专利名称：：含有甲状腺激素受体激动剂的稳定的口服药物组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及药物组合物。具体而言，虽然不是排他性的，本方面涉及用于稳定药物组合物的药理学活性成分的配方策略。
背景技术：
：对于多种药理学活性剂而言，口服施用途径是优选的。然而，对于这样的药剂而言，为了到达患者的血流中，它们通常必须被暴露于至少胃肠道上部(即胃和小肠)的内容物。某些药剂对胃的酸性环境敏感。这种敏感性通常导致所述药剂的酸介导的水解。提供含有这种肠溶包衣的水解敏感药剂的组合物是已知的。通常，这样的包衣包含在低pH(即在胃中)下基本上不带电荷且不溶解、而在较高pH值(即在进入小肠的通路上)下电离且溶解性更好的酸性聚合物。描述于WO01/60784中的化合物1A(IUPAC又名为3-[[3,5-二溴-4-[4-羟基-3-(1-甲基乙基)-苯氧基-苯基-氨基-3-氧代丙酸)具有下述结构化合物1A化合物1A和一系列相关化合物被描述为曱状腺激素受体(具体而言是TRP受体)激动剂。这些化合物应当可用于治疗或预防与代谢异常相关的疾病或依赖于三碘甲状腺原氨酸(T3)所调节基因的表达的疾病。这些疾病包括例如肥胖症、高胆固醇血症、动脉粥样硬化、心律失常、抑郁、骨质疏松症、甲状腺功能减退、甲状腺肿、曱状腺癌以及青光眼和充血8性心力衰竭。
发明内容在进行含有化合物1A的配方的开发工作中，本发明人出乎意料地发现化合物中出现了不希望的转化。产生了在酚环(即上述左侧环)的羟基邻位上含有硝基(-N02)的反应产物。研究中发现该反应产物与未转化的化合物1A相比具有改变的性质，出乎意料地，包括基因毒性潜能。进一步的研究发现口服施用后能在体内产生所述反应产物。因此，本发明人试图研究导致产生硝化反应产物的过程以便在口用施用后抑制其形成。已知(例如由Oldrieve等，CTie附.及w.7kv/"/.1998,11，1574)某些类黄酮化合物能抑制在存在亚硝酸盐的酸性条件下发生的酪氨酸硝化或由DNA碱基形成碱基脱氨基产物。已表明体外人唾液中亚硝酸盐和过氧化氢存在时羟基苯乙酸和蛋白质的硝化能够被还原性物质所抑制(Takahama等J威Oni/倫/.2003，48,679)。然而，这些公开内容无法使技术人员预见到这样的硝化反应可否发生在其它化合物中，比如由化合物1A所示例的结构上不同的甲状腺激素受体激动剂。此外，他们未指出这样的反应可能在体内是重要的，并且没有关于预测这些硝化反应产物的潜在特性(例如基因毒性)的暗示。现有技术未公开或提示结合甲状腺激素受体的化合物(比如上述化合物1A)可在口服施用时转化成潜在毒性的反应产物，也未公开或提示这样的转化是如何发生的及如何解决这样的问题。因此，本发明的一个目的是提供药物组合物，其中口服施用后某些结合甲状腺激素受体的化合物的上述硝化问题得到緩解。具体实施例方式因此，本发明的第一方面提供了适于口服施用的药物组合物，其包含(i)式I化合物，包括其所有的立体异构体、或其药学上可接受的盐或酯<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>式I其中Z是H或能被N02通过基于亚硝酸盐的硝化反应而取代的可替代基团(alternativegroup);Ri选自氢、卣素、三氟甲基或1至6个碳的烷基或3至7个碳的环烷基；X是氧(-O-)、硫(-S-)、羰基(-CO-)、亚甲基(-CH2-)、或-NH-;R2和R3相同或不同，并且是氢、卣素、1至4个碳的烷基或3至6个碳的环烷基，R2和R3中至少一个不是氢；R4是氢或低级烷基；A是氧(-O画)、亚甲基(-CH2画)、-CONR5-、-NR5-il-NR5CO-;Rs是H或低级烷基；R6是羧酸(-C02H)或其酯或其前药；Y是-(CH2)n，其中n是0、1、2、3、4或5，其中一个或多个所述CH2基可以任选地被离素取代，或者Y是-C-C-,其可以是顺式或反式的；和R7是氢、或烷酰基或芳酰基，或能通过生物转化而产生游离酚结构(其中R7=H)的其它基团；(ii)至少一种药学上可接受的赋形剂；和(iii)肠溶包衣。