的血块形成动力学、和血块的最大振幅(MA)评估凝聚作用。参数A测量任一点MA痕迹的宽度。以毫米为单位的振幅A是血块强度或弹性的函数。TEG痕迹中的振幅是血块刚性的测量值；通过凝结、G获得的强度或者剪切力弹性模数的峰值是血块刚性的函数，且可以由TEG痕迹的最大振幅(MA)计算出。
从TEG痕迹中计算下列参数 R，反应时间(凝胶时间)表示了形成3维纤维蛋白凝胶网络(具有大约2mm振幅的可测量的刚性)之前的潜伏期。
最大振幅(MA，以毫米为单位)是血块表现的刚性的峰值。
剪切力弹性模数或血块强度(G，dynes/cm)定义为G＝(5000A)/(100-A). 由于血块必须能够经受血管创伤位点的切应力，血块凝聚是在体内血栓形成和止血的重要参数。TEG可以用来评估不同的药理干涉疗法对血块形成和消除涉及到的不同因素(凝血活化作用、凝血酶生成、纤维蛋白形成、血小板活化作用、血小板-纤维蛋白相互作用、和纤维蛋白聚合)的效果。表3显示了在人全血中内毒素(0.63ug)、Xa(0.25nM)、凝血酶(0.3mU)和TF(25ng)对计算机化TEG调节的不同凝结参数的影响。
采血经William Beaumont医院人类调查委员会的批准，血也得自同意捐献的志愿者。使用二种注射方法，用21规格的蝴蝶针取样，并丢弃最初的3ml血。将全血(WB)装入包含3.8％柠檬酸钠的硅化真空管中(Becton Dickinson，Rutherford，NJ)，维持柠檬酸盐全血的比率为1∶9(v/v)。在收集血液的3小时内进行TEG。添加1-2.5mM的钙，随后加入不同的激发剂。氯化钙本身在使用浓度下对血块形成和凝结强度只显示最小的作用。
血块形成源于凝血酶-诱发纤维蛋白肽A从纤维蛋白原中断裂。产物纤维蛋白单体自然地聚合形成小纤维束，进行线性延伸、分支、和横向结合导致形成一种纤维蛋白纤维的三维网络。网络结构独特的性质是它们能够起到刚性弹性固体的作用，能够抵抗变形切应力。这种变形抗力可以被弹性模数-一种凝结强度指数调节。与只以时间为基础开始血块形成的TEG传统的凝固试验(如前凝血酶时间和部分促凝血酶原激酶时间)不同，TEG能够获得通过血块得到的最大强度测定值的定量信息。通过GPIIb/IIIa受体，血小板结合纤维蛋白(ogen)并且调节血块的粘弹性质。我们的结果说明，在TF-TEG中，凝结强度无疑是血小板浓度的函数，且在剪切力下，血小板凝结强度增加～8倍。在使用TF-TEG在剪切力下抑制血小板-纤维蛋白调节的凝结强度时，不同的血小板GPIIb/IIIa拮抗物(I级对照II级)表现不同的效果。
统计分析 数据用平均±SEM来表示。使用合适的t检验法或者ANOVA，通过成对分析法或组分析法分析数据；当P＜0.05时，认为差异是显著的。
表3使用TEG，对照组织因子，在含枸橼酸盐的人类全血中氯化钙对凝结动力学的影响 数据表示为平均值±SEM，n＝4，*P＜0.01。
在全血中使用全电阻技术进行血小板凝聚和去粒化作用在本实验中，使用得自Chrono-Log公司的560型全血凝聚分析仪和Aggro-连接软件。在稀释的血液中放置两个电极，并且从其中一个向另一个发射电脉冲。由于血小板聚集在电极周围，Chrono-Log测量以ohms为单位的电信号的电阻。
采血每天，从健康的年龄在17到21岁之间的供血者体内取血，放入装有3.8％柠檬酸钠(Becton Dickinson，Rutherford，NewJersey)缓冲液的4.5毫升真空瓶中。将血液保存在摇床中，来延长血小板的寿命，且实验在取血后的5小时内进行。
过程作为对照，500微升全血、500微升0.9％的生理盐水和有磁性的搅拌棒放入电池中混合，并预热5分钟使温度到达37摄氏度。用5微升1-2μg/ml的胶原蛋白诱发次阈值凝聚作用，用凝聚分析仪测量6-7分钟。对照T3，检验T4、T4-琼脂糖及其他甲状腺激素类似物对胶原蛋白导致的凝聚作用和分泌的影响。ngerman-Wojenski C，Smith JB，Silver MJ.Evaluation ofelectrical aggregometrycomparison with optical aggregometry，secretion of ATP，and accumulation of radiolabeled platelets.J LabClin Med.1983 Jan；101(1)44-52. 细胞迁移试验。使用Mousa等人描述的方法和前面描述得细胞迁移试验(Methods In Cell Science，19(3)179-187，1997，和Methods In CeIl Science 19(3)189-195，1997)，从血液中分离出人类粒性白细胞。简要地，使用具有8μm孔径趋药性孔室的96孔微室。这种孔室允许细胞向着化学激素、细胞因子或胞外基质蛋白浓度梯度迁徙。向含有5μL实验试剂，例如fiavanoids或甲状腺激素衍生物的聚丙烯平皿中加入细胞悬浮液(45μl，2×106)，在22℃下培养10分钟。向可使用的趋药性孔室的下面的小孔中加入带有或不带有浓度为0.001-0.1μM的T3/T4(33μl)的IL8(0.1-100ng)，然后使用预加框过滤器集合孔室。向上面的小孔中加入25μl细胞/实验试剂悬浮液，然后在潮湿的细胞培养器中过夜培养(37℃下22小时，5％CO2)。过夜培养之后，使用12管吸液管和细胞刮刀轻轻的除去未迁徙细胞和过量介质。然后，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中将过滤器洗涤两次，并且固定在1％甲醛PBS缓冲液中。迁移细胞的细胞膜充满Triton X-100(0.2％)，然后用PBS洗涤2-3次。用玫瑰精毒伞素(12.8IU/ml)染色迁移细胞的丝状肌动蛋白30分钟(22℃)。玫瑰精毒伞素每周制备一次，在4℃避光保存时可重复使用3天。使用Cytofluor II微过滤器荧光计(530干扰/590发射)，通过荧光检测定量确定化学活性物质运载剂。使用特别设计的处理/洗涤设备进行所有的细胞处理和随后的洗涤(Methods In Cell Science，19(3)179-187，1997)。这一技术能够精确的定量细胞迁徙，并提供具有最小介入或内部试验变化性的重复性实验结果。
细胞迁徙试验使用具有8μm孔径趋药性孔室的96孔微室进行这种试验.这种孔室允许细胞向着体外粘连蛋白、骨桥蛋白浓度梯度迁徙。使用EDTA/胰蛋白酶(0.01％/0.025％)用标准的方法去掉培养的细胞。去掉之后，洗涤细胞两次并重新悬浮(2×106/ml)在EBM(内皮细胞基础培养基，Clonetics Inc.)中。向可使用的趋药性孔室的下面的小孔中添加0.0125-100μg/ml的体外粘连蛋白或骨桥蛋白(33μl)，然后使用预加框过滤器集合。向包含5μl不同浓度试验试剂的聚丙烯平皿中加入细胞悬液(45μl)，在22℃下培养10分钟。向可使用的趋药性孔室的上面的小孔中添加25μl的细胞/试验试剂悬浮液，然后在湿润的细胞培养器中过夜培养(37℃下22小时)。过夜培养之后，使用12管吸液管和细胞刮刀轻轻的除去未迁徙细胞和过量介质。然后，在磷酸盐缓冲盐水(没有Ca++或Mg++)中将过滤器洗涤两次，并且固定在1％甲醛PBS缓冲液中。迁移细胞的细胞膜充满TritonX-100(0.2％)，然后用PBS洗涤2-3次。用玫瑰精毒伞素(12.8IU/ml)染色迁移细胞的丝状肌动蛋白30分钟(22℃)。玫瑰精毒伞素每周制备一次，在4℃避光保存时可重复使用3天。使用Cytofluor II微过滤器荧光计(530干扰/590发射)，通过荧光检测定量确定化学活性物质运载剂。使用特别设计的处理/洗涤设备进行所有的细胞处理和随后的洗涤。这种设备包括六个独立的反应剂单位，每个单位具有30ml的容量。单个单位充满下列试剂的一种PBS、甲醛、TritonX-100、或者玫瑰精-毒伞素。使用这种技术时，过滤器被轻轻地浸入适当的溶液之中，因此将迁移细胞的损失减到最少。这一技术能够精确的定量细胞迁徙，并提供具有最小介入或内部试验变化性(1，2)的重复性实验结果。
