专利名称：α-促黑激素(α-MSH)和心房利尿钠蛋白(ANP)的双功能融合蛋白以及在高血压和急性肾损 ...的制作方法
技术领域：
本发明通常涉及显示激素活性的新的化合物和其用途，并且特别地涉及显示双功 能激素活性的新的化合物和其用途，例如用于预防和/或治疗肾相关的疾病或病况诸如急 性肾衰竭(ARF)或急性肾损伤(AKI)。
背景技术：
急性肾衰竭(ARF)是数小时至数天内通过尿排出量上的减少表现出的肾功能上 的突然衰退。含氮排泄物累积导致电解质和液体动态平衡上的显著变化。急性肾衰竭可由 诱导缺血性损伤或直接的中毒性肾损伤的多种临床病况和药疗法所引起。较大的手术操 作、感染、休克、产后出血和肾脏灌注不足可导致尿排出量下降。急性肾衰竭通过血清肌酸 酐上升来诊断。在危重病人中，高分解代谢状态能导致含氮排泄物的迅速升高(通过血尿 素氮(BUN)的升高来反映)以及导致液体过剩的液体平衡上的严重偏移。具有对鉴定用于肾相关的疾病或病况例如ARF的预防和治疗的产品和方法的持 续的需求。本说明书提及大量文献，其内容通过引用全文并入本文。发明概述本发明一般涉及显示激素活性的新的化合物和其用途，并且特别地涉及显示双功 能激素活性的新的化合物和其用途。在第一方面，本发明提供双功能激素，其包含(a)第一结构域，其包含α _MSH肽或其片段、变体或片段的变体，所述片段、变体 或片段的变体具有α -MSH相关的激素活性；和(b)与所述第一结构域共价连接的第二结构域，所述第二结构域包含利尿钠肽或 其片段、变体或片段的变体，所述片段、变体或片段的变体具有利尿钠肽相关的激素活性。在一个实施方案中，当第一结构域是SEQ ID N0:1的α-MSH肽时，第二结构域是 具有利尿钠肽相关的激素活性的片段、变体或片段的变体，而当第二结构域是SEQ ID NO 2、3、4或5的利尿钠肽时，第一结构域是具有α -MSH相关的激素活性的片段、变体或片段的 变体。在一个实施方案中，上文提到的第一结构域包含SEQ ID NO 1的肽的至少4个氨 基酸的片段，或与所述片段具有至少75%同源性的所述片段的变体。在另一个实施方案中，上文提到的α -MSH肽的变体包含与SEQ ID NO :1的氨基酸 序列具有至少75%同源性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，上文提到的第一结构域包含式I (SEQ ID NO 47)的氨基酸序 列X2-H-X1-R-W-X3(I)其中X1 是 L-Phe 或 D-Phe ；X2是E、M-E或者不存在；X3 是 G-K-P-X4、G-K-P, G_K、G 或者不存在；X4 是 Μ、V 或 Nle。在一个实施方案中，上文提到的第一结构域包含(i) H-X1-R-W-G-K-P-X4 (SEQ ID NO 48)；(ii) M-E-H-X1-R-W-G (SEQ ID NO 17)；(Iii)H-X1-R-W-G (SEQ ID NO 49)；(iv) E-H-X1-R-W-G (SEQ ID NO :50)；(ν) H-X1-R-KSEQ ID NO :20)；或者其中X1 是 L-Phe 或 D-Phe,并且 X4 是 Μ、V 或 Nle。在一个实施方案中，上文提到的第一结构域包含(i)H-f-R-ff-G-K-P-V(SEQ ID NO :51)；(ii)H-f-R-ff-G-K-P-M(SEQ ID NO :52)；(iii)H-f-R-ff-G-K-P-Nle (SEQ ID NO :53)；(iv)H-f-R-ff-G-K-P(SEQ ID NO :54)；(ν)M-E-H-F-R-W-G(SEQ ID NO :11)；(vi)H-f-R-ff-G(SEQ ID NO :55)；(vii)E-H-F-R-W (SEQ ID NO :56)；(ix) E-H-f-R-ff-G (SEQ ID NO :57)；或(iv) H-f-R-ff(SEQ ID NO :6)；其中f是D-苯丙氨酸。在一个实施方案中，上文提到的第一结构域由下列组成(i)H-f-R-ff-G-K-P-V(SEQ ID NO :51)；(ii)H-f-R-ff-G-K-P-M(SEQ ID NO :52)；(iii)H-f-R-ff-G-K-P-Nle (SEQ ID NO :53)；(iv)H-f-R-ff-G-K-P(SEQ ID NO :54)；(ν)M-E-H-F-R-W-G(SEQ ID NO :11)；(vi)H-f-R-ff-G(SEQ ID NO :55)；(vii)E-H-F-R-W (SEQ ID NO :56)；(ix) E-H-f-R-ff-G (SEQ ID NO :57)；或(iv) H-f-R-ff(SEQ ID NO :6)；其中f是D-苯丙氨酸。在一个实施方案中，上文提到的第二结构域包含SEQ ID NO :2、SEQ IDNO :3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO :5的至少15个氨基酸的片段，或与所述片段具有至少75%同源性的所述片段的变体。在一个实施方案中，上文提到的利尿钠肽的变体包含与SEQ ID NO :2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO :5的氨基酸序列具有至少75%的同源性的氨基酸序列。在一个实施方案中，上文提到的第二结构域包含式II (SEQ ID NO 58)的氨基酸序 列X5-X6-X7-F-G-G-R-X8-D-R-I-X9 (II)其中X5 是 M、Nle、R-R-S-S, S-L-R-R-S-S 或者不存在；X6 是 C ；X7是H或者不存在；X8 是 M 或 Nle;X9 是 S-C-Y-R 或 G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y ；其中X6的C残基与X9的C残基形成二硫桥；并且当X5是Nle时，所述第一结构域在所述第二结构域的N端。