式I化合物尤其可用作甲状腺激素受体激动剂。具体而言，许多这样的化合物对TRP(而不是TRa)受体显示增强的活性。本发明第一方面的组合物是基于本发明人由上述研究而得到的出乎意料的发现之上的，所述发现是在口服施用时通过基于亚硝酸盐的硝化反应形成化合物1A的硝基反应产物。所述基于亚硝酸盐的硝化反应需要适当低的pH(约2)以便进行反应。通过向组合物提供肠溶包衣(即在酸性胃中保持完整，仅在组合物进入其中pH接近中性的小肠的通路中溶解)，硝化反应被显著抑制。肠溶包衣的存在可防止式I的药理学活性化合物暴露于胃的酸性介质中，从而防止在所述活性化合物附近形成亚硝酸盐物质。因此，肠溶包衣的结果是口服施用式I化合物时的硝化反应得到削弱。应当强调的是，本发明人理解和试图削弱硝化反应的动机在于在配方开发工作期间意外地形成了化合物1A的硝化反应产物。这样的硝化反应还发生在式(I)的其它化合物中，包括例如下述的化合物GC-1。除非已经检测到该硝化反应产物，否则不会有理由检测其潜在的遗传毒性。不知道这样的反应产物的潜在毒性(或其它不期望的特性)，当然也不会有动机去试图防止其形成。本发明的应用不限于化合物1A的稳定化。而是，根据本发明第一方面的组合物应当通过削弱口服施用时易于发生的硝化反应而实现一定程度的稳定化。式I任何化合物的硝化可导致所述化合物的药理学和/或毒理学特性的改变，或者同样可影响其药物代谢动力学。这些化合物的硝基反应产物可能是潜在地基因毒性的。某些情况下，还可防止在酸性介质中的其它反应(例如苯胺(其本身是潜在地基因毒性的)的释放)。此外，在低pH下还可通过芳香族亲电取代发生非主要环(即如上所示的右側环)上的硝化反应。肠溶包衣也会抑制或防止这些硝基反应产物的形成。在任何情况下，控制和/或防止式I化合物的这些化学修饰的能力对调剂师而言通常将是有用的手段。根据本发明第一方面的组合物可使得式I化合物仅仅在通过胃进入小肠时(在此时肠溶包衣开始溶解和/或变为可渗透的)才从组合物中释放出来。然而，由于小肠中的pH不足够低以致于基于亚硝酸盐的硝化不能进行到任何显著的程度，口服施用时式I化合物的硝化被大大削弱。本文的术语"烷酰基"单独或作为另一个基团的一部分应用时是指连接了羰基的烷基。本文中单独或作为另一个基团的一部分而使用的术语"芳酰基"是连接了羰基的芳基。除非另有说明，本文中单独或作为另一个基团的一部分而使用的术语"垸基"("alkyl"或"alk")包括直链或支链的烃，所述烃的直链中含有1至12个碳，优选1至4个碳(在此情形下可使用术语"低级烷基")，比如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、或异丁基、戊基、己基、异己基、庚基、4,4-二甲基戊基、辛基、2,2,4-三甲基戊基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基。本文中单独或作为另一个基团的一部分而使用的术语"芳基"指环部分中含有6至10个碳的单环和二环芳香族基团(比如苯基或萘基，包括1-萘基和2-萘基)，其可任选地通过可供利用的碳原子被1、2或3个选自以下的基团所取代氢、卣素、烷基、卣代烷基、烷氧基、卣代烷氧基、烯基、三氟曱基、三氟甲氧基、炔基、羟基、氨基、硝基、氰基和/或羧基或其烷基酯。除非另外说明，本文中单独或作为另一个基团的一部分而使用的术语"环烷基"包括饱和的环状烃基或部分不饱和的(含有l或2个双键)的环状烃基，其包含一个环，并且总共3至7个碳(优选3至6个碳)形成所述环，所述环包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环戊烯基和环己烯基。本文中单独或作为另一个基团的一部分而使用的术语"卤素，，或"卤代，，指氯、溴、氟和碘以及CF3，其中氯或溴是优选的。能被N02通过基于亚硝酸盐的硝化反应而取代的可替代基团可例如选自卣素(例如碘、氯、溴或氟，其中优选前者)和拟卣素(例如SCN、OCN、NCS、NCO和N"。