向细胞外基质蛋白体外粘连蛋白的迁徙 LC＝下部孔室，UC＝上部孔室 使用其它潜在的和特异性的avb3血管生成剂例如LM609和SM256可以得到相似的数据。
实施例9B.体外人上皮细胞和成纤维细胞的伤口愈合文献Mohamed S，Nadijcka D，Hanson，V.Wound healing properties ofcimetidine in vitro.Drug Intell Clin Pharm 20973-975；1986描述了体外2维伤口愈合方法，该文献通过引证在此全部并入本文。
另外，我们的实验室已建立了一种3维伤口愈合方法，本研究(见下文)中将会使用该方法。数据显示甲状腺激素能够有效的刺激伤口愈合。
人类皮肤成纤维细胞的体外三维伤口愈合试验 步骤1制备收缩的胶原蛋白凝胶剂 1)用350ul 2％的BSA包覆24孔板2hr， 2)80％融合性NHDF(正常人皮肤成纤维细胞，通道5-9)被胰蛋白酶化，并且用生长培养基中和，离心并用PBS洗涤一次， 3)制备胶原蛋白-细胞混合物，轻轻地混合并一直置于冰中 4)从24孔板中取出2％BSA，添加胶原蛋白-细胞混合物350ul/孔，并在37℃下，在CO2培养箱中培养孔板。5)1小时之后，添加0.5ml/孔的介质DMEM+5％FBS，使用10ul尖端将胶原蛋白凝胶从每个孔边缘分离下来，然后培养2天。成纤维细胞可能收缩胶原蛋白凝胶。
步骤2制备三维纤维蛋白伤口凝块并嵌入创伤的胶原蛋白培养基 1)制备含有或不含有试验试剂的纤维蛋白原溶液(1mg/ml)。在eppendorf试管中加入350ul纤维蛋白原溶液。
2)用剪刀从中间切割收缩的胶原蛋白。用PBS洗涤凝胶并将凝胶放入24孔板每个小孔的中心。
3)向每个试管中添加1.5ul人凝血酶(0.25UM)，混合小孔然后在胶原蛋白凝胶周围添加溶液，该溶液可能在10分钟内聚合。20分钟后，添加含有或不含有实验试剂的DMEM+1％(或5％)FBS，450ul/小孔，并在37℃下，在CO2培养箱中培养平板5天。每天都照相。
在患有糖尿病的鼠体内的伤口愈合 在患有糖尿病的鼠体内使用一种急性的切割伤口模型，试验甲状腺激素类似物和它的结合形成的影响。每3-21天为周期进行伤口闭合比率、断裂强度分析和组织学检测。
方法在实验中，动物(小鼠和老鼠)带有二个小穿刺伤口-对一个创口使用WH，另一个作为对照覆着盐溶液。要不，不理创伤直到自然痊愈。
受伤之后动物被euthanised五天。从治疗的和未经治疗的的创口边缘切去1到1.5毫米面积的皮肤。
伤口闭合和伤口闭合的时间是确定的。另外，在创伤的肉芽组织中，帮助构造结缔组织的蛋白tenascin水平是确定的。肉芽组织的性质(即通常形成伤口痊愈、新毛细管和结缔组织的粗糙的、带粉红色的组织)也是确定的。
材料和方法 使用本领域内已知的方法制备慢性颗粒状创口。在使用之前，将重量在300到350克的雄性Sprague Dawley鼠驯化一周。在腹腔内戊巴比妥麻醉(35mg/kg)的条件下，刮削小鼠背部并去毛。将动物分别关进笼内并不限量给与食品和水。依照纽约奥尔巴尼退役老兵体检中心动物护理和使用委员会准则进行所有的实验。
之前已经将这种伤口的组织学特征与人类慢性颗粒状伤口进行了比较。然后将六十四只鼠分成八个试验组(n＝8/组)。在第5、9、12、15、和18天，局部施用介质(参照介质)处理动物。参照介质可以是琼脂糖(组1)或与左旋甲状腺素结合使用的多聚体形式(组2)。用T4-琼脂糖(组3-5)或者T4-聚合物(组6-8)以1，10，100μg/cm2的浓度在10μg球状多聚己糖、10μg胶原蛋白和10mM氯化钙的存在下，在第5、9、12、15、和18天局部使用处理创口。不处理伤口使其暴露在空气中。每48小时在醋酸盐纸上描绘创口的轮廓，并使用计算机化数字求积法计算面积。
在第19天，从创口的头部、中间和尾部可以获得三个肉芽组织充分厚的横向条带，并将其固定在10％的福尔马林缓冲液中。从每个样品中取横切面(5μm)并用苏木精和四溴荧光素染色。肉芽组织的厚度可以使用低功率测微目镜估计。立即检验肉芽组织表面发炎层以下的高性能领域。从每个切下的肉芽组织中可以摄影和编码五个相邻的高性能领域。放大相片，然后用于盲目的组织分析。计算成纤维细胞，″圆″细胞(巨噬细胞、淋巴细胞、和嗜中性白细胞)和毛细管。此外，各个切面的多孔性渐次变化的，多孔性比例从1(还原细胞计数)变化到5(高度细胞)。
统计分析根据时间绘制连续的面积测量值。每只动物的数据符合Gompertz等式(一般r2＝0.85)。使用这种曲线可以估计伤口半衰期。使用寿命统计表分析和Wilcoxon等级检验法进行组间比较。使用家用计算机带有的SAS(SAS/STAT家用计算机指南，第6版，Cary，North Carolina，1987，p 1028)和BMDP(BMDP统计软件手册，Los Angeles，BMDP Statistical Software，Inc.1988)进行统计分析。
使用一维方差分析将不同试验组算得的细胞入库分析。组间差异的后hoc分析可以使用Tukey′s试验(所有对多次比较法)进行，当p＜0.05时认为差距显著。使用Sigma Stat统计软件(Jandel Scientific，Corte Madera，California)进行数据分析。
实施例10.心肌梗死的鼠类模型 心肌梗死的冠状动脉结扎模型常用于研究鼠类心脏功能。首先用甲苯噻嗪和克他命使鼠麻醉，得到适当的麻醉后，向气管插入管子并开始正压通气。用非常松弛地胶布使鼠仰卧，并进行中央胸骨切开术。从腹部轻轻取出心脏并6-O缝合将在左侧腹面的下降冠状动脉牢牢绑住。心脏在胸中被飞快的替换，并在胸廓切开术切口进行3-0荷包线缝合随后用间断缝合术或外科夹使皮肤闭合。将动物放置在温度调节加热板上在恢复期间仔细观察。如果必要给予呼吸用氧气和心肺复苏。恢复后，该鼠回到动物照管装置。鼠内的这样的冠状动脉结扎产生大前壁心肌梗死。这种方法48小时死亡率可以高达50％，这种方法产生的梗塞尺寸存在着可变性。根据这些考虑和先前的经验，获得16-20只带有大的梗塞的鼠以便下面讨论的甲状腺激素输送的两个模型可以进行比较，大约需要400只鼠。