在一个实施方案中，上文提到的第二结构域包含(i)M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置 2 和 13 的 C 残基形成二硫桥 (SEQ ID NO 22)；(ii)Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置 2 和 13 的 C 残基形成 二硫桥(SEQ ID NO 23)；(iii)C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 1 和 17 的 C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 24)；(iv)C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 1 和 17 的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 25)；(v) R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,其中位于位置 5 和21的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 26)；(vi) S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,其中位于 位置7和23的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 59)；或者(vii)M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 2 和 18 的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 60)。在一个实施方案中，上文提到的第二结构域由下列组成(i)M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置 2 和 13 的 C 残基形成二硫桥 (SEQ ID NO 22)；(ii)Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置 2 和 13 的 C 残基形成 二硫桥(SEQ ID NO 23)；(iii)C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 1 和 17 的 C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 24)；(iv)C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 1 和 17 的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 25)；
(v)R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 5 和21的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 26)；(vi) S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,其中位于 位置7和23的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 59)；或者(vii)M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 2 和 18 的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 60)。在一个实施方案中，上文提到的第一结构域在所述第二结构域的N端。在一个实施方案中，上文提到的双功能激素的氨基末端被C3-C16酰基基团乙酰化 或酰基化。在一个实施方案中，上文提到的双功能激素的羧基末端残基被酰胺化。在一个实施方案中，上文提到的第一结构域和第二结构域通过肽键共价连接。在一个实施方案中，上文提到的双功能激素含有(i)H-f-R-W-G-K-P-M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-1-S-C-Y-R，其中位于位置 9 和 20 的 C 残基形成二硫桥(SEQ ID NO 61)；(ii)H-f-R-W-G-K-P-M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中 位于位置9和25的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 62)；(iii)H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置 9 和 20的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 63)；(iv)H-f-R-ff-G-K-P-Nle-C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y， 其中位于位置9和25的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 64)；(v)M-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y, 其中位于位置12和28的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 