优选利用为此目的而制备的任何可商业购得的聚合物形成肠溶包衣。作为这样的聚合物的实例，可提及的有基于丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯或其共聚物(比如由Degussa/Roehm市售的商品名为￡11^3经迀@的肠溶包衣聚合物系列)、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、邻苯二曱酸醋酸纤维素、醋酸羟丙甲基纤维素琥珀酸酯、羟丙甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸羟甲基纤维素琥珀酸酯和羧甲基乙基纤维素的那些。在一个具体的实施方案中，肠溶包衣包含曱基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物。这样的共聚物的组成单体可以1:1的比例存在。肠溶包衣还优选地包含助流剂成分，比如滑石。还可有利地包含增塑剂。合适的增塑剂是梓檬酸三乙酯。优选地配制肠溶包衣的组合物使得当利用USP溶出仪II在卯0ml或500ml模拟胃液或0.1NHC1中37C下以50转/分钟的搅拌速度测量释放时，5%或更少、更优选基本上没有式I化合物在至少1小时、更优选2小时、最优选3小时内释放。在优选的实施方案中，当在pH6.8的緩冲介质(例如pH6.8的模拟肠液)中进行测量时，至少80%、优选至少卯％、更优选至少95%并且最优选基本上所有式I化合物优选在1小时内，更优选在45分钟内被释放。在一些情形下，可优选地在含有式I化合物的组合物部分和肠溶包衣(iii)之间提供惰性包衣。肠溶包衣通常由酸性聚合物组成，因此，由于它们的特别的性质，所述肠溶包衣具有导致某些活性成分有害变化的潜能。被置入的惰性包衣(由例如纤维素衍生物比如羟丙基纤维素或羟丙甲基纤维素制成)倾向于抑制这样的相互作用。当然，所述惰性包衣应当在小肠介质中是可溶解的(或可分散的)，以便使式I化合物释放出来。本文所用的术语"肠溶包衣"旨在包括剂型在其它方面基本上完成时应用于组合物/剂型(例如片剂)的包衣以及在剂型制备的中间阶段应用的那些包衣。因此，包括以下组合物其中式I化合物与赋形剂一起配制成颗粒，然后在进一步处理(比如压制成片或填充进胶嚢例如明胶胶囊中)之前对所述颗粒进行肠溶包衣。同样，如WO00/22909中所述的方法(尽管是较不优选的)可适用于针对某些式I化合物制备根据本发明第一方面的组合物。在该方法中，通过调节pH而从溶液中共沉淀来制备药理学活性成分和相对疏水性的羧酸(例如C9-C3。脂肪族羧酸)的复合物。在某些式I化合物中，X是氧或-CHr。作为替代或者此外，A可以是-NH-、-O-、-<:112-或-<:€^1^-。在某些优选的式I化合物中，Ri是异丙基、碘或H。此外或作为替代，可优选的是112和议3各自独立地是卣素或烷基。在这样的情形下，R2和Rs优选地各自独立地是Cl、Br、I或曱基。在某些优选实施方案中，R2=R3。R2=R3=Br或Cl是特别优选的。在式I化合物中，R4优选地是H或甲基，其中H是特别优选的。在某些式I化合物中，Y是-(CH2)n-,n是l或2。作为替代或者此外，A可以是-NRsCO-，其中Rs是H。在特别优选的式I化合物中，Y是-(CH2)n-，n是l,A是NHCO或CONH，116是COOH或COOH的相应的盐、酯或前药形式。在本发明的所选实施方案中，化合物(i)可具有选自下述的式，或其药学上可接受的盐或酯<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>技术人员应当理解，上述硝化反应将导致在上述结构中所示左侧苯环的最低位置或OH的邻位引入硝基。因此，虽然在多数情形下取代基将是H，但还可预料到能通过基于亚硝酸盐的硝化反应而被取代的可替代基团，例如酚羟基邻位的碘基团。本发明人已表明这是容易进行的反应，尽管比氢的置换要慢。