促甲状腺激素组合物的制作方法

促甲状腺激素组合物的制作方法
【专利摘要】本文中描述了促甲状腺激素（TSH)的组合物，其中至少一种聚亚烷基二醇聚合物附接于TSH的糖位点。还描述了突变的促甲状腺激素(TSH)和至少一种聚亚烷基二醇聚合物的组合物，其中所述突变TSH包括其中一个或多个氨基酸残基已被半胱氨酸残基取代的TSH，且所述聚亚烷基二醇聚合物在取代的半胱氨酸残基的位点处附接于突变TSH。还描述了包含这些TSH组合物的药物组合物和在有此需要的患者中治疗甲状腺病况的方法，其通过对患者施用有效量的药物组合物。
【专利说明】促甲状腺激素组合物
[0001] 发明背景
[0002] 甲状腺癌是其中源自甲状腺的细胞有不受控生长的疾病的集合。甲状腺癌通常已 被归为分化的甲状腺癌，包括乳突（papillary)、卵泡（follicular)和Hurthle细胞癌，和 其他甲状腺癌，包括髓样癌和退行发育性癌（anaplastic cancer)。一些分化的甲状腺癌随 时间变得不那么高度分化，且可以归类为去分化性或较差分化性癌症。对患者施用促甲状 腺激素（TSH)能在包括甲状腺肿和甲状腺癌在内的多种甲状腺疾病的诊断或治疗办法中 起作用。对于这些疾病，施用的TSH的药动学概貌对于诊断或治疗规程的最佳成功可能是 重要的。
[0003] 重组人 TSH (rhTSH)，作为'Π 丨 YR(..KjΠΝ Μ足甲状腺激素 （Genzyme Corp.，NDA 2-898)上市销售，以在连续日的多次注射给药，继之以RAI给药，并在第3天和第5天抽血 用于肿瘤诊断。这一严格的给药方案通过相对较短的TSH的持续作用时间成为必要，其还 导致降低的功效和副作用。具有延长的作用时间的TSH组合物将很可能改进多种甲状腺疾 病的治疗和检测并减少副作用。
[0004] 如此，存在对改善的含TSH组合物的需要，其优化TSH释放的药动学并减少多次注 射的需要。
[0005] 发明概述
[0006] 本发明涉及与（一种或多种）聚亚烷基二醇聚合物如聚乙二醇（PEG)缀合的促甲 状腺激素（TSH)的组合物，其延长体内TSH作用时间。另外，本发明涉及突变的TSH的组合 物，其中所述TSH已经突变以引入可与聚亚烷基二醇聚合物缀合的另外位点。本文中描述 的本发明TSH组合物可用于制备药物组合物且可用于治疗患有甲状腺病况的有此需要的 患者。
[0007] 依照一个实施方案，本发明涉及包含TSH的组合物，其中至少一种聚亚烷基二醇 聚合物附接于TSH的糖位点。在某些方面，组合物的TSH自哺乳动物例如人分离，或者TSH 是重组的哺乳动物TSH，例如重组的人TSH(rhTSH)。
[0008] 在某些实施方案中，TSH的糖位点是氨基酸上的唾液酸，所述氨基酸例如天冬酰胺 残基rhTSHa亚基的ASN52、rhTSHa亚基的ASN78、或rhTSHP亚基的ASN23、及其组合。
[0009] 在其他实施方案中，TSH上的糖位点是氨基酸例如天冬酰胺上的半乳糖。在具 体的实施方案中，所述半乳糖基团位于TSH上的位点，例如rhTSHa亚基的氨基酸ASN52、 rhTSHa亚基的氨基酸ASN78、rhTSH0亚基的氨基酸ASN23、及其组合处。
[0010] 在本发明的相关方面，本发明的组合物相比于对照展现增强的T4应答。
[0011] 在本发明的其他相关方面，附接于TSH的糖位点的聚亚烷基二醇聚合物是聚乙二 醇（PEG)。在具体的实施方案中，PEG具有约3, 000至约100, 000道尔顿的平均分子量。在 其他实施方案中，一个或超过一个线性或分支的PEG分子附接于TSH。
[0012] 在本发明的又一个相关的实施方案中，描述了包含突变的促甲状腺激素（TSH)和 至少一种聚亚烷基二醇聚合物的组合物，其中所述突变的TSH包括其中一个或多个氨基酸 残基已被半胱氨酸残基取代的TSH，其中所述聚亚烷基二醇聚合物在所述半胱氨酸残基处 附接于所述突变的TSH，且所述突变的TSH是生物学活性的。
[0013] 在某些实施方案中，所述已被半胱氨酸取代的氨基酸残基位于TSH的α亚基上。 在一个具体的实施方案中，所述已被半胱氨酸取代的氨基酸残基位于选自下组的重组人 TSH 的氨基酸位置处：ASN52、ASN78、MET71、ASN66、THR69、和 GLY22、及其组合。
[0014] 仍在其他实施方案中，所述已被半胱氨酸取代的氨基酸残基位于TSH的β亚基 上。在一个具体的实施方案中，所述已被半胱氨酸取代的氨基酸残基位于选自下组的重组 人TSH的氨基酸位置处：43吧3、￥41^118、1'冊21、61^63、和43?56、及其组合。在某些方面，具 有半胱氨酸修饰的突变TSH附接有作为聚亚烷基二醇聚合物的聚乙二醇（PEG)。在具体的 实施方案中，PEG具有约3, 000至约100, 000道尔顿的平均分子量。在其他实施方案中，一 个或超过一个线性或分支或组合的PEG分子附接于TSH。
[0015] 依照本发明的其他实施方案，描述了包含治疗有效量的本发明组合物连同药学可 接受载体的药物组合物。
[0016] 这些药物组合物用于治疗有此需要的患者中的甲状腺病况的方法，其通过对该患 者施用有效量的本发明的药物组合物。在具体的实施方案中，所述甲状腺病况是甲状腺癌。 在其他实施方案中，所述组合物经由肌内注射递送。