65)；(vi)H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,其 中位于位置10和沈的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 66)； (vii)H-f-R-ff-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-1-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,其 中位于位置10和沈的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 67)；(viii)S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-H-f-R-W，其中位于位置7和23的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 68)；或者(i x)E-H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y, 其中位于位置11和27的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 69)；其中f是D-苯丙氨酸。在一个实施方案中，上文提到的双功能激素由下列组成(i) Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R-NH2，其中位于位置 9 和 20的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 31)；(ii)Ac-H-f-R-ff-G-K-P-M-C-F-G-G-R-M-D-R-1-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH 2，其中位于位置9和25的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 33)；(iii)Ac-H-f-R-ff-G-K-P-Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R-NH2,其中位于 位置9和20的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 34)；(iv)Ac-H-f-R-ff-G-K-P-Nle-C-F-G-G-R-Nle-D-R-1-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,其中位于位置9和25的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 35)；(v)M-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,其中位于位置12和28的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 36)；(vi)Ac-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,其中位于位置10和沈的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 38)；(vii)Ac-H-f-R-ff-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y -NH2,其中位于位置10和沈的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 39)；(Viii)S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-1-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-H-f-R-ff -NH2,其中位于位置7和23的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 40)；或者(iX)Ac-E-H-f-R-ff-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-1-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,其中位于位置11和27的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 42)；其中Ac代表氨基末端乙酰化；NH2代表羧基末端酰胺化；并且f是D-苯丙氨酸。在另一个方面，本发明提供了含有上文提到的双功能激素以及药学上可接受的载 体的组合物。在另一个方面，本发明提供了用于在受治疗者中预防和 到的双功能激素。在另一个方面，本发明提供了用于在受治疗者中预防和 到的双功能激素。在另一个方面，本发明提供了用于在受治疗者中预防和 合物，其含有上文提到的双功能激素和药学上可接受的载体。在另一个方面，本发明提供了用于在受治疗者中预防和 合物，其含有上文提到的双功能激素和药学上可接受的载体。在另一个方面，本发明提供了用于在受治疗者中预防和/或治疗肾病症的方法， 其包括向所述受治疗者施用有效量的下列物质中的至少一种(a)上文提到的双功能激 素，或者(b)上文提到的组合物。在一个实施方案中，上文提到的施用通过静脉内输注。在又一个实施方案中，上文 提到的静脉内输注是以约lng/kg/min至约10 μ g/kg/min的速率。在另一个方面，本发明提供了用于在受治疗者中预防和/或治疗高血压的方法， 其包括向所述受治疗者施用有效量的下列物质中的至少一种(a)上文提到的双功能激 素，或者(b)上文提到的组合物。在另一个方面，本发明提供了(a)上文提到的双功能激素或者(b)上文提到的组 合物中的至少一种在用于在受治疗者中预防和/或治疗肾病症的药物的制备中的用途。在另一个方面，本发明提供了(a)上文提到的双功能激素或者(b)上文提到的组 合物中的至少一种用于在受治疗者中预防和/或治疗肾病症的用途。在另一个方面，本发明提供了(a)上文提到的双功能激素，或者(b)上文提到的组 合物中的至少一种用于在受治疗者中预防和/或治疗高血压的用途。