这些实验设计用来表明冠状动脉结扎前或后甲状腺激素的全身给药在完整的动物中产生有益的效果，包括通过超声波心动描记法和血液动力学的测量、和梗塞面积的减少评价的血液动力学的反常的程度。结果测量建议在梗死形成三星期后进行。尽管一些鼠可能没有梗死形成、或仅有一小梗死形成产生，这些鼠可以通过正常的超声心动图和正常的血液动力学(低压末端-舒张压＜8mm Hg)来鉴别。
甲状腺激素输送 有两种输送途径。第一，把直接甲状腺激素注入到梗塞心肌周围。作为正常的和缺血性的心肌的界线在急性开放胸闭塞期间很容易识别，这种途径提供了激素的充分输送来检测血管新生的效果。
尽管第一个模型在病人中进行冠状动脉旁路外科手术有用，并构成原则性的证据，即局部注射诱导血管新生，使用第二个模型的更广泛的途径也可以使用。在第二个模型中，在诱导心肌梗死之前在麻醉的鼠中将导管逆行经过颈动脉放在左侧心室。换句话说，用直针击穿主动脉，刚好到主动脉瓣上方。然后通过在冠状血管的起源上突然的闭合主动脉几秒钟模拟甲状腺激素的冠状动脉内注射，从而产生等容收缩。主动脉的收缩后立即把甲状腺激素注射到左侧心室或主动脉。产生的等容收缩推动带有甲状腺激素的血液沿着冠状血管灌注整个心肌。这种方法根据需要可以进行许多次来得到有效作用。注射量取决于使用的剂量和新血管的形成。
超声波心动描记法 已经开发出在未麻痹的鼠中得到二维和M-方式超声心动图的方法。左心室的尺寸、功能、膜壁厚度和壁的活动可以再生并可靠地测量。测量以极微小的方式排除关于甲状腺激素给药的偏移。
血液动力学 血液动力学的测量用来决定左心室的损伤程度。用异氟烷使鼠麻醉。通过沿着右前颈部的一个切口，分离开右侧的颈动脉和右侧的颈静脉并用带有压力传感导管插入(Millar，SPR-612，1.2Fr)。然后获得下列测量心率、心脏收缩的和心脏舒张的血压、平均动脉压、左心室的心脏收缩和末端-舒张压、和+和-dP/dt。特别实用的是左心室的末端-舒张压的测量，其累进的高度与心肌损伤的程度相互关联。
梗死尺寸 牺牲鼠用TTC方法来测量梗死尺寸。
形态测量学 在梗塞区域、周围梗塞区域、和抵抗梗塞的备用心肌，通常是后壁内测量微脉管密度[微脉管/平方毫米]。从每个鼠，7-10高倍放大的带有横切断的肌细胞的高倍视野[×400]使用图像分析软件进行数字记录。通过一个微小的探测器对微脉管进行计数。微循环定义为带有150微米或较少的直径的超过第三级小动脉的血管，在小动脉和小静脉之间提供组织。为校正左心室肥厚内的差异，通过为体重修正的LV重量微脉管密度得以分开。从仿造操作的鼠得来得心肌将作为对照。
实施例11关于T4或FGF2的前血管新生的αVβ3拮抗物的效果 αVβ3抑制剂LM609在10微克时完全抑制CAM模型中FGF2或T4-诱导的前血管新生效果(图16)。
实施例12癌-相关的新血管生长的抑制。
在J.Bennett，Proc Natl Acad Sci USA 992211-2215，2002里公开得方案，用于甲腺乙酸(Tetrac)给药给锡特鼠，这种鼠获得了人乳癌细胞的植入物(MCF-7)。在饮用水中提供Tetrac来提升鼠模型中激素类似物的循环水平到10-6M。终点是关于植入得瘤周围的血管新生的tetrac的抑制作用。
实施例13甲状腺激素和它的类似物在体外三维微血管的内皮发芽模型中VEGF和FGF2的次阈值水平下的前血管新生促进效果。
或T3、T4、T4-琼脂糖、或成纤维细胞生长因子2(FGF2)加血管的内皮生长因子(VEGF)在体外三维微血管的内皮发芽模型中产生的可比较的前血管新生效果。甲状腺激素类似物的前血管新生效果由PD98059阻断，PD98059是一种促细胞分裂剂-活化的蛋白激酶MAPK；ERK1/2)信号转导级联。另外，特殊的αVβ3完整拮抗物(XT199)抑制甲状腺激素类似物或者T4-琼脂糖的前血管新生效果。数据也证明甲状腺激素拮抗物Tetrac抑制甲状腺类似物的前血管新生的应答。因此，那些经过试验的甲状腺激素类似物是前血管新生的，其作用开始于质膜并且包括αVβ3整联蛋白受体，且是MAPK-依赖的。
本发明描述了在体外三维微血管的内皮发芽模型中VEGF和FGF2的次阈值水平下T3、T4、或T4-琼脂糖的前血管新生促进效果。本发明也提供证据，这些证据是，激素的效果在内皮细胞质膜上开始并且由αVβ3整联蛋白和ERK1/2信号转导途径的活化来调节。
通过三维发芽测定中低浓度的VEGF和FGF2的血管新生活动的T3、T4、或T4-琼脂糖来增强已被证实。10-7M-10-8M总激素浓度的T3或T4，或10-7M总激素浓度的T4-琼脂糖在这种体外模型中对VEGF和FGF2的最大浓度的前血管新生活动中是可以比较的。尽管鼠心脏中的新血管生长已经报道有发生，附随着通过大剂量的T4的心肌肥大的诱导，甲状腺激素认为不是因子。本实施例确定了生理学浓度的激素在除了心脏的环境中是前血管新生的。
T4-琼脂糖再现T4的效果，并且这种甲状腺激素的衍生物认为不是获得进入细胞内部的入口；它已经被用于我们实验室来检查对于可能的细胞表面-开始的碘化甲状腺氨酸的作用的激素作用模型。更进一步，用T4和tetrac进行实验也支持结论，该结论是这种模型中T4的作用开始于质膜。Tetrac阻断T4的膜-开始的效果。
因为甲状腺激素非基因组的活化MAPK(ERK1/2)信号转导途径，激素关于血管新生的作用可以被MAPK调节。MAPK级联的抑制剂PD98059，当被加入到CAM模型，，抑制T4的前血管新生作用。这结果与T4关于FGF2加工作用的效果的甲状腺激素信号上游的转导的作用是一致的，大家都知道FGF2也经过MAPK-依赖的机制起作用。T4和FGF2各自产生磷酸化作用和内皮细胞中ERK1/2的核易位，并且当使用次最大剂量，结合来进一步提高ERK1/2活化。为检查专门与血管新生相关对关于血管生长的FGF2的作用的激素刺激的仅有的MAPK-非独立组分的可能性，测量PD98059存在时为响应T4细胞释放的FGF2。后者阻断在生长因子浓度下激素-引起的增加并且表明MAPK活化包含关于从内皮细胞释放的FGF2的T4的作用，而且包含关于血管新生的FGF2随之产生的效果。
甲状腺激素关于血管新生的效果 T4、T3、或者T4-琼脂糖在0.01-0.1μM引起显著的(P＜0.01)刺激血管新生(表4)。这表示可以比得上FGF2(50ng/ml)加VEGF(25ng/ml)的前血管新生效果。
表4.三维人微血管的内皮发芽测定中生长因子、甲状腺激素、和类似物的体外前血管新生效果 数据(平均值±SD)从3个实验中获得。细胞用次阈值水平的FGF2预处理(1.25ng/ml)+VEGF(2.5ng/ml)。数据表示平均值±SD，n＝3，*通过方差分析P＜0.01，比较处理的对照。
Tetrac关于甲状腺前血管新生作用的效果 T3刺激细胞信号转导途径在质膜上开始。通过脱氨基碘化甲状腺氨酸类似物，tetrac，这些前血管新生作用被阻断，tetrac是大家所知道的抑制T4键合到血浆隔膜。tetrac(0.1μM)的加入抑制T3、T4、或T4-琼脂糖的前血管新生作用(表5-7)。这通过微-血管的内皮细胞迁移的数目和血管长度的抑制来表示(表5-7)。
通过甲状腺激素的血管新生的刺激中ERK1/2信号转导途径的角色 ERK1/2抑制的平行的研究在三维微血管的发芽测定中进行。甲状腺激素和类似物在0.01-0.1μM时血管长度和迁移细胞的数目产生显著的增大，该效果被PD 98059有效地(P＜0.01)阻断(表5-7)。这通过微-血管的内皮细胞迁移的数目和血管长度的抑制来表示(表5-7)。