[0017] 本发明还涉及产生PEG化、生物学活性的促甲状腺激素（TSH)的方法，包括将至少 一种聚亚烷基二醇聚合物附接于TSH的糖位点。
[0018] 在另一个相关方面，本发明涉及一种产生PEG化、生物学活性的突变的促甲状腺 激素（TSH)的方法，包括a)将一个或多个另外的半胱氨酸残基引入TSH的氨基酸序列，由 此产生突变的TSH;b)将一个或多个聚亚烷基二醇聚合物附接于在步骤a)中引入的一个或 多个半胱氨酸残基，由此产生PEG化、生物学活性的突变的TSH。在具体的实施方案中，所述 半胱氨酸残基代替TSH中的内源性氨基酸残基。
[0019] 本发明还涉及一种治疗有此需要的受试者中的甲状腺病况的方法，包括施用有效 量的PEG化、生物学活性的促甲状腺激素（TSH)。
[0020] 附图简述
[0021] 前述内容从本发明的示例实施方案的以下更具体描述将是明显的，如伴随附图中 例示的，其中类似的指代符号遍及不同的示图指相同的部分。附图不一定是按比例尺的，重 点因而放在例示本发明的实施方案上。
[0022] 图1A-图1B是线性（图1A)和二维（图1B)不图，其显不在N端、赖氨酸氨基酸 残基和天然糖位点处具有PEG化靶物的TSH亚基的结构建模。
[0023] 图2A-图2D是赖氨酸和N端PEG化反应。具有不同PEG:蛋白质比率的赖氨酸 PEG化的PEG化反应混合物的SDS-PAGE分析显示于图2A(考马斯蓝染色）和图2B(PEG染 色）。具有1:1PEG:蛋白质比率的反应混合物用框高亮，其进一步在SEC-HPLC上分析（图 2C)。图2D是2:1PEG:蛋白质比率的N端PEG化反应的SEC-HPLC概貌（profile)。
[0024] 图3是显示3种不同的糖PEG化途径的示图。
[0025] 图4是显示选定突变体的β -碳位置的结构模型。
[0026] 图5是银染色的非还原性SDS-PAGE，其评估突变体的表达水平和寡聚化。
[0027] 图6是显示3种半胱氨酸定点突变体的PEG化的凝胶。
[0028] 图7是突变体TSH的几种PEG化反应的SEC-HPLC概貌的一系列层析图。
[0029] 图8A-图8B是a G22C TSH PEG化条件的优化。
[0030] 图9A-图9B是对G22C TSH的亚基-和位点-特异性缀合的确认。
[0031] 图10A-图10D是糖PEG化反应混合物和纯化的糖PEG化rhTSH缀合物的SDS-PAGE 分析。具有不同的（PEG:蛋白质）摩尔比的GAM(+)和GAM(-)反应混合物分别显示于图 10A和图10B。纯化的糖PEG化rhTSH缀合物显示于图10C(PEG染色）和图10D (考马斯蓝 染色）。
[0032] 图11A-图11B是40kD SAM反应混合物（图11A)和纯化的糖PEG化rhTSH缀合 物（图11B)的SEC-HPLC概貌。
[0033] 图12是纯化的MonoPEG化40kD SAM缀合物的胰蛋白酶肽图谱，和收集的PEG化 胰蛋白酶片段的N端测序结果，如实施例10中解释的。
[0034] 图13A-图13C是在纯化的糖PEG化rhTSH缀合物的每个亚基上的PEG化相对量 的测定，如实施例11中解释的。
[0035] 图14A-图14C是显示具有不同大小PEG的PEG化SAM、GAM(+)、GAM(-)的受体结 合测定的结果的图。
[0036] 图15是多种PEG化TSH的药效学数据的图，其显示相对于rhTSH对照、随时间对 T4水平（pg/dL)的影响，如实施例13中解释的。
[0037] 图16是显示与对照相比，多种PEG化TSH在血清中随时间的浓度的图，如实施例 13中解释的。
[0038] 图17是显示与对照相比，多种PEG化TSH在血清中随时间的浓度的图，如实施例 14中解释的。
[0039] 图18A-图18D是显示与对照相比，对于多种PEG化TSH在血清中随时间的T4浓 度的图，如实施例16中解释的。
[0040] 图19A-图19C是显示与对照相比，对于不同剂量的40kD SAM在血清中随时间的 T4浓度的图，如实施例17中解释的。
[0041] 图20A-图20B是显示与对照相比，对于多种PEG化TSH在血清中随时间的T4浓 度的图，如实施例18中解释的。
[0042] 图21A-图21F是显示与对照相比，对于多种PEG化TSH在血清中随时间的T4浓 度的图，如实施例19中解释的。
[0043] 图22是显示与对照相比，对于多种PEG化TSH在血清中随时间的T4浓度的图，如 实施例19中解释的。
[0044] 图23是对于10kD MultiSAM和40kD SAM在血清中随时间的T4浓度的图，如实施 例20中解释的。
[0045] 图24是显示与对照相比，对于40kD SAM和40kD G22C在血清中随时间的T4浓度 的图，如实施例21中解释的。
[0046] 发明详述
[0047] ΤΠΥ--Ο(?Γ:Ν' 促甲状腺激素 （Genzyme Corp.，NDA 2-898)是重组人 TSH(rhTSH)，目前在市场上销售用于诊断和/或治疗甲状腺癌。它作为冻干的粉末销售，用 于在肌内施用前用水重建。
[0048] 这类现有的TSH制剂具有严格的给药方案，需要多次注射，具有有限的药动学概 貌并产生副作用如恶心。本发明的TSH组合物和突变的TSH组合物解决了这些缺点。本文 中描述了更长作用的促甲状腺激素（TSH)组合物，其降低注射频率、提供灵活的施用方案、 改进治疗指标且具有更好的刺激甲状腺组织的功效。另外，其他效力参数受到本发明的更 长作用的TSH组合物的正向影响，包括延长的TSH半衰期和增加的T4释放持续时间。