/或治疗肾病症的上文提 /或治疗高血压的上文提 /或治疗肾病症的药物组 /或治疗高血压的药物组
在另一个方面，本发明提供了(a)上文提到的双功能激素，或者(b)上文提到的组 合物中的至少一种在用于在受治疗者中预防和/或治疗高血压的药物的制备中的用途。在一个实施方案中，上文提到的肾病症是急性肾损伤。在另一个实施方案中，上文提到的肾病症是手术后肾损伤或功能障碍。在又一个实施方案中，上文提到的手术后肾损伤或功能障碍是由用于瓣膜修复的 心肺旁路手术、主动脉瘤、器官移植、开心手术或冠状动脉移植所引起的。在一个实施方案中，上文提到的双功能激素或组合物适合通过静脉内输注来施 用。在又一个实施方案中，上文提到的静脉内输注是以约lng/kg/min至约10 μ g/kg/min 的速率。本发明的其他目的、优点和特征在阅读其具体实施方案的下列非限制性描述时将 变得更加明显，其中所述具体实施方案通过仅引用附图的实施例的方式给出。附图简述在所附的附图中
图1显示(A)以推注剂量静脉内注射逐渐增加的剂量的肽(SEQ ID NO 2和33) 对血压的作用。数据被绘制为从基线平均动脉压(MAP)(在图IA中用“B”表示)的百分比 变化。(B)单一剂量(30yg/kg/h输注)的肽对血压的作用。在一小时内记录MAP。数据 被绘制为作为时间(分)的函数的从基础MAP的百分比变化。#2=天然ANP (SEQ ID NO 2)，#33 = SEQID NO 33的双功能激素；图2显示在SD大鼠中双功能激素对高血压的作用。数据被绘制为从基础血压的 百分比变化；图3显示使用双功能激素的预防性处理对肾缺血后的急性肾功能障碍的作用；在 肾动脉夹紧前和夹紧后以15 μ g/kg/h输注肽#2或#33 —小时。在不同的时间测定血浆肌 酸酐和尿素。通过两因素方差分析(two wayANOVA)使用Bonferroni检验分析数据对盐水 处理组的显著性(每组η = 3 ；盐水组η = 6)。图4显示使用双功能激素的治疗性(即损伤后)处理对肾缺血后的急性肾功能障 碍的作用。在肾缺血的大鼠模型中在除掉肾夹之后输注肽#2和#332小时。在指定的时间 收集血液样品并测定血浆肌酸酐和尿素。通过两因素方差分析使用Bonferroni检验分析 数据对盐水处理组的显著性(每组η = 3 ；盐水组η = 6)；图5显示双功能激素的长期输注对肾缺血后的急性肾功能障碍的作用。在除掉肾 动脉夹之后，使用腹膜内植入式Alzet 微型泵以两个剂量输注肽#2或#33 (2ML1 ；输送速 率10μ Ι/h)。在指定时间测定血浆肌酸酐和BUN。通过两因素方差分析使用Bonferroni 检验分析数据对盐水处理组的显著性(每组η = 3 ；盐水组η = 6)；以及图6显示在经历30分钟肾缺血的大鼠的肾脏中嗜中性粒细胞标志物(⑶11 b)、肾 小管损伤标志物(KIM-I)和炎性细胞因子(IL-Ιβ)以及蛋白上样标志物(β-肌动蛋白) 的免疫化学鉴别。使用Alzet 微型泵以15 μ g/kg/h的输注速率输注双功能激素#33 24 小时。用特异性抗体鉴别蛋白。(A)蛋白质印迹。(B)柱状图显示标志物的相对丰度。发明的公开内容本发明涉及新的双功能激素以及其用途，例如用于预防和/或治疗肾相关的疾病 或病况诸如急性肾衰竭(ARF)或急性肾损伤(AKI)。双功能激素显示出对α _MSH(a -促黑激素)受体的生物活性和对利尿钠肽受体中的至少一种的生物活性。相应地，在一个方面，本发明提供了双功能激素，其包含(a)第一结构域，其包含α-MSH肽或其片段、变体或片段的变体，所述片段、变体 或片段的变体具有α -MSH相关的激素活性；和(b)与所述第一结构域共价连接的第二结构域，所述第二结构域包含利尿钠肽或 其片段、变体或片段的变体，所述片段、变体或片段的变体具有利尿钠肽相关的激素活性。在一个实施方案中，其中当第一结构域是SEQ ID NO :1的α -MSH肽时，第二结构 域是具有利尿钠肽相关的激素活性的片段、变体或片段的变体，而如果第二结构域是SEQ ID NO :2、3、4或5的利尿钠肽，第一结构域是具有α-MSH相关的激素活性的片段、变体或 片段的变体。本发明还提供了双功能激素，其包含与具有利尿钠肽相关生物活性的第二结构域 共价连接的具有α-MSH相关生物活性的第一结构域，其中(i)所述第一结构域不是全长 (即天然的)α -MSH肽，(ii)所述第二结构域不是全长(即天然的)利尿钠肽，或者(iii) ⑴和(ii)两者。黑皮质素是阿黑皮素原衍生的哺乳动物的肽激素，其包括促肾上腺皮质激素 (ACTH(1_39))、α-促黑激素((α-MSH (1-13))和包括β-和Y-MSH的相关的氨基酸序列。 黑皮质素肽具有强效的抗-炎性/抗细胞因子活性(Lipton和Catania，Immunol. Today 18:140-145,1997)。黑皮质素经由刺激黑皮质素受体(MCR)提供它们的活性中的至少一 些。促黑激素(MSH)活性部分归因于1至5型黑皮质素受体(MCR1-MCR5)的结合和激活。α -MSH以大的亲和力与已知在几种组织和细胞中表达的1型受体(MCRl)结合。 β -MSH、y -MSH和ACTH也与MCRl结合但亲和力较低。已报道MCR2仅结合ACTH而不与MSH 肽中的任何一个结合。Y -MSH以高亲和力与MCR3受体结合而β -MSH以高亲和力与MCR4 受体结合。α -MSH已经显示出抑制炎症过程的主要形式(Lipton和Catania，Immunol Today, 18 140-145，1997)，其包括1-嗜中性粒细胞趋化活性的抑制(Catania, Α. N.等人，Peptides, 17 :675-679,