通过甲状腺激素刺激血管新生中整联蛋白αVβ3的角色 在次阈值的VEGF和FGF2存在时T3、T4、或T4-琼脂糖在0.01-0.1μM-调节的前血管新生通过αVβ3整联蛋白拮抗物XT199被有效地(P＜0.01)阻断(表5-7)。这通过微-血管的内皮细胞迁移的数目和血管长度的抑制来表示(表5-7)。因此，甲状腺激素和它的类似物的前血管新生效果开始于质膜αVβ3整联蛋白并包括ERK1/2的活化。
表5三维人微血管的内皮发芽测定中甲状腺激素T3的前血管新生机制 人表皮的微血管内皮细胞(HDMVC)被使用。细胞用FGF2(1.25ng/ml)+VEGF(2.5ng/ml)预处理。第3天4×和10×获取图像。数据表示为平均值±SD，n＝3，*P＜0.01。
表6三维人微血管的内皮发芽测定中甲状腺激素T4的前血管新生机制 人表皮的微血管内皮细胞(HDMVC)被使用。细胞用FGF2(1.25ng/ml)+VEGF(2.5ng/ml)预处理。第3天4×和10×获取图像。数据表示为平均值±SD，n＝3，*P＜0.01。
表7三维人微血管的内皮发芽测定中甲状腺激素T4-琼脂糖的前血管新生机制 人表皮的微血管内皮细胞(HDMVC)被使用。细胞用FGF2(1.25ng/ml)+VEGF(2.5ng/ml)预处理。第3天4×和10×获取图像。数据表示为平均值±SD，n＝3，*P＜0.01。
实施例14为评价聚合甲状腺类似物运输穿过血脑屏障的体外模型 下面所描述的是为评价带有选择单独的聚合甲状腺类似物或和单独的聚合甲状腺类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子可能横穿血脑屏障的装置的体外方法。本模型和方案的详细说明通过Audus，et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci 5079-18(1987)提供，该文公开的在这里通过引用并入全文。
简言之，从新鲜牛脑的大脑灰质中分离到微脉管内皮细胞。牛脑可从地方的屠宰场获得并用冰冷的最小的带有抗生素的基本装置运送到实验室(“MEM”)。在无菌的情况下使用标准解剖方法除去大的表面血管和脑膜。通过吸取除去皮层的灰质，然后切碎成大约1毫米的立方块。然后将切碎的灰质用0.5％酵素(BMB，印第安纳波利斯，Ind.)37℃在振荡水浴培养3小时。随后消化3小时，通过离心浓缩混合物(1000×g10分钟)，然后用13％右旋糖酐再悬浮，5800×g离心10分钟。弃去浮在表面的脂肪、细胞碎片和髓磷脂，在1mg/ml胶原酶/酵素中再悬浮粗的微脉管并在37℃振荡水浴培养5小时。消化5小时后，微脉管悬浮液用来在预建立的50％Percoll梯度1000×g离心10分钟。除去包含纯净内皮细胞的区域(从梯度顶端的第二条带)并用培养基洗涤两次(例如，50％MEM/50％F-12营养混合物)。在包含20％二甲亚砜和10％马血清的培养基中冷冻细胞(-80℃)以便以后的使用。
分离后，大约5×105细胞cm2覆盖在培养皿上或5-12毫米孔径大小聚碳酸酯滤纸上也就是说涂有鼠胶原和粘连蛋白。接种细胞10-12天后，通过显微镜检查细胞单层覆盖情况。
这些细胞的形态学的、组织化学的和生物化学的性质的表征表明这些细胞具有血脑屏障的许多显著的特征。这些特征包括紧的细胞间的接合、膜穿孔的缺少、胞饮的活动的低水平、和γ-谷氨酰基转肽酶、碱性磷酸酶、和凝血因子抗原活动的存在。
培养的细胞可被用于各式各样的实验，这些实验中需要为极化的键合或运输的模型。通过在多孔平板中铺细胞，大的和小的分子的键合受体和非受体可以实施。为了实施穿过内皮细胞通量测量，让细胞在多孔聚碳酸酯膜滤器(例如，从Nucleopore、Pleasanton，Calif.)上生长。大孔径滤纸(5-12毫米)用来避免滤纸变成分子通量的比率-限制阻碍的过滤器的可能性。这些大孔径滤纸的使用不允许细胞在滤纸下面生长，允许细胞单层的目测检查。
一旦细胞扩展覆盖，将他们并排放在扩散池仪器(例如，从Crown Glass，Sommerville，NJ.)中为了通量测量用试验物质对，扩散池的供体室调幅脉冲，然后随着脉冲在各个时间，从接收器室除去一部分来做分析。放射性或荧光标记的物质允许可靠的分子通量定量。通过加入非可运输的试验物质例如蔗糖或菊粉同时调整单层完整性并为了保证统计显著性重复测定至少4次。
实施例15创伤损伤模型 流体撞击脑损伤模型用于评价单独的聚合甲状腺激素类似物或和单独的聚合甲状腺激素类似物结合在一起的神经生长因子或其他的神经发生因子在显著的外伤性脑损伤后修复中枢神经系统功能的能力。
I.流体撞击脑损伤方法 用于这个研究的动物是过秤250-300克的雄性Sprague-Dawley鼠(Charles River)。为了流体撞击脑损伤的基本的外科预备在前面已描述。Dietrich，et al.，Acta Neuropathol.87250-258(1994)在这里通过引用并入全文。简短地，用3％氟烷、30％氧、和一氧化二氮的均衡使鼠麻醉。进行气管插管术并把鼠放在一立体定位的框架中。然后在右侧的顶骨皮层上施行4.8毫米颅骨切开术，前囟后3.8毫米和中线侧面的2.5毫米。损伤管放在暴露的硬脑膜上并且通过粘合剂粘着。然后倒入齿的丙烯酸在损伤管的周围，然后将损伤管用明胶海绵塞住。将头皮缝合闭合并将动物放回它的盒子，允许恢复过夜。
第二天，流体撞击脑损伤本质上产生了，如Dixon，et al.，J.Neurosurg.67110-119(1987)和Clifton，et al.，J.Cereb.BloodFlow Metab.11114-121(1991)描述的。流体撞击装置由加满的盐的有机玻璃缸组成也就是说备有传感器室并且适合于鼠颅骨的损伤螺钉。金属螺钉牢牢连接到插管的麻醉的鼠的塑料损伤管(70％一氧化二氮、1.5％氟烷、和30％氧，并且损伤通过撞击活塞的摆锤下降引起损伤。鼠进行轻的调节的头部损伤，范围从1.6到1.9大气压。大脑温度用热敏探示器插入右侧临时的肌肉中间接的监测并维持37-37.5℃。也测量直肠温度并且在监控周期之前和整个监控周期内维持在37℃。
行为试验 三个标准的功能/行为试验用于评价脑损伤后的感觉运动和反射功能。该试验已经在文献中完全地描述了，这些文献包括Bederson，et al.，(1986)Stroke 17472-476；DeRyck，et al.，(1992)Brain Res.57344-60；Markgraf，et al.，(1992)Brain Res.575238-246；and Alexis，et al.，(1995)Stroke 262338-2346。