[0049] 如本文中显示的，将聚亚烷基二醇聚合物例如聚乙二醇缀合于TSH有益地改变 TSH的药动学概貌和药效学概貌。如下文中更详细描述的，研究了 TSH的N端PEG化、赖氨 酸PEG化和糖聚合物附接。预期TSH的N端PEG化将产生具有延长的作用时间的TSH，而 TSH的赖氨酸PEG化和糖PEG化将导致TSH效力的严重降低。本文中描述的研究结果显示， TSH的糖PEG化对于TSH的效力具有正向效果，而TSH的N端PEG化和赖氨酸PEG化均极大 地降低了 TSH的效力。
[0050] 因此，在一个方面，本发明针对包含促甲状腺激素（TSH)的组合物，其中至少一种 聚亚烷基二醇聚合物附接于TSH的糖位点。本文中还显示经突变以引入靶向PEG化的半胱 氨酸残基的TSH的位点特异性PEG化对TSH的效力产生正向效果。如此，在另一个方面，本 发明针对包含突变的促甲状腺激素（TSH)和至少一种聚亚烷基二醇聚合物的组合物，其中 所述突变的TSH包括其中一个或多个氨基酸残基已被半胱氨酸残基取代的TSH，其中所述 聚亚烷基二醇聚合物在所述半胱氨酸残基处附接于所述突变的TSH，且所述突变的TSH是 生物学活性的。本文中提供的PEG化TSH组合物相对于未缀合于聚乙二醇聚合物的具有一 个或多个以下改进的治疗治标效果：增强的溶解性、降低的蛋白水解、降低的免疫原性、降 低的肾清除速率、延长的血液循环寿命、增加的作用持续时间、和改变的分布和吸收。
[0051] TSH是具有两个亚基α和β亚基的糖蛋白。a (alpha)亚基（即绒毛膜促性腺 激素 α)等同于人绒毛膜促性腺激素、黄体生成素和促卵泡激素（FSH)的。β (beta)亚基 是TSH独有的，且决定其功能。
[0052] rhTSH指重组合成的TSH。本文中描述的重组DNA方法一般是那些列于Sambrook 等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold String Harbor Laboratory Press, 1989,和 / 或 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等编，Green Publishers Inc.，和 Wiley and Sons 1994,有附录（supplement))的。术语"重组"指合 成或者另外体外操作的多核苷酸（例如"重组的多核苷酸"），和使用重组多核苷酸来在细 胞或其他生物系统中产生基因产物的方法，以及由重组多核苷酸编码的多肽（"重组蛋白 质"）。
[0053] 所述方法中使用的TSH和本文中描述的组合物可自天然存在的哺乳动物来源如 牛、猪、灵长类或人分离，或从非天然存在的来源以重组形式分离，其使用本领域中已知的 方法，如记载于美国专利No. 5, 840, 566和6, 365, 127的。
[0054] 已知大分子到聚合物（例如多糖、唾液酸聚合物、羟乙基淀粉和聚亚烷基二醇（例 如聚丙二醇、聚丁二醇、聚乙二醇）和其他类似模块）的缀合可用于有效改变药物的体内功 效，即，改变其药效学和药动学特性之间的平衡。然而，这类缀合经常导致药物结合亲和力 的丧失，且在效果上导致效力的丧失。在有限的情况中，效力的降低由经聚合物修饰的药物 的更长的循环半衰期弥补，使得所得药动学（PK)和药效学（PD)概貌可用于治疗。
[0055] 尽管聚乙二醇（PEG)到特定大分子的缀合（称为PEG化）保留大部分活性，但PEG 化的激素和细胞因子（其活性一般需要与细胞表面受体的较高亲和力相互作用）显示活性 中的显著降低。激素的PEG化经常不利地影响该激素的ro概貌和PK概貌。
[0056] 聚乙二醇（PEG)是一种非抗原性惰性聚合物，已显示其延长蛋白质在体内循环的 时间长度。典型地，这些常见的PEG试剂一般在赖氨酸残基和/或N端氨基酸处附接于蛋 白质上的伯胺和仲胺。有商品化的不同大小的PEG，且一旦附接，可通过利用大小变化和对 单药分子的多种附接定制用于个体指征。已显示PEG改进注射的PEG化蛋白质的血浆半衰 期，但如上文陈述的，效力可能由于PEG的空间阻碍而受损（Fishburn, C. S.，J Pharm Sci 97:4167(2008))。为了避免效力问题并生成期望的Η)和PK概貌，对要PEG化的靶蛋白的 结构-功能关系的详细了解有助于生成保留最大功能活性的PEG化产物。
[0057] 最近，在确定生长激素超家族成员的结构中取得了进展，这导致潜在的治疗学。理 解这些蛋白质如何与其靶物相互作用，与结构信息结合，通过使用结构信息来设计用于将 该蛋白质在其相应靶物上的治疗益处最大化的聚合物缀合物已生成了有效的药物。遗憾的 是，没有TSH与其受体的复合物结构的结构信息；然而，已解析了与FSH受体（FSHR)复合的 相关蛋白质促卵泡激素（FSH)的晶体结构（Fan和Hendrickson, Nature 433:269(2004))。 TSH与FSH具有高度同源性，其共享相同的α亚基和相似的β亚基。同样地，TSH受体和 FSH受体是高度同源的。如此，FSH-FSH受体复合物可充当TSH与其受体相互作用的初始模 型。