1996)；2-由LPS处理诱导的细胞因子(IL-1，TNF- α )释放的抑制；3-响应细菌内毒素的 TNF-α 的抑制(Wong, K. Y.等人，Neuroimmunomodulation， 4:37-41,1997)；4-实验性炎性肠病中的炎症减少(Rajora，N.等人P印tides，18 :381_385，
1997)；5-缺血诱导的急性肾衰竭(Star，R. Α.等人 Proc. Natl. Acad. ki. U. S. Α，92 8016-8020,1995)；6-来自皮肤微血管内皮细胞的IL-8释放的增加(Hartmeyer，Μ. Τ.，J. Immunol, 159 :1930-1937,1997)；α -MSH作用通过在包括巨噬细胞、嗜中性粒细胞和肾小管的各种细胞类型中表达 的黑皮质素受体介导。利尿钠肽是由三种不同基因合成的肽家族中的一部分(Flyrm TG. Pro. Soc. Exp.Biol. Med. 213 :98-104,1996 ；Levin ER 等人· N Eng J. Med339 :321-328,1998 ；Ogawa Y 等 人.Clin Exp Pharmacol physioi. 22 :49-53,1995 ；Rosenzweig A., Annu Rev Biochem 60 =229-255,1991)并且之后被储存为三种不同激素原[即1 氨基酸的ANP、108氨基 酸的脑利尿钠肽(BNP)和126-氨基酸的C-型利尿钠肽(CNP)激素原](Levin ER等人， N Eng J. Med 339 :321-328, Vesely DL Atrial Natriuretic Hormones ( 素).Englewood Cliffs, NJ =Prentice Hall，1992，1—256)。在动物和人类中，126-氨基酸的ANP激素原中有四个肽激素，具有降低血压、利尿 钠、利尿和/或利尿钾特性。通过从激素原的N端末端开始的以它们的氨基酸序列编号的 这些肽激素如下-激素原的残基1-30长效利尿钠肽(LANP)；-激素原的残基31-67血管舒张剂；-激素原的残基79-98利尿钾肽；以及-激素原的残基99-1 :ANP。在另一方面，BNP和CNP基因看起来每种在它们各自的激素原中合成仅一种肽激 素艮口 BNP禾口 CNP。心房利尿钠肽(ANP)，主要来源于心房肌细胞的一种循环激素，在盐和水的动态平 衡以及血压的控制中起作用。此外，ANP是血管舒张剂并且也对肾脏具有直接作用，包括肾 小球滤过增加、钠再吸收抑制和促进尿钠增多和利尿的肾血流重分布。尿舒张素是利尿钠肽家族中的肾源性成员并且从相同的ANP激素原形成并由氨 基酸序列95-1 组成。除了 N端的4个氨基酸，其与ANP相同(99-126)。尿舒张素看起来 是肾脏中钠和水处理的重要调节剂，以及患有充血性心力衰竭(CHF)的患者中钠排出的介 质。BNP在健康人类中产生与ANP相似的生物学作用。在正常男性中输注BNP产生钠 排出上两倍的增加，血浆肾素、血管紧张素II和醛固酮分泌上50%的减少。从BNP原的C 端末端切割32个氨基酸的序列产生为在血浆中生理活性形式的人类BNP (77-108)。CNP诱导与其他利尿钠肽相似的心血管作用。从CNP原切割末端氨基酸序列 105-126以产生CNP的生物学活性形式。ANP和BNP的大多数生物学作用是由鸟苷酸环化酶偶合的细胞表面受体A-受体 (NPR-A)介导的(Garbers，DL，Cell 1992，71 1-4)。CNP是另一种鸟苷酸环化酶偶合的NP 受体 B-受体(NPR-B)的特异性配体(Maack T, Ann. Rev. physioi. 1992,54:11-27)。第三 种受体，所谓的NP清除受体(NPR-C)，结合ANP、BNP和CNP。除了在整个机体中NP清除上 的主要作用(Maack T, Ann. Rev. physioi. 1992,54 :11-27)，也报道过ANP的几种作用是经 由 NPR-C 受体介导的(Maack T, Kidney Int 1996，49 1732-1737)。除了与 NP 受体结合，利 尿钠肽还借助中性内肽酶通过蛋白质水解被清除。利尿钠肽受体的所有三个亚型(NPR-A、 NPR-B和NPR-C)已经被证实在包括肾系统和心脏的不同组织中表达(Nunez，DJR等人， J.ClinInvest. 1992,90 :1966-1971)。α -MSH、ANP、尿舒张素、BNP和CNP的天然氨基酸序列在下文表1中给出。表 权利要求
1.一种双功能激素，其包括(a)第一结构域，其包含α-MSH肽或其片段、变体或片段的变体，所述片段、变体或片 段的变体具有α-MSH相关的激素活性；和(b)与所述第一结构域共价连接的第二结构域，所述第二结构域包含利尿钠肽或其片 段、变体或片段的变体，所述片段、变体或片段的变体具有利尿钠肽相关的激素活性。
2.根据权利要求1所述的双功能激素，其中当所述第一结构域是SEQIDN0:1的 α-MSH肽时，所述第二结构域是具有利尿钠肽相关的激素活性的所述片段、变体或片段的 变体，而如果所述第二结构域是SEQ ID NO :2、3、4或5的利尿钠肽，所述第一结构域是具有 α -MSH相关的激素活性的所述片段、变体或片段的变体。
3.根据权利要求1所述的双功能激素，其中所述第一结构域包含SEQIDNO 1的肽的 至少4个氨基酸的片段，或与所述片段具有至少75%同源性的所述片段的变体。