当式I化合物以酯的形式存在时，其烷基酯是优选的。当式I化合物以药学上可接受盐的形式存在时，这样的盐可包括(当化合物具有至少一个碱性中心时)酸加成盐，例如与强无机酸(比如无机酸例如硫酸、磷酸或氢卣酸)所成的酸加成盐；与强有机羧酸所成的酸加成盐，所述强有机羧酸比如未被取代的或例如被卣素取代的1至4个碳原子的链烷羧酸(例如乙酸)，比如饱和或不饱和的二羧酸(例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或对苯二甲酸)，比如羟基羧酸(例如抗坏血酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸)，比如氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸或赖氨酸或精氨酸)，或苯甲酸；或与有机磺酸所成的酸加成盐，所述有机磺酸比如未被取代的或例如被卣素取代的(d-C4)烷基磺酸或芳基磺酸，例如甲磺酸或对甲苯磺酸。还可形成相应的酸加成盐，其具有另外存在的碱性中心(如果需要的话)。当式I化合物具有至少一个酸基(例如COOH)时，其还可形成与碱的盐。合适的与碱的盐是例如金属盐，比如碱金属盐或碱土金属盐(例如钠盐、钾盐或镁盐)；或与氨或有机胺所成的盐，比如吗啉，硫代吗啉，哌啶，吡咯烷，单低级烷基胺，二低级烷基胺或三低级烷基胺(例如乙胺、叔丁胺、二乙胺、二异丙胺、三乙胺、三丁胺或二甲基丙胺)，或单羟基低级烷基胺，二幾基低级烷基胺或三羟基低级烷基胺(例如单乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺)。还可形成相应的内盐。优选的包含碱性基团的式I化合物的盐包括单盐酸盐、硫酸氢盐、甲磺酸盐、磷酸盐或硝酸盐。优选的包含酸基的式I化合物的盐包括钠盐、钾盐和镁盐以及药学上可接受的有机胺。当然，化合物(i)可以是溶剂化的(如果需要的话)，例如水合物可用于本发明。在本发明第一方面的某些实施方案中，组合物还包含抗氧化剂。这样的实施方案是基于本发明人由于上述研究而得到的出乎意料的发现之上的，所述发现是口服施用时通过自由基介导的基于亚硝酸盐的反应形成化合物1A的硝基反应产物。本发明人还确定了如上所述的非二芳基醚化合物GC-1在生理相关的条件下变得容易硝化。将抗氧化剂引入到本发明第一方面的组合物中将抑制自由基的形成和/或清除所形成的自由基，结果是削弱了即便是肠溶包衣存在时也发生的硝化反应。抗氧化剂优选地是水溶性的。这样的抗氧化剂包括抗坏血酸、富马酸、苹果酸、丙酸、或任何所述酸的盐、单硫代甘油、焦亚硫酸钾、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠和焦亚硫酸钠。优选的抗氧化剂是抗坏血酸或其钠盐，已发现其对硝化反应具有特别显著的抑制作用。或者，抗氧化剂可以是水不溶性的。这样的抗氧剂可选自a-生育酚、15抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、油酸乙酯和没食子酸丙酯。尽管不是必要的，但可优选地将化合物(i)和抗氧化剂(ii)基本上均一地相混合。这有助于确保当化合物(i)与亚硝酸盐(和/或亚硝酸、和/或任何含氮和含氧的自由基物质)有任何接触时，抗氧化剂更可能地处于这样的接触的附近，因此能更好地削弱可能发生的任何硝化反应。根据本发明第二方面，提供了适于口服施用的药物组合物，其包含(i)如上所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或酯；(ii)至少一种抗氧化剂；和(iii)至少一种药学上可接受的赋形剂。在本发明第二方面的优选实施方案中，所述组合物是固体组合物。针对本发明第一方面所述的式I的优选特征也适用于第二方面(以及适当时下述其它方面)。本发明第二方面的组合物优选地还包含肠溶包衣。所述肠溶包衣可以是如上针对本发明的第一方面所述。