[0058] 如本文中显示的，当将TSH序列叠加到FSH-FSHR复合物（PDB索引1XWD)的3D结 构模型上时，N端似乎离受体相互作用区最远，如此很可能是在PEG化时最小化受体结合的 损失的PEG附接理想位点（见图1B)。由于在TSH中有许多赖氨酸，且其中一些接近受体结 合位点，因此将与其PEG在赖氨酸处的附接会干扰受体结合。
[0059] TSH是一种糖基化蛋白质。糖链构成其重量的15-25 %且包括3条天冬酰胺连接 的糖链。这些链中的2条可见于TSH的α亚基，分别连接于天冬酰胺52 (ASN 52)和天冬 酰胺78 (ASN 78)，而第3条在TSH的β亚基上，连接于天冬酰胺23 (ASN 23)。天冬酰胺连 接的糖链是潜在的PEG缀合位点，然而，在TSH蛋白上其与受体相互作用区特别是ASN 52 的相应的接近，表明在这类位点处的PEG缀合将很可能对于受体结合具有负面影响。如此， 选择潜在位点用于聚合物对TSH的缀合呈现了很大的不确定性。
[0060] 此外，长时间以来已知TSH的去糖基化导致在受体结合时有效信号转导的损 失（Szkudlinski等，Physiol Rev. 82:473 (2002))。尽管从TSH的糖除去末端唾液酸 改进了体外活性，但在体内观察到极大降低的循环时间，推测是由于通过肝唾液酸糖蛋 白受体的清除。Thotakura, N. R.，Szkudlinski, M. W.和 Weintraub, B. D.，Glycobiology 4,525-533(1994)。去除个体糖位点还增强了体外功能活性，尤其是对于α链氨基酸位置 52,这再次表明糖可能足够接近受体以达到唾液酸的负电荷与受体上的负电荷之间的静电 排斥。总之，对TSH的该结构功能分析指示为了最小化对功能效力的影响，Ν端PEG化是远 比糖PEG化更优选的。如本文中描述的，研究了 N端PEG化、赖氨酸PEG化和糖聚合物附接。
[0061] 因此，产生缀合聚合物的TSH的糖聚合物方法学是本发明的一个方面。在一个实 施方案中，所述聚合物是聚亚烷基二醇。如本文中使用的，"聚亚烷基二醇（PAG)"包括聚乙 二醇（PEG)、聚丙二醇（PPG)、聚丁二醇等。聚合物可以是线性或分支的。PAG共价附接于 分子。如本语境中使用的，术语"附接"或"附接的"指TSH蛋白的位点或模块与聚合物如 聚亚烷基二醇的偶联或缀合，例如直接共价地彼此连接的，或者经由介入模块间接共价彼 此连接的，所述介入模块如桥、间隔物、或连接模块。附接或缀合于TSH的聚合物不同于与 TSH混合、掺混（commingle)或一起在溶液中的聚合物。
[0062] "糖位点"指见于TSH上的糖侧链。所述位点可以是天然糖基化的位点，或者是酶 法提供的位点。在某些实施方案中，特定地选择糖位点以满足实现TSH与受体最佳相互作 用的期望标准或其他功能要求，如蛋白质的折叠或移动性。所述糖位点可用于附接聚合物 模块如PEG。蛋白质上的典型糖位点是天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸。TSH具有3条天冬酰胺 连接的糖链。
[0063] 在某些实施方案中，将单一聚合物附接于TSH。在其他实施方案中，将多个聚合物 附接于TSH。所述多个附接的聚合物可以是一个种类或者多个种类的。例如，在其中单个 PEG分子附接于蛋白质的情况中，该蛋白质被称为"MonoPEG化的"，而在其中超过一个PEG 分子附接于蛋白质的情况中，该蛋白质被称为"MultiPEG化的"。当蛋白质是MultiPEG化 时，附接于蛋白质（相对于其他附接的PEG)的个体PEG可具有相同或不同的分子量，而且 可为线性或分支结构的。PEG分子的分子量范围是3, 000-100, 000道尔顿。在某些实施方 案中，附接的PEG的分子量是5kD、10kD、20kD、30kD、40kD或60kD或其组合。
[0064] 本文中提供用于TSH的糖PEG化的3种备选方案：⑴唾液酸介导的PEG化（称 为〃SAM〃），（ii)半乳糖介导的PEG化（称为〃GAM(-)〃），和（iii)唾液酸消除与半乳糖介 导的PEG化偶联（称为〃GAM(+)〃）。简言之，如图3中显示的，在唾液酸介导的SAM PEG化 中，将唾液酸氧化，接着化学附接PEG。在GAM(-) PEG化中，将半乳糖模块氧化，接着化学附 接PEG。而在GAM(+)中，将唾液酸模块酶法消除，然后氧化暴露的半乳糖模块，接着化学附 接 PEG。
[0065] 本发明中还包括对TSH的PEG化的位点特异性方法。一种这类方法使用半胱氨酸 反应性PEG将PEG附接于半胱氨酸残基。许多具有不同反应基团（例如马来酰亚胺、乙烯 基砜）和不同大小PEG(2-40kDa)的高度特异性的、半胱氨酸反应性PEG是商品化的。在中 性pH，这些PEG试剂选择性地附接于"游离"的半胱氨酸残基，即不牵涉靶蛋白中的二硫键 的半胱氨酸残基。或者，可将牵涉天然二硫键的两个半胱氨酸之一除去或用另一氨基酸取 代，留下天然的半胱氨酸（蛋白质中的正常将与除去或被取代的半胱氨酸残基形成二硫键 的半胱氨酸残基）游离且可用于化学修饰。优选地，取代半胱氨酸的氨基酸将是中性氨基 酸如丝氨酸或丙氨酸。