4.根据权利要求1所述的双功能激素，其中α-MSH肽的所述变体包含与SEQID NO 1的氨基酸序列具有至少75%同源性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1或2所述的双功能激素，其中所述第一结构域包含式I(SEQ ID NO 47)的氨基酸序列X2-H-X1-R-W-X3 (I) 其中X1 是 L-Phe 或 D-Phe ； X2是E、M-E或者不存在； X3 是 G-K-P-X4、G-K-P, G-K、G 或者不存在； X4 是 M、V 或 Nle。
6.根据权利要求3所述的双功能激素，其中所述第一结构域包含(i)H-X1-R-W-G-K-P-X4 (SEQ ID NO 48)；(ii)M-E-H-X1-R-W-G (SEQ ID NO 17)； (Iii)H-X1-R-W-G (SEQ ID NO 49)；(iv) E-H-X1-R-W-G (SEQ ID NO :50)；或者(ν) H-X1-R-KSEQ ID NO :20)；或者其中X1是L-Phe或D-Phe,并且X4是Μ、V或Nle。
7.根据权利要求4所述的双功能激素，其中所述第一结构域包含(i)H-f-R-ff-G-K-P-V(SEQID NO :51)；(ii)H-f-R-ff-G-K-P-M(SEQID NO :52)；(iii)H-f-R-ff-G-K-P-Nle(SEQID NO :53)；(iv)H-f-R-ff-G-K-P(SEQID NO :54)； (ν)M-E-H-F-R-W-G(SEQ ID NO :11)；(vi)H-f-R-ff-G(SEQ ID NO :55)；(vii)E-H-F-R-W(SEQID NO :56)； (ix) E-H-f-R-ff-G (SEQ ID NO :57)；或 (iv)H-f-R-ff(SEQ ID NO :6)；其中f是D-苯丙氨酸。
8.根据权利要求5所述的双功能激素，其中所述第一结构域由下列组成(i)H-f-R-ff-G-K-P-V(SEQID NO :51)；(ii)H-f-R-ff-G-K-P-M(SEQIDNO :52)；(iii)H-f-R-ff-G-K-P-Nle(SEQID NO :53)；(iv)H-f-R-ff-G-K-P(SEQID NO :54)； (ν)M-E-H-F-R-W-G(SEQ ID NO :11)；(vi)H-f-R-ff-G(SEQID NO :55)；(vii)E-H-F-R-W(SEQID NO :56)； (ix) E-H-f-R-ff-G (SEQ ID NO :57)；或 (iv)H-f-R-ff(SEQ ID NO :6)；其中f是D-苯丙氨酸。
9.根据权利要求1至8中的任何一项所述的双功能激素，其中所述第二结构域包含SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5的至少15个氨基酸的片段，或与所 述片段具有至少75%同源性的所述片段的变体。
10.根据权利要求1至8中的任何一项所述的双功能激素，其中所述利尿钠肽的变体 包含与SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5的氨基酸序列具有至少 75%的同源性的氨基酸序列。
11.根据权利要求1至10中的任何一项所述的双功能激素，其中所述第二结构域包含 式II (SEQ ID NO 58)的氨基酸序列X5-X6-X7-F-G-G-R-X8-D-R-I-X9 (II) 其中X5 是 M、Nle、R-R-S-S、S-L-R-R-S-S 或者不存在； X6是C;X7是H或者不存在； X8 是 M 或 Nle ；X9 是 S-C-Y-R 或 G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y ；其中 X6的C残基与X9的C残基形成二硫桥；并且 当X5是Nle时，所述第一结构域在所述第二结构域的N端。
12.根据权利要求11所述的双功能激素，其中所述第二结构域包含(i)M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置2和13的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 22)；(ii)Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置2 和 13 的 C 残基形成二硫 桥(SEQ ID NO 23)；(iii)C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置1 和 17 的 C 残 基形成二硫桥(SEQ ID NO 24)；(iv)C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置1 和 17 的 C 残基形成二硫桥(SEQ ID NO 25)；(v)R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 5 和 21 的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 26)；(vi)S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 7 和 23的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 59)；或者(vi i)M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 2 和 18 的 C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 60)。