A.前肢放置试验 测量前肢放置对三个单独的刺激(视觉的、触觉的、和固有感受的)来评价感觉运动的结合。DeRyck，et al.，Brain Res.57344-60(1992)。对于视觉放置微粒，研究人员把动物垂直握住并且拿近到一个桌子上。放在桌上的四肢的标准位置记为“0”、延迟放置(＜2秒)记为“1”、没有或延迟很长的放置(＞2秒)记为“2”。当动物直着拿来首先记下各自的分，然后在动物横着拿来到桌上再记一次分(满分每肢＝4)；在每一种情况下更高的分数表示更多的不足)。对于触觉放置微粒，握住动物以便它看不见或用它的胡须接触不到桌面当动物首先直着拿来到桌上然后横着拿来到桌上。背前爪轻轻地接触桌面。每次放置都按上面的办法记分(满分每肢＝4)。对于固有感受放置微粒，动物仅直着拿来并对背的前抓给较大的压力(满分每肢＝2)。最后，测试动物对放置前肢响应通过桌面的胡须刺激的能力(满分每肢＝2)。然后把第二高分加到一块给出总的前肢放置分数每肢(范围＝0-12)。
B.横梁平衡试验 横梁平衡对运动原皮层的损害敏感。这些工作通过要求鼠在一窄横梁上稳定的平衡来评价平衡运动功能。Feeney，et al.，Science，217855-857(1982)；Goldstein，et al.，Behav.Neurosci.104318-325(1990)。这个测试包括手术前24小时的三个60-秒训练试验来获得基本资料。该仪器由一个3/4英寸宽、10英寸长、悬在桌上1英寸高的横梁组成。鼠放在横梁上并且必须用四肢在横梁上维持稳定的姿势60秒。动物的特性用Clifton，et al.，J.Cereb Blood Flow Metab.11I1 14-121(1991)的等级来计算，这个比例范围从1到6，1分是正常的，6分表明动物不能在横梁上支撑自己。
C.横梁走动试验 这是感觉运动结合特别是检查后肢功能的试验。这个试验仪器和计算方法由Feeney，et al.，Science，217855-857(1982)改编而来。1英寸宽、4英寸长、悬于地面3英寸高的横梁灯光暗的房间。在横梁的远端是一个带有狭窄入口的黑暗的目标箱。沿着横梁在相等的距离，放置四个3英寸金属螺钉，倾斜远离横梁中心。在横梁的出发点一个白色噪声发生器和强光源刺激动物横过横梁并且进入目标箱。一旦进入目标箱，刺激终止。鼠到达目标箱(数秒内)潜伏并且记录作为横过横梁的后肢特性(根据1到7计算等级)。7分表明正常走过横梁小于2英尺滑动，并且1分表明该鼠不能小于80秒内横过横梁。手术以前三天训练每个老鼠来取得任务并且在三个连续的试验上达到正常表现(7分)。三个基本的试验在手术24小时收集，并且其后每日记录检查三个试验。计算潜伏的平均值和每天的分数。
实施例16甲状腺激素类似物
实施例17维A酸类似物
实施例18结合维A酸的甲状腺激素类似物
T4-类维生素A酸
T3-类维生素A酸
DITPA-类维生素A酸
GC1-类维生素A酸
TRIAC-类维生素A酸
TETRAC-类维生素A酸 实施例19卤化己烯雌酚类似物
己烯雌酚 实施例20T4类似物、卤化己烯雌酚和维A酸的组合物
维A酸-己烯雌酚-维A酸 实施例21PET成像化合物的制备 一般说来，本发明的放射性显影剂(实施例16-20)通过放射性的4-卤化苄基衍生物和哌嗪衍生物反应来制备。对PET成像优选的是F-18标记的4-氟苄基衍生物。制备4-氟-.sup.18F-卤苄的一般方法的描述参见Iwata et al.，Applied Radiation andIsotopes(2000)，Vol.52，pp.87-92 实施例22SPECT成像化合物的制备 对于单光子发射计算机断层照相(“SPECT”)，99mTc-标记化合物是优选的。对于这些化合物一般的合成途径根据实施例16-20从化合物的非放射性类似物开始也就是说与99mTc-键合螯合剂反应，例如N2S2-螯合剂。该螯合剂的合成遵循标准方法，例如，A.Mahmood et al.，A N2 S2-Tetradentate Chelate for Solid-PhaseSynthesisTechnetium，Rhenium in Chemistry and NuclearMedicine (1999)，Vol.5，p.71，or in Z.P.Zhuang et al.，Bioconjugate Chemistry(1999)，Vol.10，p.159中描述方法。
根据实施例16-20，螯合剂中的一个是或者直接键合到非放射性化合物的-N(R4)R5基团的氮上或经过包含有一到十个碳原子的烷基的连接部分，这里的烷基选择性的包含一到十个-C(O)-基团，一到十个-C(O)N(R)-基团，一到十个-N(R)C(O)-基团，，一到十个-N(R)-基团，一到十个-N(R)2-基团，一到十个羟基基团，一到十个-C(O)O(R)-基团，一到十个氧原子，一到十个硫原子，一到十个氮原子，一到十个卤素原子，一到十个芳基基团，和一到十个饱和的或不饱和的杂环，这里的R是氢或烷基。优选的连接部分是-C(O)-CH2-N(H)-。
实施例23T4是αVβ3整联蛋白的配体 为了确定T4是否是αVβ3整联蛋白的配体、用[125I]T4培养2μg市场上可买到的纯净蛋白质，将该混合物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上跑电泳。αVβ3键合放射性标记的T4并且这个交互作用被未标记T4竞争性地中断，这里[125I]T4培养之前将T4以浓度-依赖的方式加入αVβ3(图24)。未标记T4的加入在T4总浓度为10-7M(3×10-10M游离T4)使整联蛋白键合到放射性标记的配位体减少了13％，在T4总浓度为10-6M(1.6×10-9M游离T4)使整联蛋白键合到放射性标记的配位体减少了13％，10-5M未标记的T4时抑制最大。使用非线性回归，αVβ3和游离T4的相互作用确定有333pM的Kd值和371pM的EC50值。未标记的T3在替代[125I]T4-键合到αVβ3不是很有效，总T3浓度10-4M时信号减少了28％。
实施例24T4键合到αVβ3由tetrac、RGD肽和整联蛋白抗体阻断 我们在前面表明了，T4-刺激的信号转导途径在细胞表面激活可以被碘化甲状腺氨酸类似物tetrac抑制，它阻止T4同质膜的键合。在我们的放射性配体-键合测定中，tetrac对[125I]T4键合到纯净的αVβ3没有影响，T4和αVβ3的结合在10-7M和10-5Mtetrac存在时分别减少了38％和90％(图25)。为确定相互作用的专一性，RGD肽，它键合到αVβ3上细胞外基质-键合位点，和RGE肽，它有一个谷氨酸残基代替天冬氨酸残基并且因此不键合αVβ3，想办法加入它们来取代T4和整联蛋白键合。RGD肽，而不是RGE肽的应用，以剂量-依赖的方式降低了[125I]T4和αVβ3的相互作用(图25)。
为了进一步表征T4和αVβ3的相互作用，在加入[125I]T4之前向纯净的αVβ3中加入对αVβ3或αVβ5的抗体。加入1μg/mlαVβ3单克隆抗体LM609与未处理对照样品相比较，减少整联蛋白和T4间的复杂组成52％。增加LM609的量到2μg、4μg、和8μg/ml条带密度分别减少64％、63％和81％(图26)。当一个不同的αVβ3单克隆抗体，SC7312，和整联蛋白培养时可观察到相类似的结果。当有1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml抗体存在时SC7312降低T4键合到αVβ3的能力分别为20％、46％、47％、59％。对αV和β3的单克隆抗体分别培养，不影响[125I]T4键合到αVβ3，表明结合需要从αVβ3的异二聚物复合体产生键合的口袋，没必要在每一个单体上有一个特别的区域。为检验条带密度的减少是因为通过抗体的αVβ3的特异识别，在加入[125I]T4之前，用对αVβ5(P1F6)的单克隆抗体或鼠免疫球蛋白G培养αVβ3，这两者都不影响整联蛋白和放射性配体之间的复合体组成(图26)。