[0066] 经过试用重组DNA技术的体外诱变，可在蛋白质上的任何可用位置引入另外的半 胱氨酸残基。然后，新添加的"游离"半胱氨酸可充当使用半胱氨酸反应性PEG特异性附接 PEG分子的位点。添加的半胱氨酸残基是蛋白质中已有氨基酸的取代物。半胱氨酸残基可 添加到蛋白质的氨基端之前、蛋白质的羧基端之后、或插入蛋白质中的两个氨基酸之间。术 语"突变体TSH"，用于本文指其中野生型TSH的一个或多个氨基酸已被允许在TSH分子上 形成一个或多个糖基化位点的另一氨基酸取代的TSH。因此，TSH的氨基酸取代使得能进行 至少一种聚合物如聚亚烷基二醇的位点特异性偶联。例如，PEG分子对突变体TSH的位点 特异性偶联允许生成一种TSH，其拥有聚乙烯-糖基化TSH的药效学和药动学益处。
[0067] 在具体的实施方案中，使用半胱氨酸的氨基酸取代可在对于表1和2中突变体显 示的位置。
[0068] 在一个优选的实施方案中，取代不实质上改变天然TSH的结构属性。在某些实施 方案中，已被半胱氨酸取代的氨基酸残基位于TSH的α亚基或β亚基上。在具体的实施 方案中，已被半胱氨酸取代的氨基酸残基位于选自下组的重组人TSHa亚基的氨基酸位 置处：ASN52、ASN78、MET71、ASN66、THR69、和GLY22、及其组合，或位于选自下组的重组人 TSH0亚基的氨基酸位置处45吧3、￥41^118、1'冊21、61^63、和45?56、及其组合。
[0069] 本文中描述的TSH组合物是生物学活性的。"生物学活性"意指本发明的TSH组 合物具有一种或多种的以下效果：更长的作用持续时间、延长的半衰期、增加的T4释放 持续时间、更高的AUEC、Tmax的正向迁移、和更低的峰-到-槽暴露（peak-to-trough exposure)，其可减少副作用。在某些实施方案中，将组合物与对照比较且效果是基本上相 似的，稍微更小或稍微更大或实质性更大。可使用本领域技术人员已知的多种技术来评估 依照本发明产生的TSH组合物的生物学活性。
[0070] 在评估本发明TSH组合物的生物学活性时，可将生物学活性与对照比较。如本领 域技术人员理解的，可使用多种适宜对照。在一个实施方案中，如本文中使用的"对照"指 天然（野生型）TSH或rhTSH。
[0071] 本发明的组合物在对有此需要的患者（例如有近乎全部或全部甲状腺切除的甲 状腺癌患者）施用时将提供已定制用于指定用途的TSH血清浓度。在某个实施方案中，本 文中描述的组合物的作用持续时间比rhTSH增加为至少2倍。在另一个实施方案中，TSH组 合物的作用持续时间比rhTSH增加为至少3倍。具有增加的作用持续时间的这类实施方案 有效地减少了施用频率，同时维持与目前的rhTSH制剂可比的功效。
[0072] 在一个实施方案中，所述组合物提供相比于rhTSH更长的半衰期（tl/2)。在具体 的实施方案中，所述tl/2在大鼠中为rhTSH的多至23倍长。
[0073] 在另一个实施方案中，显示T4水平比rhTSH具有更大的持续效果。在大鼠中， rhTSH组中的T4水平在给药后48小时时回到媒介物水平，而在一个实施方案中，T4维持到 给药后168小时时。
[0074] 如本文中使用的"有效Tmax"指"峰高浓度时间"，其为所述的组合物特征性的。如 本文中使用的"有效Cmax"指"峰高浓度"，其为所述的组合物特征性的。在许多情况下，有 效的Tmax和Cmax提供其中药物浓度在治疗范围内的血液（或血清或血浆）浓度时间曲线。 "tl/2"指药物的作用持续时间已知且药物在体内的浓度或量降低一半所需的时间。
[0075] 人TSHa亚基的核酸序列为：
[0076] gctcctgatgtgcaggattgcccagaatgcacgctacaggaaaacccattcttctcccagccgggtgcc cca
[0077] atacttcagtgcatgggctgctgcttctctagagcatatcccactccactaaggtccaagaagacgatg ttggt
[0078] ccaaaagaacgtcacctcagagtccacttgctgtgtagctaaatcatataacagggtcacagtaatggg gg
[0079] gtttcaaagtggagaaccacacggcgtgccactgcagtacttgttattatcacaaatct(SEQ. ID N0:1)
[0080] 人TSH α亚基的氨基酸序列为：
[0081] APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVT VMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS
[0082] (SEQ ID NO :2)
[0083] 人TSH0亚基的核酸序列为：
[0084] ttttgtattccaactgagtatacaatgcacatcgaaaggagagagtgtgcttattgcctaaccatcaac accac
[0085] catctgtgctggatattgtatgacacgggatatcaatggcaaactgtttcttcccaaatatgctctgtc ccaggat
[0086] gtttgcacatatagagacttcatctacaggactgtagaaataccaggatgcccactccatgttgctccc ?Β----?