13.根据权利要求12所述的双功能激素，其中所述第二结构域由下列组成(i)M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置2和13的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 22)；(ii)Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置2 和 13 的 C 残基形成二硫 桥(SEQ ID NO 23)；(iii)C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置1 和 17 的 C 残 基形成二硫桥(SEQ ID NO 24)；(iv)C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置1 和 17 的 C 残基形成二硫桥(SEQ ID NO 25)；(v)R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 5 和 21 的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 26)；(vii)S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 7 和 23的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 59)；或者(viii)M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置2 和 18 的 C残基形成二硫桥(SEQ ID N0:60)。
14.根据权利要求1至13中的任何一项所述的双功能激素，其中所述第一结构域在所 述第二结构域的N端。
15.根据权利要求1至14中的任何一项所述的双功能激素，其中所述双功能激素的氨 基末端残基被C2-C16酰基基团酰基化。
16.根据权利要求15所述的双功能激素，其中所述双功能激素的氨基末端残基被乙酰化。
17.根据权利要求1至16中的任何一项所述的双功能激素，其中所述双功能激素的羧 基末端残基被酰胺化。
18.根据权利要求1至17中的任何一项所述的双功能激素，其中所述第一结构域和第 二结构域通过肽键共价连接。
19.根据权利要求1至18中的任何一项所述的双功能激素，其中所述双功能激素包含(i)H-f-R-W-G-K-P-M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-1-S-C-Y-R，其中位于位置 9 和 20 的 C 残基 形成二硫桥(SEQ ID NO 61)；(ii)H-f-R-W-G-K-P-M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于 位置9和25的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 62)；(iii)H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-1-S-C-Y-R，其中位于位置 9 和 20 的 C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 63)；(iv)H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中 位于位置9和25的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 64)；(v)M-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,其中 位于位置12和28的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 65)；(vi)H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位 于位置10和沈的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 66)；(vii)H-f-R-ff-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-1-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,其中位 于位置10和沈的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 67)；或者(viii)E-H-f-R-ff-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,其 中位于位置11和27的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 69)；其中f是D-苯丙氨酸。
