甲状腺激素受体α基因作为山羊生长性状遗传标记及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于山羊的遗传标记制备【技术领域】，具体涉及一种与山羊生长性状的分子标记及其应用。所述的分子标记由山羊TRα基因第六内含子序列克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。在序列表SEQIDNO：1所示序列的第230位碱基处有一个C230-T230的碱基突变，导致NdeI－RFLP多态性。本发明还公开了获得上述分子标记的制备方法和多态性检测方法的应用，为山羊的标记辅助选择提供了新的遗传标记。
【专利说明】甲状腺激素受体CI基因作为山羊生长性状遗传标记及应 用
【技术领域】
[0001] 本发明属于山羊的分子标记制备【技术领域】，主要为山羊基因的克隆和作为 分子标记辅助选择，即利用位于该基因第6内含子中的C230T变异位点来预测山羊不同基 因型个体的生长性状。
【背景技术】
[0002] 传统的家畜育种是根据一些表型性状进行选择，但这些表型性状是由遗传基因和 外界环境共同决定的，因此传统育种在许多优良性状的育种上不能起到决定性作用。另外， 某些性状需要在性成熟或生长后进行测量，需要较长的周期。利用分子遗传学方法，如SNP 标记和微卫星标记等方法可以从本质上改变性状，克服传统育种的不足。分子遗传学方法 能在早期获得数据，有利于缩短遗传间隔；还可以通过基因的突变进行直接选择，提高选择 的准确性。分子标记辅助选择前提是要找到对性状有较大遗传贡献率的主效基因或标记， 通过对这些主效基因和标记的检测和选择决定育种方向。目前已发现许多这类与生产性状 密切相关的主效基因和分子标记，将此类标记与传统育种结合可增进家畜育种进程。
[0003] 甲状腺激素TH (Thyroid Hormone)由甲状腺分泌，有着广泛的生物学作用，能调 节生物体的生长、发育、代谢（Yen 2001)。该激素有两种形式：四碘甲腺原氨酸（T4)以及 三碘甲腺原氨酸（T3)。血液中 T4 占 98%，T3 占 2% (St Germain, Galton et al. 2009)， 但T3的生物活性约是T4的5倍，因此主要是T3发挥激素的作用（Therien and Blostein 2000)。甲状腺素参与调节机体的基础代谢，调节体温，使机体能更好的适应外界环境，增强 动物的耐受性（Yen 2001)。甲状腺激素能促进蛋白质和酶的生成，还能减少脂肪贮存，降 低血脂浓度，促进胆固醇的降解，增强小肠粘膜对葡萄糖和半乳糖的吸收，促进糖原的合成 (Pearce 2012)〇
[0004] 甲状腺激素必须与其受体结合才能作用于靶细胞。甲状腺激素受体TR (Thyroid Hormone receptor)基因编码一个410个氨基酸的类固醇蛋白，属于类固醇受体超家族。 TR分子有三个功能结构区：羧基端为其与激素、配体等蛋白的结合区；氨基端具有转录激 活功能，并能与相应抗体结合；DNA结合功能区介于前两者间，是最保守的区域。TR的激素 反应原件HRE (hormone responsive element)能结合在特定的DNA序列（甲状腺激素反应 原件)上调或抑制基因的表达（Power，Llewellyn et al. 2001);未结合甲状腺激素的TR 与DNA结合，起抑制作用，当结合甲状腺激素后构象改变，激活靶基因的转录。TR基因主要 包含TRa和TRP基因两种，分别编码TRa和TRP蛋白（O'Shea and Williams 2002)， 这两种蛋白的结构主要在于氨基端的氨基酸结构不同。由于TRa和TRi3基因的选择性剪 切或转录起始位置的不同而产生若干亚型（Shibusawa, Hollenberg et al. 2003)。TRa 的亚型主要作用为调节机体生长发育，维持甲状腺的功能（Lazar 1993) ;TRi3的亚型主要 作用为增加对T3的敏感性，维持TH对促甲状腺激素TSH (thyroid stimulating hormone) 的负反馈（Jones, Srinivas et al· 2003)。
[0005] 甲状腺激素受体协助甲状腺素发挥广泛的作用。目前，在人、小鼠、鱼类等物种上 已有报道关于甲状腺激素受体基因结构，多态性等。Helena等的研究结果发现在人TRα基 因的第2外显子、第3内含子、第5外显子、第8内含子、第9外显子的3'UTR区、第10外显 子的 3'UTR 区处发现了 SNPs (Sorensen, van der Deure et al. 2008)，但是在山羊上还 未见TRa基因多态性的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克隆与山羊生长性状相关的77?〃基因片段，寻找基因突变位 点，并建立相应的多态性检测方法进行性状关联分析，为山羊的标记辅助选择提供一种有 用的分子标记。
[0007] 本发明通过以下技术实现： 一种作为分子标记应用的与山羊生长性状相关的況0"基因片段，全长为888bp，它的 核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所述。其中第154bp处有一个C230-T230的碱基突变， 导致Ndel PCR-RFLP多态性。