实施例25T4-刺激的MAPK活化被激素键合的抑制剂和整联蛋白αVβ3的抑制剂阻断 研究了用生理水平的T4(总激素浓度10-7M，10-10M游离激素)处理30min的MCV-I细胞中磷酸化MAPK(pERK1/2)的核移位作用。结果与我们先前报导的一致，在30min之内，T4导致磷酸化MAPK在CV-I细胞中核内累积(图27)。用指定浓度的αVβ3拮抗物预培养CV-I细胞16h，降低T4导致MAPK活化作用和移位作用的能力。RGD肽在10-8和10-7M浓度下的应用对MAPK活化的作用很小。然而与对照培养基相比，10-6MRGD肽能够抑制62％的MAPK磷酸化作用，当培养基中RGD浓度为10-5M(85％降低)和10-4M(87％降低)时活化作用被最大限度地降低。在CV-I细胞中，用T4处理后，向培养基中加入非特异性RGE肽没有影响MAPK磷酸化作用和核移位作用。
阻止T4结合到原生质膜上的Tetrac是一种有效的T4-导致的MAPK活化作用抑制剂。当T4浓度为10-6M时，与只用T4处理的对照培养基相比，tetrac降低86％的MAPK磷酸化作用和移位作用(图27)。当在使用T4之前向培养基中加入10-4M tetrac处理16小时时，抑制作用增加到97％。在用T4刺激之间16小时加入向培养基中加入单克隆抗体LM609也能降低T4-诱导的MAPK活化。T4处理之后，LM609在培养基中的浓度为0.01和0.001μg/ml时不影响MAPK活化作用。与单独使用T4处理的细胞相比，在培养基中抗体的浓度提高到0.1、1、和10μg/ml时，能够使细胞核部分的磷酸化MAPK水平降低29％、80％、和88％。
CV-I细胞用siRNA瞬时转染为αV、β3或αV和β3，并在置于无血浆培养基之前恢复16小时。T4处理30min之后，采集细胞提取核内蛋白或者RNA。Figure 28A说明各个siRNA对靶分子整合素亚基的特异性。用αVsiRNA或αV和β3siRNAs转染的CV-I细胞显示减少的αV亚基RT-PCR产物，但当细胞用对β3有特异性的siRNA转染时，或者在不存在外源siRNA的情况下暴露于转染反应剂时，αVmRNA的表达不存在差异。相似地，用β3siRNA转染的细胞已经降低了β3mRNA的水平，但相对而言未改变的αVsiRNA的水平。无论siRNA是否进入到细胞之内，加入T430分钟不改变对于αV或者β3的mRNA水平。
用western印记调节用分别对于αV和β3或二者结合物的siRNAs转染的CV-I细胞中活化的MAPK水平(图28B)。与母细胞系相比，用siRNA搅乱负控制处理的CV-I细胞具有稍微提高的T4-诱导活化的MAPK水平。单独暴露于转染反应剂的细胞显示与未转染的CV-I细胞相似的MAPK磷酸化水平和模式。当单一的αVsiRNA或β3siRNA或者其结合物被转染入CV-I细胞中时，介质处理的培养基中的磷酸化MAPK水平有所提高，但T4导致活化MAPK水平进一步提高的能力受到抑制。
实施例26αVβ3抗体阻断激素导致的血管新生 在CAM试验中，通过应用生理浓度的T4能够刺激血管新生(图29A和图29B的概括)。与PBS处理的细胞膜相比，置于CAM过滤片上的10-7M的T4使血管分支形成提高2.3倍(P＜0.001)。丙基硫氧嘧啶能够阻止T4到T3的转变，对T4引起的血管新生没有影响。直接抗αVβ3的单克隆抗体LM609(10μg/过滤片)的加入能够抑制对于T4的前血管生成反应。
实施例27用于短期和长期运输的甲状腺激素类似物生物相容性聚合结合物 草图1甲状腺激素类似物

草图2显示棍、球和棍、盘形和空间填充物模型的分子模型3D视图，用于相对评价。
棍模型两套分子-下面一套显示分子密度 1套Triac和Tetrac(黄色表示碘，红色表示)
2套
球和棍模型Triac和Tetrac-下面一套显示分子密度和第1套的地形阵列分布。
1套
2套
盘状模型Triac和Tetrac
空间填充物模型Triac和Tetrac
甲状腺激素类似物和抗癌活性 甲状腺激素代谢产物Triac和tetrac可用于处理的甲状腺癌从而富集并作为需要的治疗剂替代品。
商业购得的甲状腺激素及其类似物 市场上可购得的合成甲状腺激素的商标名称包括Unithroid、Levothroid、Synthroid和Levoxyl。常用的制剂包括Levo-T、Levothyroxine Sodium和Novothyrox。
天然的甲状腺激素得自屠宰牲畜的甲状腺，以干燥粉末形式作为食品增补剂出售。这种干燥的产品可能包含不需要的动物蛋白质、T3和T4化合物不适当的比例和最不推荐使用的合成粘合剂。由于动物的腺体不同，每批产品T3与T4的比例可能是变化的，且对于人类患者没有适当的恒定供给方式。由于系统在剂量、传递和有效性方面的复杂性，十分需要标准的、恒定的、限定的剂量和瞬时释放方式，使其能够被人类或其他应用安全的使用。
甲状腺激素调节的释放系统 直至今日，在美国，可以使用甲状腺激素代替治疗的非特异性和标准化治疗方式治疗病人。根据个性化需要，我们提议了一种长期永久的个体甲状腺成分缓释系统，在实验系统中预先排列了剂量、所需活性和反应曲线。我们通过将结合甲状腺成分的聚合物传递到产物位点来确定剂量并以限定的方式分布。通过可水解性和不可水解性特征，提议的结合物(图3-草图a)能够实现具有短期和长期的释放容量。从而实现用于特异性心血管和伤口愈合性质的最小剂量水平传递。
草图3有序和随机的聚合结合物
O＝药物/有机化合物/整体结合 药物/API结合物的局部聚合模型 结合的给药系统在给药系统发展过程之中，合成聚合物结合的化学体已经普及。在应用和交易中，可以使用各种合成的、天然的和生物聚合而得的侧基基团与有效的生物可降解的骨架聚合物。为了达到目的，可以根据结合产品最终的特性，按照它们的亲水性、疏水性、和被酶、辅因子和生物常用酸水解的性质，使用聚烷基乙二醇、聚酯、聚酸酐、聚糖和聚氨基酸进行结合。
聚合物结合-合成及纯化 我们建议建立一个对于对照的结合产物的库，包括生物高聚物的可水解的和不可水解的聚合结合产物。一个试验的例子从每类聚合产物按照它的涉及输送、运输、半衰期和退化和或糜烂资料的药物动力学对它们的详细研究进化而来。该系列也试着去制备并存的或组合合成的库设计，这些组合合成适于对底物的类似的化学种类的反应，并利用DCC、DCC/基于HOBt、和其它水溶性的试剂包括连接键的放置和为了将来的发展在聚合结合组合的或并行的合成中基于合成的策略通常使用的NHS酯。利用在PRI的合成器的现有设备可得到这个效果，并且每个产物对于生物检验体系的适应性分别来纯化。
草图4从自然的、合成的和聚肽高聚链的典型的聚合结合结构
n＝链的长度 R＝H，具有两种不同功能的PEG-连接-T3 R＝I，具有两种不同功能的PEG-连接-T4
甲氧基-PEG-连接-T4甲状腺产物的聚合结合物