20.根据权利要求19所述的双功能激素，其中所述双功能激素由下列组成(i)Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R-NH2，其中位于位置9 和 20 的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 31)；(ii)Ac-H-f-R-ff-G-K-P-M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,其 中位于位置9和25的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 33)；(iii)c-H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R-NH2,其中位于位置 9 和20的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 34)；(iv)Ac-H-f-R-ff-G-K-P-Nle-C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH 2，其中位于位置9和25的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 35)；(v)M-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2， 其中位于位置12和28的C残基形成二硫桥(SEQ IDNO 36)；(vi)Ac-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-1-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2， 其中位于位置10和沈的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 38)；(vii)Ac-H-f-R-ff-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH 2，其中位于位置10和沈的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO 39)；或者(viii)Ac-E-H-f-R-ff-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,其中位于位置11和27的C残基形成二硫桥(SEQ IDNO 42)；其中Ac代表氨基末端乙酰化；NH2代表羧基末端酰胺化；并且f是D-苯丙氨酸。
21.一种组合物，其含有根据权利要求1至20中的任何一项所述的双功能激素和药学 上可接受的载体。
22.根据权利要求1至20中的任何一项所述的双功能激素，其用于在受治疗者中预防 和/或治疗肾病症。
23.根据权利要求1至20中的任何一项所述的双功能激素，其用于在受治疗者中预防 和/或治疗高血压。
24.一种用于在受治疗者中预防和/或治疗肾病症的药物组合物，其含有根据权利要 求1至20中的任何一项所述的双功能激素和药学上可接受的载体。
25.一种用于在受治疗者中预防和/或治疗高血压的药物组合物，其含有根据权利要 求1至20中的任何一项所述的双功能激素和药学上可接受的载体。
26.一种用于在受治疗者中预防和/或治疗肾病症的方法，其包括向所述受治疗者施 用有效量的下列物质中的至少一种(a)根据权利要求1至20中的任何一项所述的双功能 激素，或者(b)根据权利要求21所述的组合物。
27.根据权利要求沈所述的方法，其中所述肾病症是急性肾损伤。
28.根据权利要求沈所述的方法，其中所述肾病症是手术后肾损伤或功能障碍。
29.根据权利要求观所述的方法，其中所述手术后肾损伤或功能障碍是由瓣膜修复的 心肺旁路手术、主动脉瘤、器官移植、开心手术或冠状动脉移植所引起的。
30.根据权利要求沈至四中的任何一项所述的方法，其中所述施用经由静脉内输注。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述静脉内输注是以约lng/kg/min至约 10 μ g/kg/min 的速率。
32.一种用于在受治疗者中预防和/或治疗高血压的方法，其包括向所述受治疗者施 用有效量的下列物质中的至少一种(a)根据权利要求1至20中的任何一项所述的双功能 激素，或者(b)根据权利要求21所述的组合物。
33.(a)根据权利要求1至20中的任何一项所述的双功能激素，或者(b)根据权利要 求21所述的组合物中的至少一种在用于在受治疗者中预防和/或治疗肾病症的药物的制 备中的用途。
34.(a)根据权利要求1至20中的任何一项所述的双功能激素，或者(b)根据权利要求 21所述的组合物中的至少一种用于在受治疗者中预防和/或治疗肾病症的用途。
35.(a)根据权利要求1至20中的任何一项所述的双功能激素，或者(b)根据权利要求 21所述的组合物中的至少一种用于在受治疗者中预防和/或治疗高血压的用途。
36.(a)根据权利要求1至20中的任何一项所述的双功能激素，或者(b)根据权利要 求21所述的组合物中的至少一种在用于在受治疗者中预防和/或治疗高血压的药物的制 备中的用途。
37.根据权利要求33或34所述的用途，其中所述肾病症是急性肾损伤。
38.根据权利要求33或34所述的用途，其中所述肾病症是手术后肾损伤或功能障碍。
39.根据权利要求38所述的用途，其中所述手术后肾损伤或功能障碍是由瓣膜修复的 心肺旁路手术、主动脉瘤、器官移植、开心手术或冠状动脉移植所引起的。
40.根据权利要求33至39中的任何一项所述的用途，其中所述双功能激素或组合物适 合于通过静脉内输注施用。
41.根据权利要求40所述的用途，其中所述双功能激素或组合物适合于通过静脉内输 注以约lng/kg/min至约10 μ g/kg/min的速率施用。
42.(a)根据权利要求1至20中的任何一项所述的双功能激素，或者(b)根据权利要求 21所述的组合物中的至少一种在药物的制备中的用途。
全文摘要
本发明描述了显示α-MSH活性和利尿钠肽活性的双功能激素。双功能激素包含例如与具有利尿钠肽相关激素活性的第二结构域共价连接的具有α-MSH相关激素活性的第一结构域。本发明的双功能激素被用于例如肾相关疾病或病况诸如急性肾衰竭(ARF)或急性肾损伤(AKI)的预防和/或治疗。
文档编号A61P13/12GK102066421SQ200880022924
公开日2011年5月18日 申请日期2008年7月4日 优先权日2007年7月6日
发明者克里希纳·佩里, 阿卜德尔卡里姆·哈比 申请人:瑟瑞技术公司