促转导素B(Protransduzin B)－基因转移的增强剂的制作方法
【专利说明】促转导素 B(Protransduzin B) _基因转移的増强剂
[0001] 本发明涉及一种N末端被保护的肽，涉及含有所述肽的药物，涉及所述肽在基因 治疗中的用途，涉及一种增强基因工程化病毒载体对细胞感染的方法，以及涉及所述肽在 扩大转染或转导中的用途。
[0002] 近年来，基因工程的重要性日益增加，因为在应用方法中所取得的重大进步，还因 为不仅可以预测蛋白/肽类活性物质的生产，并且可以预测作为实验工具的、携带稳定基 因的细胞转染，以及在细胞中引入基因作为基因缺陷的治疗手段最终将与许多疾病的治疗 尚度相关。
[0003] 自从产生第一个人类基因的克隆和重组，由于基因转移的方法经历了持续不断的 进步并且伴随着效率的增加，引入遗传材料以改变特定的细胞功能已经成为生物一医疗的 基础性和应用性研究中必不可少的研究工具。基因引入的许多方法已经被优化。相应的经 验已经积累了很多年的历史，这些经验的积累在最初是很慢的。
[0004] 甚至在1953年F.克里克与J.沃森对脱氧核糖核酸（DNA)的功能进行阐述之前， F.格里菲斯（F. Griffith)就已经在20世纪20年代末成功完成了将非致病性肺炎球菌菌 株转化为病原菌的实验。该转化是在一个幸运的情况下发生的，由于肺炎球菌具有罕见的 DNA摄取的自然能力。将特定的DNA引入到原核生物中是由J.莱德伯格、M.德尔布吕克和 S. Luria等人完成的，其中，借助于噬菌体，即所谓的转导。随着细胞培养体系的建立，在体 外条件下培养真核细胞，已经开发了许多种用于转染的物理和化学方法。物理方法更为经 常使用，然而需要更昂贵的设备，包括电穿孔和显微注射，它们与更简单适用的化学方法相 竞争，如磷酸钙沉淀法（在20世纪80年代经常使用并至今仍使用）或基于阳离子脂质体 或阳离子聚合物的方法（该方法在20世纪90年代早期被广泛使用）。然而，这些方法的 使用总是依赖于细胞或DNA。并且，被引入细胞中的DNA通常在染色体外（瞬时转染），因 此它并没有传给子细胞。然而，噬菌体（如λ噬菌体）已知能够将它们的DNA整合到宿主 基因组（前噬菌体、溶原性感染途径）。至此，它只是通往"建立逆转录酶病毒作为基因载 体"（由Doehmer等人和Tabin等人）的一小步（1981/1982)。病毒是种类特异性和器官/ 组织特异性的，这就是为什么所有的病毒不能感染所有的（真核）细胞的原因。改变病毒 包膜（糖蛋白交换，所谓的假型病毒）和添加主要为阳离子型的肽都被认为可提高转导效 率。
[0005] 在HIV的研究中，摄取病毒颗粒的第一代增强剂吸引了注意力。在对特定细胞的 体外感染试验的分析过程中，观察到了血液的滤液肽对HIV融合的抑制作用（Munch等人， VIRIP)。
[0006] 已经表明，出人意料的是，这些蛋白质片段是天然存在的，它们形成了纤维状结 构，作为人类精子的增强剂，"衍生自精液的病毒感染增强剂"（"Semen derived Enhancer of Virus Infection" (SEVI))，其特征为淀粉样原纤维。这些纳米纤维提高了病毒与其革巴 细胞的对接，按10的数次方增加了病毒感染的比率。
[0007] 这已用于改进逆转录病毒的基因转移，并用于基础研究以及可能的未来治疗应 用。因此，能够表明，当SEVI蛋白存在下，用于基因治疗的慢病毒和γ-逆转录病毒，对不 同的细胞类型（如人类T细胞、宫颈癌细胞、白血病细胞、造血干细胞、和胚胎干细胞），均展 现出高出许多倍的基因转移率（Wurm等人，J. Gene Med. 2010,12,137-46 ;Wurm等人，Biol. Chem. 2011，392, 887-95)。
[0008] 针对开发其他增强剂（比如，SEVI和精胶蛋白（seminogelin))的研究，产生了一 种假设：来自病毒包膜蛋白的肽也可适于作为转染的增强剂，这令人惊奇地是一个出乎意 料的巨大成功（MARAL Yolamanova，自然纳米技术）。因此表明，例如，与不同浓度（1-100 微克/ml)的促转导素 A(同义词：EF-C)进行预孵育的HIV，表现出对报道细胞的感染率有 10的数次方的增加。至于作用机理，通常认为EF-C形成了纤丝结构，其能够结合和浓缩病 毒，并相应地增加了进入细胞的病毒数量。除了用病毒颗粒进行感染，EF-C还高效地增强 了慢病毒和逆转录病毒颗粒在应用于基因治疗的广泛多样的人细胞类型中（如T细胞、神 经胶质细胞、成纤维细胞、造血干细胞）的转导（Jan MUnch等，自然纳米技术，Vol. 8, No. 2， 页码：130-136)。专利申请EP 2452947 Al也涉及了促转导素（protransduzin)A。
[0009] 如上所述，由于基因技术的重要性日益增加，更有效的基因转移增强剂是所期望 的。本发明的目的是提供一种改进的基因转移的增强剂。
[0010]出人意料地，已经发现，具有如下所示的序列的N端被保护的肽，实现了本发明的 目的：
[0011] X-Glu-Cys-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln(SEQ ID N0:1),
[0012] 其中，X为保护肽的N端的基团。具体地，X代表1个或2个烷基，如甲基、乙基、丙 基或丁基、酰基（如乙酰基或丙酰基）、或X-Glu基团为氨基酸焦谷氨酸：
[0014] 出人意料地，已经发现，具体地，正是在体外用焦谷氨酸对N端进行的修饰（无细 胞影响，尤其在酶的存在下），导致了促转导素（protransduzin)在水溶液中的稳定性的极 大提高。该结果可以从图1中清楚地看到。
[0015] 在图1左栏（HPLC色谱图）中的在-20°C下储存0-13天和4°C (13天）的促转导 素 A的结果，与同等条件下的促转导素 B的结果进行了比较。很明显，在4°C下储存13天 后，促转导素 A几乎降解至一半，而促转导素 B在同样的储存条件下几乎完全没有降解（峰 的高度对应于样本中所含的组分的浓度）。
[0016] 在《生物化学期刊》（Journal of Biological Chemistry, Vol. 286, No. 45，页码： 38825-38832)，S. Jawhar等人报道了关于淀粉样蛋白，尤其是焦谷氨酸修饰的淀粉样多肽 的科学状态。这种淀粉样多肽含有大量的氨基酸，并且基本上不能与短链肽相比，而本发明 所述的淀粉样蛋白也属于短链肽。顺便提及，该微评论涉及发生在体内条件下且酶存在下 的细胞事件，这种体内条件与本发明中促转导素的稳定性得到提高的条件（即体