外条件） 是绝对没有可比性的。
[0017] 本发明所述的肽还可以被用作药剂。
[0018] 本发明还涉及本发明所述肽的用途，它被用于基因治疗，以治疗能够用基因治疗 进行治疗的疾病。
[0019] 本发明还涉及一种增强病毒对细胞的感染的方法，包括步骤：
[0020] 提供权利要求1所述的肽，溶解于有机溶剂中；
[0021] 将所述肽加入到水溶液中，以形成所述肽的不溶性聚集物；
[0022] 混合上一步骤的溶液；和
[0023] 培养细胞。
[0024] 本发明还涉及本发明所述肽的用途，用于增强病毒对细胞的感染。
[0025] 最后，含有本发明所述肽的试剂盒同样要求保护。
[0026] 本发明所述的肽（促转导素 B)可以，例如，根据Merrifield的方法，用Fmoc保护 的氨基酸进行制备。
[0027] 该方法可使用Fmoc保护的衍生物，即，用9-芴甲氧羰基保护的氨基酸，根据 Merrif ield原理进行逐步的固相合成，尤其在预负载了 Fmoc-L-谷氨酰胺的、作为ABI-433 合成仪上的固相载体的Wang树脂（0. 59mmol/g，100-200目）上进行。
[0028] Fmoc - L -氨基酸的激活（典型地，Fmoc - L -氨基酸是10倍摩尔过量的），是 与[(2-(1Η-苯并三唑-1-基）-1，1，3,3_四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU，100mmol/l)在室温 下进行的，并加入0. 5M 1-羟基苯并三唑（HOBt)和2M二异丙基乙胺（DIEA)(溶于N-甲 基-2-吡咯烷酮（NMP))。
[0029] 各酰化反应进行45分钟，然后用20%的哌啶脱去Fmoc保护进行15分钟。
[0030] 合成中还用到下述氨基酸衍生物以及相关的正交酸可裂解的侧链保护基团：
[0031] Fmoc-L-Asn (Trt)、Fmoc-L-Cys (Trt)、L-pGlu、Fmoc-L-Gln (Trt)、Fmoc-L-Ile、 Fmoc-L-Lys(Boc)、Fmoc-L-Met 和 Fmoc-L-Trp(Boc)〇
[0032] 用94%三氟乙酸（TFA)、3%乙二硫醇（EDT)和3%的软化水从肽基树脂中裂解开 树脂载体后，粗肽在冷的叔丁基甲基醚中沉淀，粗肽经离心获得，为沉淀物，而上清液被弃 去。
[0033] 随后的粗肽的色谱纯化，是通过梯度洗脱以制备型方式实现的。
[0034] 专利申请ΕΡ2452947Α1所述的促转导素 A和促转导素 B的区别，在于如下事实： 促转导素 B中，合成的L 一焦谷氨酸（pGlu)被插入到N末端，以替换合成的L 一谷氨酰胺 (Gln)。原始的谷氨酰胺通过闭环被修饰成内酰胺。
[0035] 纯化：
[0036] 制备型分离：用购自于Gilson公司的HPLC进行纯化。UV/VIS探测器购自 Kronwald公司，并且在波长230nm下检测分离。流速为40ml/min。
[0037] 柱是 Waters Prep-Pak C18 柱（47x 300mm)。
[0038] 洗脱液A :0. 1 % TFA (溶于软化水），洗脱液B :0. 1 % TFA (溶于80 %的乙腈和20 % 的软化水）。
[0039] 促转导素 B的梯度为35 % -55 %的洗脱液B，洗脱40分钟。即，每分钟0. 5 %的洗 脱液B。
[0040] 促转导素 B在40%的洗脱液B中洗脱，在0. 5-1分钟收集数个洗脱组分。经分析 的纯的洗脱组分被合并且冻干。
[0041] 应用方法：
[0042] 冻干法：
[0043] 购自Christ公司的、技术参数设置如下的单元Epsilon 1/45,被用于冷冻干 燥：搁板面积3. 78m2;冰容量约60kg ;冰凝汽器性能最大值45kg/24h，真空栗的终分压为 I X 10 3/10 4毫巴（在有/无气镇的情况下）；冻干数据（用气镇手动操作单元）；终分压为 I X 10 2毫巴；冰冷凝器温度一 50°C ;搁板温度+15°C ;搁板加热的工作点0. 5毫巴；冷冻干 燥时间长达3天。
[0044] 用促转导素 B进行细胞转导
[0045] 溶解0. 5mg的促转导素 B于50 μ I DMS0。然后向该溶液中加入450 μ 1的PBS，3 分钟内形成细纤维状物质。将上述原液（lmg/ml)加入到载体中，获得浓度为25 μ g/ml的促 转导素 B。涡旋溶液1分钟，然后5000g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀悬浮于少量PBS， 并添加至细胞中。细胞在保温箱内孵育2天。
[0046] 促转导素 B显著增强了转导率。借助促转导素 B，高达96%的细胞被转导。
【主权项】
1. 一种N端被保护的肽，具有如下序列： X-Glu-Cys-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln? 其中，X为保护肽的N端的基团。2. 如权利要求1所述的肽，其特征在于，X为1个或2个烷基，例如甲基、乙基、丙基、或 丁基、酰基，例如乙酰基或丙酰基，或基团X-Glu为氨基酸焦谷氨酸。3. -种药剂，其特征在于，所述药剂含有权利要求1或2所述的肽。4. 如权利要求1或2所述的肽在基因治疗方面的用途，其特征在于，用于治疗可以用基 因治疗进行治疗的疾病。5. -种增强病毒对细胞的感染的方法，包括步骤： 提供权利要求1所述的肽，溶解于有机溶剂中； 将所述肽加入到水溶液中，以形成所述肽的不溶性聚集物； 混合上一步骤的溶液；和 培养细胞。6. 如权利要求1所述肽的用途，其特征在于，用于增强病毒对细胞的感染。7. -种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的肽。
【专利摘要】一种N端被保护的肽，具有如下序列：X-Glu-Cys-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln(SEQ？ID？NO:1)，其中，X为保护肽N端的基团。
【IPC分类】C12N15/867, C07K14/005, A61K38/16
【公开号】CN105209480
【申请号】CN201480023747
【发明人】W-G·福斯曼, A·齐格拉杰
【申请人】法瑞斯生物技术有限公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2014年4月30日
【公告号】CA2909744A1, EP2992004A1, US20160185820, WO2014177635A1