[0087] cctatcctgttgctttaagctgtaagtgtggcaagtgcaatactgactatagtgactgcatacatgaag ccatca
[0088] agacaaactactgtaccaaacctcagaagtcttatctggtaggattttctgtc(SEQ ID NO :3)
[0089] 人TSHi3亚基的氨基酸序列为：
[0090] FCIPTEYTMHIERRECAYCLTINTTICAGYCMTRDINGKLFLPKYALSQDVCTYRDFIYRTVEIPGCPL HVAPYFSYPVALSCKCGKCNTDYSDCIHEAIKTNYCTKPQKSYLVGFSV(SEQ ID NO :4)
[0091] 如本文中使用的，术语"对应于TSH亚基的氨基酸残基的氨基酸残基"在比对序列 时意图指示对应于野生型TSH亚基序列（SEQ ID N0:2和4)的氨基酸残基。使用适宜的用于 序列比对的计算机程序，如例如ClustalW程序，版本1. 8, 1999 (Thompson等，1994, Nucleic Acid Research, 22:4673-4680)，从比对的序列方便地确定氨基酸序列同源性/同一性。 实施例
[0092] 实施例1. rhTSH的唾液酸介导的（SAM) PEG化
[0093] 高碘酸钠氧化：将lOOmM乙酸钠 ，pH 5. 6中的25mM高碘酸钠（Sigma, 311448)添加 至lj lOOmM乙酸钠 ，pH 5. 6中的4. 5mg/ml TSH中至终浓度范围为0. 2mM至2mM，于包裹在铝 箔中的玻璃管形瓶中。将混合物在冰上在黑暗中温和地摇动30分钟。30分钟后，将50% 甘油添加至3%的反应体积，然后摇动15分钟。然后将混合物缓冲液交换为100mM乙酸钠， pH 5. 6,并浓缩为至少4. 3mg/ml的TSH浓度以实施PEG化。
[0094] PEG化：将适宜大小的氨氧基PEG(dH20中100mg/ml)添加到氧化的TSH至不同的 (PEG:蛋白质）摩尔比。将反应体积用lOOmM乙酸钠 ，pH 5. 6调整至最终TSH浓度为4mg/ ml。然后将混合物在25°C温育16小时，或在8°C温育16小时，伴随温和摇动。温育后，添 加50摩尔过量的0. 05M羟胺以淬灭反应混合物并在25°C温育6小时，伴随温和摇动。
[0095] 实施例2.去唾液酸化rhTSH的半乳糖介导的（GAM⑴）PEG化
[0096] 神经氨酸酶处理：添加20mU神经氨酸酶（His6-梭菌属神经氨酸酶（520mU/ul)) 每mg TSH并在37°C温育6小时。
[0097] 过氧化氢酶/半乳糖氧化酶处理：将2U过氧化氢酶（Sigma 442U/ μ I )每mgTSH 添加到神经氨酸酶处理的TSH。将4μ g半乳糖氧化酶（Worthington GAO, 1. 2mg/ml)每 mg TSH添加到该混合物，然后在37°C温育16小时。温育后，将混合物缓冲液交换并浓缩到 100mM乙酸钠，pH 5. 6中至至少5. 5mg/ml的浓度以实施PEG化。
[0098] PEG化：将适宜大小的氨氧基PEG(dH20中100mg/ml)添加到氧化的和缓冲液交换 的TSH至1:1(PEG:蛋白质）摩尔比。将反应体积用lOOmM乙酸钠，pH 5. 6调整，从而反应 中的最终TSH浓度为5mg/ml。然后将混合物在25°C温育16小时，伴随温和摇动。接着向 反应混合物添加50摩尔过量的0. 05M羟胺（m. w. 69. 49)并在25°C温育6小时，伴随温和摇 动。
[0099] 实施例3. rhTSH的半乳糖介导的（GAM㈠ ）PEG化
[0100] 过氧化氢酶/半乳糖氧化酶处理：将2U过氧化氢酶（Sigma 442U/y I)每mg 和4 μ g半乳糖氧化酶（Worthington GAO, 1. 2mg/ml)每mg添加到TSH。然后将混合物在 37°C温育16小时。温育后，将混合物缓冲液交换并浓缩到100mM乙酸钠 ，pH 5. 6中至至少 5. 5mg/ml的终浓度以实施PEG化。
[0101] PEG化：将适宜大小的氨氧基PEG(dH20中100mg/ml)添加到氧化的和缓冲液交换 的TSH至1:2(PEG:蛋白质）摩尔比。将反应体积用lOOmM乙酸钠 ，pH 5. 6调整，从而反应 中的最终TSH浓度为5mg/ml。然后将混合物在25°C温育16小时，伴随温和摇动。接着向 反应混合物添加50摩尔过量的0. 05M羟胺（m. w. 69. 49)并在25°C温育6小时，伴随温和摇 动。
[0102] 实施例4. rhTSH的N端PEG化