R＝HEMA链的重复单元 聚-(HEMA)-连接-T4-结合物
聚-(乙烯基-合-马来酐)固定结合物 A＝甲状腺部分(通过氨基酸结合)
R＝重复的链单元 A＝甲状腺部分(通过碳末端结合) 聚-(丙交酯-合-赖氨酸)固定结合物
R1＝糖链的单体 R2＝甲状腺部分 透明质酸绑定结合物
R＝甲状腺部分T3/T4/DITPA/GC-1 多重功能聚氨胺上固定的甲状腺部分
A＝结合的选择的甲状腺部分 可动的甲状腺聚肽结合物 聚合结合物-物理和化学的表征 使用核磁共振(高和低场-质子和碳，任何可使用的地方使用DEPT，HOMOCOSY和HETEROCOSY/HETCOR)、红外，质谱仪、高效液相色谱、对稳定适应性和降解速率分布的热和环境退化分析对聚合绑定化合物进行彻底的光谱分析和色谱分析。
释放和稳定性研究 对定量释放分析的详细的高效液体色谱分析在我们对每个甲状腺产物建立的方法基础上进行，也就是GC-1、T3、T4和DITPA以及Triac和Tetrac与个别聚合物和聚合物共轭产物的色谱和光谱分析的分布图。
对结合的聚合物相容性标准 生物可降解的和生物相容的聚合物已经指定为有希望的载体作为长期和短时间运载工具包括不可水解的聚合结合物(表1)。PEG和PEO是最普通的分子量范围很宽的羟基端聚合物对可溶性(简易的载体模式)、降解时间和结合的解除来挑选。一端保护的甲氧基-PEG也被用作直链能膨胀的载体从而降低在亚细胞运输期间蛋白质附着或粘着的概率。乙烯和乙酸乙烯酯的某一共聚物，也就是说，本质上有特别好的生物适应性低结晶度和疏水性的EVAc是对包囊调节的药物输送载体的理想候选。
证明有高半衰期和体系内保留的性质的聚合物将保证结合的目的。从乳酸和羟基乙酸中大多数普通的和推荐的可生物降解的聚合物间可以使用。L-丙交酯的共聚物、和L-赖氨酸是有用的，因为它的胺官能团对酰胺键形成的有效性，并且这充当载体和可运输的甲状腺化合物通过所有的甲状腺组分的羧基部分连接在一起的比较长久维持的共价键。
从纤维素、几丁质、右旋糖酐、聚蔗糖、果胶、角叉菜胶(所有的亚类)、和海藻酸盐和一些它们的半合成衍生物中的自然产生的多糖是理想载体，因为它的高生物适应性、生物体系熟悉的降解产物(从葡萄糖和果糖的单糖)、亲水性、可溶性、对聚合基质的较长久稳定的蛋白质固定化/相互作用。这提供一个壳来额外的保护聚合基质避免将来降解并增加结合的有效半衰期。
从血清白蛋白、胶原、白明胶和聚L-赖氨酸、聚L-丙氨酸、聚L-丝氨酸的蛋白质和多肽是基于有有利的载体分子生物降解、生物适应性和适度的释放时间的自然的氨基酸。聚L-丝氨酸更有兴趣，是由于它的不同链衍生物，例如，聚丝氨酸酯、聚丝氨酸亚胺和普通的对特殊的共价结合有空余位点的聚丝氨酸聚合主链。
从异丁烯酸衍生聚合物的合成的水凝胶已经经常用于生物医学应用因为它们与活组织的相似性。最广泛使用的合成水凝胶是丙烯酸、丙烯酰胺和2-甲基丙烯酸羟(HEMA)的聚合物。聚HEMA是便宜的、生物相容的、可利用的伯醇侧链延长功能用来结合和适于眼睛、眼内及其他眼科的应用，这使得他们成为理想的药物输送物。pHEMA对细胞附着是免疫的并提供零细胞运动，这使得他们成为体内输送系统的理想候选。
随着粗DITPA结合产物的发展已经获得合成甲状腺类似物DITPA结合物库设计程序。通过Dicycolhexyl碳二亚胺和通过其他的亲水的和疏水性的耦合试剂PVA和PEG亲水性聚合物连接在一起，也在不断发展。
在固相合成器上的文库合成进化设计处于最后阶段，根据试验系统和参数标准的共性，将会启用它的高流通量筛选(HTS)模型。以结构传输分析(SDA合成)为目的，累计结合物传送时间、半衰期和构思稳定性的统计分析。下表是用于制备的聚合结合物(表8)。
表8根据化学种类反应性和稳定性数据，用于制备的指定聚合结合物文库 其他实施方式 虽然本发明已经通过结合详细的说明进行了描述，但是前面的说明只起到指示性作用，并不能限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书来定义。本发明的其他方面、优势和修饰包括在所附权利要求书的范围内。
权利要求
1.治疗服从促进血管新生治疗的病况的方法，所述方法包括向需要治疗的患者给药一定量的甲状腺激素、甲状腺激素类似物或其聚合体形式，能够在所述患者体内有效的促进血管新生。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述服从促进血管新生治疗的病况选自闭塞的血管病、冠状动脉硬化性心脏病、勃起的机能障碍、心肌梗死、缺血、撞击、外周动脉血管的病症和伤口。
3.如权利要求1所述的方法，其中甲状腺激素或类似物与下列成员结合，这些成员包括聚乙烯醇、丙烯酸乙烯共聚物、聚乙二醇(PEG)、聚乳酸、和琼脂糖。
4.如权利要求1所述的方法，其中甲状腺激素类似物是左旋甲状腺素(T4)、三碘甲腺原氨酸(T3)、3，5-二甲基-4-(4′-hydroy-3′-异丙基苯甲基)-苯氧乙酸(GC-I)、或3，5-二碘甲状腺丙酸(DITPA)。
5.如权利要求1所述的方法，其中甲状腺激素、甲状腺激素类似物或其聚合体形式的给药方式是肠胃外给药、口服给药、直肠给药、局部给药、或其结合。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述肠胃外给药是皮下注射、腹腔内给药、肌肉注射、静脉注射或其结合。
7.如权利要求1所述的方法，其中甲状腺激素、甲状腺激素类似物或其聚合体形式被装入胶囊或整合入微粒、脂质体、或聚合物中。
8.如权利要求7所述的方法，其中聚合物是多聚糖脂类、聚交酯或其共聚物。
9.如权利要求7所述的方法，其中脂质体或微粒的尺寸小于大约200nm。
10.如权利要求7所述的方法，其中对脂质体或微粒进行静脉给药。
11.如权利要求10所述的方法，其中脂质体或微粒可以存放在缺血性组织周围的毛细血管层。
12.如权利要求1所述的方法，其中甲状腺激素、甲状腺激素类似物或其聚合体形式通过导管给药。
13.如权利要求12所述的方法，其中甲状腺激素、甲状腺激素类似物或其聚合体形式存在于一种聚合体系中，这种聚合体系通过所述导管应用于血管内部。
14.如权利要求1所述的方法，其中甲状腺激素、甲状腺激素类似物或其聚合体形式与一种或一种以上化合物共同给药，所述化合物包括生长因子、血管扩张剂、阻凝剂、和其结合物。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述生长因子选自转换生长因子α(“TGFα”)、转换生长因子β(″TGFβ″)、基本成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、上皮生长因子、神经生长因子、血小板衍生生长因子、和血管通透因子。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述血管扩张剂是腺苷、腺苷衍生物或其结合物。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述抗凝剂是肝素、肝素衍生物、抗-因子Xa、抗凝血酶、乙酰水杨酸、氯吡格雷或其结合物。