在第三方面，本发明还提供了稳定适于口服施用的药物组合物的方法，所述药物组合物包含(i)如上所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或酯；和(ii)至少一种药学上可接受的赋形剂；所述方法包括提供具有肠溶包衣的组合物。另一方面，本发明提供了肠溶包衣或抗氧化剂或肠溶包衣与抗氧化剂二者在适于口服施用的包含上述式I化合物或其药学上可接受盐或酯的药物组合物中用于降低或防止式I化合物硝化的用途。本发明还提供了用于治疗的根据本发明的组合物。本发明还提供了根据本发明的组合物在制备用于预防、抑制或治疗与代谢异常相关的疾病或依赖于三碘甲状腺原氨酸(T3)所调节基因之表达的疾病的药物中的用途。所述疾病可选自肥胖症、高胆固醇血症、血脂异常(dyslipidaemia)、动脉粥样硬化、心律失常、抑郁、骨质疏松症、甲状腺功能减退、曱状腺肺、甲状腺癌以及青光眼和充血性心力衰竭。同样，本发明还提供了预防、抑制或治疗与代谢异常相关的疾病或者依赖于三碘甲状腺原氨酸(T3)所调节基因之表达的疾病的方法，所述方法包括给需要这样的预防、抑制或治疗的对象施用根据本发明的组合物。在如上所述的用途和方法中，可以30分钟至1个月的给药间隔施用所述药物或组合物。更优选地，给药间隔是1至7天，甚至更优选l至3天。化合物(i)的典型成人剂量范围是约l吗至约2000吗/天。对于多种化合物(i)而言，日剂量小于300吗。优选地，化合物(i)的剂量是约l吗至约200吗/天，更优选约l吗至约100吗/天。例如，可以每日一剂、两剂、三剂或四剂施用化合物(i)。优选地，每单位剂量的组合物中化合物(i)的量是l吗至200ng，更优选1吗至IOO吗，更优选l、5、10、20、25或50ng。例如，4单位剂量中化合物(i)的量是10至100ng，例如20至80ng，通常25至50ng。才艮据本发明第一方面或第二方面的组合物还可包含选自以下的其它药理学活性成分降血脂剂、抗糖尿病药、抗抑郁剂、骨吸收抑制剂、食欲抑制剂和/或抗肥胖剂。其它的药理学活性成分倾向于与化合物(i)具有加和作用或协同作用，从而提高其代谢作用。在含有抗氧化剂的上述组合物中，抗氧化剂的量可在非常宽的范围内变化。优选地，存在至少O扁lmmol抗氧化剂，例如0扁5mmo1，更优选至少O.Olmmol。每剂量组合物中抗氧化剂的量可例如是0.0001至15mmo1,例如0.0005至lOmmol，通常0.01至4mmo1。正如以下将更详细地描述的，人均每小时吞咽约O.lmmol唾液亚硝酸盐。组合物中上述量的抗氧化剂的存在应能够提供有用的稳定化合物(i)的作用，即使本发明的组合物在胃中滞留相对长的一段时间。在又一方面，本发明提供了适于口服施用的联用药物，其包含(1)第一药物组合物，其包含上述式I化合物或其药学上可接受的盐或酯；和(2)第二药物组合物，其包含至少一种抗氧化剂，其中所述第一药物组合物和第二药物组合物各自包含至少一种药学上可接受的赋形剂，其中所述第一药物组合物和第二药物组合物可被同时、序贯或分开施用。本发明的联用药物利用了下述事实为了实现化合物(i)的稳定化，抗氧化剂应当仅仅在化合物(i)与酸和亚硝酸盐源相接触时存在。假定以接近的时间给予联用药物中的两种组合物，使得其在胃中滞留时间存在交叠，则化合物(i)将获得至少一定程度的对抗硝化反应的稳定化。所述组合物或至少所述第一组合物优选地是固体组合物。现在仅通过实施例并参照附图，更详细地描述本发明，其中图1显示了在其多个浓度的5，-硝基反应产物存在下，化合物1A的一系列标准HPLC曲线；和图2举例说明了用于制备含有化合物1A的肠溶包衣片的方法。如上所述，在开发化合物1A期间，已确定5，-硝基反应产物的形成是通过非生物(即非酶的)途径发生的。测定到硝基反应产物的毒理学特性以与母体化合物相比相关的程度改变。因此，确定硝化反应是如何发生的并"^殳计体内控制或防止该硝化反应的方法是重要的。实施例1-化合物1A的反应产物的基因毒性1.1引言在开发化合物1A的25吗胶嚢制剂期间，在几个批次中观察到了之前未检测到的杂质，所述杂质的范围是母体化合物的0.8%至1.2%。