[0103] 将适宜大小的醛PEG(反应缓冲液中100mg/ml)以不同（PEG:蛋白质）比率添加 到终浓度为5mg/ml的rhTSH中，其在lOOmM乙酸钠 ，pH 5或pH 5. 6中，含20mM氰基硼氢化 钠。在25°C达16小时或在8°C达长达2天完成温育，接着用0. 1体积的1M Tris，pH 7. 5 在25°C达3小时来淬灭反应。
[0104] 在N端的PEG化得到比糖缀合失去更多TSH受体结合亲和力的缀合物。使用40kD PEG的N端MonoPEG化相比于rhTSH对照产生体外TSH受体结合亲和力的11. 1倍降低（降 低为 1/11. 1)。
[0105] 实施例5. rhTSH的赖氨酸PEG化
[0106] 将适宜大小的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺）PEG(dH20中50mg/ml)以不同（PEG:蛋白 质）比率（例如（0.5:1)、（1 ;1)、（2:1)、（4:1)、（8:1))添加到PBS(磷酸盐缓冲盐水）缓 冲液，pH 7. 2中终浓度为0. 8mg/ml的rhTSH中。在25°C达1. 5小时完成温育。
[0107] 探索用N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS)PEG的赖氨酸缀合。对于40kDa PEG，在PBS (磷 酸盐缓冲盐水）缓冲液，pH 7. 2中测试不同的（PEG:蛋白质）比率和不同的温育时间。最 终TSH浓度为0. 8mg每ml。在25°C或37°C达1.5小时或19. 5小时完成PEG化。测试的 短温育时间（1. 5小时）显示与长温育时间（19. 5小时）相同的结果。推测起来这是由于 NHS PEG在水溶液中的快速水解。PEG化程度依赖于（PEG:蛋白质）摩尔比，更高的PEG摩 尔过量产生更多MultiPEG化的缀合物。
[0108] 收集MonoPEG化种类的大小排阻层析（SEC)级分并递交用于体外TSH受体结合测 定法。体外TSH受体结合测定法结果显示Mono_40kDa NHS PEG-TSH(赖氨酸PEG化）比对 照TSH(起始材料）具有低31·2倍（l/31·2)的亲和力，而Mono-40kDa氨氧基PEG-TSH(SAM PEG化）具有低5. 3倍（1/5. 3)的亲和力。
[0109] 实施例6.产生半胱氨酸突变体用于位点特异性缀合
[0110] 设计和制备TSH单突变体以引入用于位点特异性PEG化的半胱氨酸。这些突变体 设计为使得其对蛋白质折叠、受体结合的影响最小化并针对其有效缀合的潜力。
[0111] 在基于TSH/TSH受体的结构模型设计引入半胱氨酸突变体的位点时采用以下考 虑：1)突变位点不应位于或临近于受体结合位点；2)突变位点不应位于或临近于α/β亚 基二聚化接口；3)突变位点不应位于或临近于二硫键；4)基于报道的文献，避免在突变时 导致比活性急剧丧失的位点；5)突变位点应溶剂暴露以用于后续PEG化；6)选择将均匀覆 盖与受体结合位点相反的大部分TSH表面的位点以全面评估在每个区域的PEG化可行性。 其中一些考虑汇总在表1中。选择的突变体的β -碳位置在我们的结构模型中暴露于溶剂， 如图4中显示的。这预示这些位置在突变为半胱氨酸时很可能是PEG化试剂可到达的。在 表1中选择的头3个位点是TSH中的天然糖基化位点。
[0112] 表 1
[0113]
【权利要求】
1. 一种包含促甲状腺激素（TSH)的组合物，其中至少一种聚亚烷基二醇聚合物附接于 所述TSH的糖位点。
2. 权利要求1的组合物，其中自哺乳动物分离所述TSH。
3. 权利要求2的组合物，其中所述哺乳动物是人。
4. 权利要求1的组合物，其中所述TSH是重组的哺乳动物TSH。
5. 权利要求4的组合物，其中所述TSH是重组的人TSH(rhTSH)。
6. 权利要求5的组合物，其中所述糖位点是唾液酸。
7. 权利要求6的组合物，其中所述唾液酸基团位于选自下组的TSH上的位点处： rhTSHa亚基的ASN52、rhTSHa亚基的ASN78、和rhTSHP亚基的ASN23、或其组合。
8. 权利要求5的组合物，其中所述糖位点是半乳糖。
9. 权利要求8的组合物，其中所述半乳糖位于rhTSHa亚基的ASN52、rhTSHa亚基的 ASN78、rhTSH0亚基的ASN23、或其组合处。
10. 权利要求1的组合物，其中所述聚亚烷基二醇聚合物是聚乙二醇（PEG)。
11. 权利要求10的组合物，其中所述PEG具有约3, 000至约100, OOOkDa的平均分子 量。
12. 权利要求11的组合物，其中一个PEG附接于所述TSH。
13. 权利要求11的组合物，其中超过一个PEG附接于所述TSH。
14. 权利要求1的组合物，其中所述TSH相比于对照展现延长的T4应答。