[0008] -种制备所述的与山羊生长性状相关的77?〃基因片段的方法，按照以下步骤： 利用NCBI数据库信息，在线比对牛、绵羊77?〃基因，在第6和7外显子保守区设 计引物扩增山羊況〃基因第6内含子。提取山羊基因组DNA，利用引物（正向引物：5' GCCTTCAGCGAGTTTACCAA 3'，反向引物：5' CTTCCGTGTCATCCAGGTTA 3'）扩增第 6 内含子。提 取山羊基因组DNA，设计引物，PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID Ν0:1 所述的核苷酸序列。
[0009] 在本发明的实施例中 申请人:已将制备的与山羊生长性状相关的ΤΤΡσ基因分子标 记应用山羊分子标记辅助育种的关联分析中的应用。
[0010] 本发明的效果是：发现了一个与山羊生长性状相关的分子标记，为山羊的分子标 记辅助选择提供了一个新的分子标记。
[0011] 更详细的技术方案请参见《【具体实施方式】》中的实施例。
[0012]
【专利附图】
【附图说明】 序列表SEQ ID Ν0:1，山羊77?σ基因第6内含子序列。
[0013] 图1 :山羊77PO·基因第6内含子C230T突变位点测序图。
[0014] 图2 :山羊77PO·基因第6内含子C230T突变位点Nde I限制性酶切琼脂糖凝胶电 泳图。
[0015] 图3 :是本发明所扩增得到的山羊77?〃基因第6内含子核苷酸序列，片段大小为 888bp，图中阴影部分是外显子序列。方框内所显示的是碱基突变。
[0016] 具体实施方案 实施例1 :山羊77PO·基因片段的获得及多态性检测 利用NCBI数据库信息，在线比对牛、绵羊77?〃基因，在第6和7外显子保守区设计引 物扩增山羊ΤΤΡσ基因第6内含子。正向引物：5' GCCTTCAGCGAGTTTACCAA 3'，反向引物：5' CTTCCGTGTCATCCAGGTTA 3' 。
[0017] 选取6个基因组DNA样品（南江黄羊和藏山羊各3个)，以其基因组DNA为模板，利 用上诉引物，进行PCR反应。反应体系：2XMaster Mix Taq酶25 PL，cDNA 4 μ?，上游引物 (1〇μΜ)1.5 μ?，下游引物（1〇μΜ)1.5 PL，ddH20 18 μ?。PCR 反应程序：95 °C 预变性 5min; 然后94°C变性30s，61. 2°C，退火30s，72°C延伸45s，循环35次；最后再72°C延伸lOmin。 取4PL产物，琼脂糖凝胶电泳检测，将含有单一目的条带的PCR产物送至英潍捷基(上海)贸 易公司测序。测序结果与牛的相应序列比对，发现相似性较高，证明扩增得到的即为山羊 基因第6内含子序列。利用Sequencher4. 6和Chromas软件分别对测序得到的6条序 列进行比对分析，找到突变位点C230T。根据序列突变位点信息，选用Nde I限制性内切酶 对6个山羊血液DNA样品PCR产物进行酶切基因分型。酶切反应为限制性内切酶Nde I 1 PL，10XBuffer H 2PL，PCR 产物 5PL，ddH20 12μ?; 37°C恒温水浴 1 h。酶切后电泳检测， 取酶切产物8 μ L，用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。如图2所示，电泳结果只有一条888bp 带为CC基因型，电泳结果有888bp、230bp和658bp三条带为CT基因型。
[0018] 实施例2 :分子标记在不同山羊群中的多态分布 检测发现C230T位点在南江黄羊、内蒙古绒山羊、藏山羊三个品种中均有两种基因型 CC和CT，其中CC基因型均为优势基因型。该位点在三个品种中均处于Hardy-Weinberg平 衡状态，在南疆黄羊、内蒙古绒山羊中处于低密度多态（PIC〈0. 25)，在藏山羊群体中处于中 度多态（0. 25〈PIC〈0. 5)。如下表： 表1三个山羊品种77?〇基因C230T位点的基因型(等位基因）频率与遗传特性
【权利要求】
1. 一种作为分子标记应用的与山羊生长性状相关TRα基因片段，它的核苷酸序列如 序列表SEQ ID NO :1所述。
2. 根据权利要求1所述的基因片段，其特征在于：在序列表SEQ ID NO :1所述的第 230bp处有一个C230-T230的碱基突变，导致Ndel PCR-RFLP多态性。
3. 检测权利要求1所述遗传标记的正、反向引物的DNA序列如下所示： 正向引物：5' GCCTTCAGCGAGITTACCAA 3' 反向引物：5' CTTCCGTGTCATCCAGGTTA 3'。
4. 制备如权利要求1或2所述的基因片段的方法，按照以下步骤：利用NCBI数据库信 息，在线比对牛、绵羊TRa基因，在第6和7外显子保守区设计引物扩增山羊TRa基因第6 内含子，提取山羊基因组DNA，设计引物，PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO :1所述的核苷酸序列。
5. 权利要求2所述的遗传标记在山羊不同生长阶段的体重、体长、体高和胸围以及初 生重生长性状关联分析中应用。
【文档编号】C12N15/10GK104099336SQ201310111237
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月2日 优先权日:2013年4月2日
【发明者】王林杰, 张红平, 李利, 仲涛, 王艳, 薛科, 周中强 申请人:四川农业大学