18.如权利要求14所述的方法，其中甲状腺激素、甲状腺激素类似物或其聚合体形式先于或后于所述生长因子、血管扩张剂、阻凝剂或其结合物注射给药。
19.促进血管沿着或围绕医疗器材生成的方法，所述方法包括在将装置插入病人体内之前，用甲状腺激素、甲状腺激素类似物或其聚合体形式包覆装置。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述包覆步骤进一步包括用生长因子、血管扩张剂、阻凝剂、或其结合物包覆装置。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述医疗器材是扩张器、导管、套管、或电极。
22.用于治疗服从抑制血管生成疗法的病况的方法，所述方法包括对所需患者给药一定量的抗血管生成剂，在所述患者体内有效的抑制血管生成。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述服从抑制血管生成疗法的病况选自原发性或转移性瘤、神经胶质瘤、乳腺癌和糖尿病性视网膜病。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述抗血管生成剂是四碘甲腺乙酸(TETRAC)、三碘甲腺乙酸(TRIAC)、单克隆抗体LM609、XT 199或其结合物。
25.如权利要求22所述的方法，其中抗血管生成剂的给药方式是肠胃外给药、口服给药、直肠给药、局部给药或其结合。
26.如权利要求22所述的方法，其中抗血管生成剂与一种或一种以上其他抗血管生成治疗剂或化疗剂一起共同给药。
27.如权利要求22所述的方法，其中抗血管生成剂在细胞表面起作用。
28.一种血管生成剂，包括甲状腺激素或其类似物。
29.一种血管生成剂，包括甲状腺激素或其与聚合物结合的类似物。
30.如权利要求29所述的血管生成剂，其中所述类似物选自图20、表格A-D列举的化合物。
31.如权利要求29所述的血管生成剂，其中所述甲状腺激素类似物是左旋甲状腺素(T4)、三碘甲腺原氨酸(T3)、3，5-二甲基-4-(4′-hydroy-3′-异丙基苯甲基)-苯氧乙酸(GC-I)、或3，5-二碘甲状腺丙酸酸(DITPA)。
32.如权利要求29所述的血管生成剂，其中所述聚合物是聚乙烯醇、丙烯酸乙烯共聚物、聚乙二醇(PEG)、聚乳酸或琼脂糖。
33.如权利要求29所述的血管生成剂，其中所述结合是通过共价键或非共价键结合。
34.如权利要求33所述的血管生成剂，其中所述共价键是酯键或酸酐连接键。
35.一种药物制剂，包括在药学可接受的载体中的权利要求29的血管生成剂。
36.如权利要求35所述的药物制剂，进一步包括一种或一种以上药学可接受的赋形剂。
37.如权利要求35所述的药物制剂，其中所述血管生成剂被装入胶囊或并入微粒、脂质体、或聚合物中。
38.如权利要求37所述的药物制剂，其中脂质体或微粒的尺寸小于200nm。
39.如权利要求35所述的药物制剂，其中所述制剂以肠胃外给药、口服给药、直肠给药或局部给药方式或其结合给药。
40.如权利要求35所述的药物制剂，其中所述制剂与一种或一种以上化合物共同对所需患者给药，一种或一种以上化合物选自生长因子、血管扩张剂、阻凝剂、和其结合物。
41.用于治疗神经变性的疾病或不适的药物组合物，包括治疗有效量的一种或一种以上甲状腺激素类似物。
42.如权利要求41所述的药物组合物，其中所述甲状腺激素类似物是T3、DITPA、或GC-I。
43.如权利要求41所述的药物组合物，其中所述甲状腺激素类似物与聚合物相结合。
44.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述聚合物选自聚乙烯醇、聚乳酸、丙烯酸酐、聚乙二醇、纤维素、和树枝状大分子。
45.如权利要求41所述的药物组合物，其中所述甲状腺激素类似物与纳米粒子结合。
46.如权利要求41所述的药物组合物，其中所述组合物进一步包括前血管新生因子、神经生长因子、神经发生因子、消炎剂、抗氧化剂或其结合物。
47.如权利要求46所述的药物组合物，其中所述前血管新生因子是FGF或VEGF。
48.如权利要求46所述的药物组合物，其中所述抗氧化剂是维生素C、维生素E、似白藜芦醇化合物或其结合物。
49.如权利要求46所述的药物组合物，其中所述消炎剂是选自非甾醇类化合物、胰岛素感光剂、和蛋白体酶抑制剂的化合物。
50.如权利要求41所述的药物组合物，其中该组合物进一步包括药学可接受的赋形剂。
51.如权利要求41所述的药物组合物，其中所述治疗有效量的剂量在1到100mg之间。
52.如权利要求41所述的药物组合物，其中所述神经变性疾病或不适选自运动神经元缺陷、肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化、脊髓损伤、脱髓鞘疾病、脊髓病。
53.治疗神经变性疾病或不适的方法，所述方法包括向有需要的患者给药药学有效量的药物组合物，该药物组合物包括一种或一种以上甲状腺激素类似物。
54.如权利要求53所述的方法，其中药物组合物与神经生长因子、神经发生因子、抗氧化剂、消炎剂或其结合物共同给药。
55.修复外周神经系统或中枢神经系统神经途径损伤的方法，所述方法包括向有需要的患者给药药学有效量的药物组合物，该药物组合物包括一种或一种以上甲状腺激素类似物。
56.用于诊断神经变性疾病的显象剂，包括与转甲状腺素蛋白结合的标记的甲状腺激素类似物。
57.如权利要求56所述的显象剂，其中所述显象剂经过血脑屏障。
58.如权利要求56所述的显象剂，其中所述甲状腺激素类似物选自T3、T4、DITPA、GC-I。
59.如权利要求56所述的显象剂，其中所述甲状腺激素类似物与聚合物相结合。
60.如权利要求56所述的显象剂，其中所述甲状腺激素类似物与树枝状高分子相结合。
61.如权利要求56所述的显象剂，其中所述神经变性疾病是阿尔茨海默氏病。
62.如权利要求61所述的显象剂，其中所述显象剂抑制淀粉状蛋白纤维的形成。
63.如权利要求56所述的显象剂，其中所述显象剂通过电子发射断层扫描、单光子发射计算机断层照相、或磁共振成象仪成象。
64.如权利要求56所述的显象剂，其中所述甲状腺激素类似物与视黄酸、卤化己烯雌酚、或其类似物相结合。
65.用于诊断阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括对怀疑已经患有或可能患有阿尔茨海默氏病的患者给药显象剂，所述显象剂包括与转甲状腺素蛋白结合的标记的甲状腺激素类似物，并使用脑显象技术，形成至少一个显示显象剂在患者大脑中分布的图像，所述脑显象技术选自电子发射断层扫描、单光子发射计算机断层照相、或磁共振成象仪。
全文摘要
本发明公开了治疗患有涉及到血管新生疾病的主体的方法，包括给药有效用量的聚合形态的甲状腺激素，或它的拮抗物，来促进或抑制患者体内的血管新生。聚合形式的甲状腺激素组合物，或甲状腺激素类似物，在这里也被公开。
文档编号A61P9/00GK101102758SQ200580038970
公开日2008年1月9日 申请日期2005年9月15日 优先权日2004年9月15日
发明者莎克尔·A·莫萨, 费思·B·戴维斯, 保罗·J·戴维斯 申请人:奥德威研究院, 阿尔伯尼药学院