15. -种包含突变的促甲状腺激素（TSH)和至少一个聚亚烷基二醇聚合物的组合物， 其中所述突变的TSH包括其中一个或多个氨基酸残基已被半胱氨酸残基取代的TSH，其中 所述聚亚烷基二醇聚合物在所述半胱氨酸残基处附接于所述突变的TSH，且所述突变的 TSH是生物学活性的。
16. 权利要求15的组合物，其中所述已被半胱氨酸取代的氨基酸残基位于TSH的α亚 基上。
17. 权利要求16的组合物，其中所述已被半胱氨酸取代的氨基酸残基位于选自下组的 重组人TSH的氨基酸位置处：ASN52、ASN78、ΜΕΤ71、ASN66、THR69、和GLY22、及其组合。
18. 权利要求15的组合物，其中所述已被半胱氨酸取代的氨基酸残基位于TSH的β亚 基上。
19. 权利要求18的组合物，其中所述已被半胱氨酸取代的氨基酸残基位于选自下组的 重组人TSH的氨基酸位置处：ASN23、VAL118、THR21、GLU63、和ASP56、及其组合。
20. 权利要求15的组合物，其中所述聚亚烷基二醇聚合物是聚乙二醇（PEG)。
21. 权利要求20的组合物，其中所述PEG具有约3, 000至约100, OOOkDa的平均分子 量。
22. 权利要求20的组合物，其中一个PEG附接于所述TSH。
23. 权利要求20的组合物，其中超过一个PEG附接于所述TSH。
24. -种产生PEG化、生物学活性的促甲状腺激素（TSH)的方法，包括将至少一种聚亚 烷基二醇聚合物附接于TSH的糖位点。
25. -种产生PEG化、生物学活性的突变的促甲状腺激素（TSH)的方法，包括a)将一个 或多个另外的半胱氨酸残基引入TSH，由此产生突变的TSH ;b)将一个或多个聚亚烷基二醇 聚合物附接于在步骤a)中引入的一个或多个半胱氨酸残基，由此产生PEG化、生物学活性 的突变的TSH。
26. 权利要求25的方法，其中所述半胱氨酸残基代替TSH中的内源性氨基酸残基。
27. 权利要求25的方法，其中自哺乳动物分离所述TSH。
28. 权利要求27的方法，其中所述哺乳动物是人。
29. 权利要求25的方法，其中所述TSH是重组的哺乳动物TSH。
30. 权利要求29的方法，其中所述TSH是重组的人TSH(rhTSH)。
31. 权利要求25的方法，其中所述聚亚烷基二醇聚合物是聚乙二醇（PEG)。
32. 权利要求31的方法，其中所述PEG具有约3, 000至约100, OOOkDa的平均分子量。
33. 权利要求31的方法，其中一个PEG附接于所述TSH。
34. 权利要求31的方法，其中超过一个PEG附接于所述TSH。
35. 权利要求25的方法，其中所述半胱氨酸位于TSH的α亚基上。
36. 权利要求35的方法，其中所述半胱氨酸位于选自下组的重组人TSH的氨基酸位置 处：ASN52、ASN78、ΜΕΤ71、ASN66、THR69、和 GLY22、及其组合。
37. 权利要求25的方法，其中所述半胱氨酸位于TSH的β亚基上。
38. 权利要求37的方法，其中所述半胱氨酸位于选自下组的重组人TSH的氨基酸位置 处：ASN23、VAL118、THR21、GLU63、和 ASP56、及其组合。
39. -种治疗有此需要的受试者中的甲状腺病况的方法，包括施用有效量的PEG化、生 物学活性的促甲状腺激素（TSH)。
40. 权利要求39的方法，其中自哺乳动物分离所述TSH。
41. 权利要求40的方法，其中所述哺乳动物是人。
42. 权利要求39的方法，其中所述TSH是重组的哺乳动物TSH。
43. 权利要求42的方法，其中所述TSH是重组的人TSH(rhTSH)。
44. 权利要求39的方法，其中所述聚亚烷基二醇聚合物是聚乙二醇（PEG)。
45. 权利要求44的方法，其中所述PEG具有约3, 000至约100, OOOkDa的平均分子量。
46. 权利要求44的方法，其中一个PEG附接于所述TSH。
47. 权利要求44的方法，其中超过一个PEG附接于所述TSH。
49. 一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-23中任一项的组合物和药学可 接受的载体。
50. -种治疗有此需要的患者中的甲状腺病况的方法，包括对所述患者施用有效量的 权利要求49的药物组合物。
51. 权利要求50的方法，其中所述药物组合物相比于对照展现出增强的T4应答。
52. 权利要求50的方法，其中所述甲状腺病况选自下组：甲状腺癌。
53. 权利要求50的方法，其中所述药物组合物经由肌内注射递送。
【文档编号】A61K47/48GK104220097SQ201280069717
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2012年12月4日 优先权日:2011年12月19日
【发明者】C·潘, S·帕克, H·邱 申请人:建新公司