该杂质被确定为硝基类似物，在下文中称为反应产物1B。因此确定了体内形成该杂质/反应产物的理论上的可能性。这样，在国际协调会议(ICH)的标准系列研究中测试了该假定反应产物的基因毒性作用。该实施例总结了利用反应产物1B进行的基因毒性研究，并将结果与该杂质/反应产物的临床暴露(clinicalexposure)相关联。1.2基因毒性1.2.1反应产物IB1.2.1.1初步的Ames试验在存在和不存在S-9代谢活化的情况下，在一式两份的培养物中测试反应产物1B。将阳性对照物在一式两份的培养物中进行测试并在DMSO中进行制备，除叠氮化钠以外，将其溶解在水中。在5份培养物的复制物中平行测试阴性(载体)对照。反应产物1B显示出对每种所测的鼠伤寒沙门氏菌(S.(v/^/附wn'"附)和大肠杆菌的细胞毒性。基于平均回复体数的降低和/或细菌背景菌苔密度(bacterial-backgroundlawndensity)的降低，细胞毒性是明显的，从最小至显著的范围。当与阴性对照进行比较时，分别在存在和不存在S-9活化的情况下，在反应产物1B处理的TA100菌林培养物中评价组氨酸+回复体值。如所预料的那样，在以阳性对照化合物处理的培养物中观察到了组氨酸+回复体数和色氨酸+回复体数的显著增加。总之，在该研究中反应产物1B显示出阳性反应。1.2.1.2沙门氏菌(Salmonella)和大肠杆菌(Escherichiacoli)中的Ames回复突变研究在微生物诱变性研究中评价反应产物IB以测定其诱导鼠伤寒沙门氏菌(iSVi//MO/ie//fl(v/7A/附i/r/ti附)(《且氛酸—)菌林和大肠軒菌(五sc/ren'c/r/"//)(色氨酸_)菌林中移码突变或碱基对置换突变的可能性。在范围确定试验(range-findingassay)以及随后在全突变试验中利用每种菌林测试反应产物1B。在含有和不含有S-9代谢活化的情况下(最大浓度高达3000和1000fig/板)，分别在范围确定试验以及全突变试验中评价了反应产物1B。在每种所测菌林中观察到细胞毒性。在存在和不存在S-9活化的情况下，在范围确定试验以及全突变试验中，经反应产物IB处理的TA100测试菌林培养物中组氨酸+回复体平均数显著升高(约2至3倍)。反应产物1B诱导的TA100菌林中回复体相对于对照值的增加表示阳性反应。1.2.1.3所进行的Ames试验的总结总之，在初步Ames试验中测试了化合物1A的芳香族硝基杂质/反应产物即反应产物IB,发现引起回复体中高于对照值的浓度依赖性增加。所述增加高于对照2.5至3倍，即其被定性为阳性反应。在全Ames试验中证实了该结果。1.2.1.4原代人淋巴细胞中的细胞遗传学研究进行体外细胞遗传学研究以研究反应产物IB引起培养的人淋巴细胞中染色体畸变的可能性。基于范围确定的细胞毒性结果，选择5至30ng/ml的浓度在没有代谢酶活化的24小时暴露中进行评估，并且选择2.5至20pg/ml的浓度用于多氯联苯1254诱导的大鼠肝脏(S9级分)代谢活化的5小时暴露评估。在存在S-9代谢活化的情况下暴露于反应产物1B5小时之中，染色体畸变发生的频率统计学上显著增加。在20吗/ml的最高浓度下，染色体畸变的频率是10.5%,与之相比，载体对照为2.5%，有丝分裂指数降低约51%。在不存在S-9代谢活化的情况下暴露于反应产物1B24小时之中，染色体畸变发生的频率统计学上显著增加。在最高浓度升高到40fig/ml的情况下，染色体畸变频率是7.5%,与之相比载体对照为2.5%,有丝分裂指数降低约48%。20如所预料的那样，在每个试验中阳性对照引起被损伤中期的频率统计学上显著增加。由此证实了该试验的有效性。总之，当按照体外细胞遗传学研究国际指南所推荐的最大浓度进行测试时，反应产物1B对分裂的人淋巴细胞是诱裂性的。1.2.1.5小鼠口服的微核研究在小鼠骨髓微核试验中评价反应产物IB以测定其体内遗传毒性潜能。几组小鼠给予1000、1500或2000mg/kg的三次连续口服日剂量的反应产物1B(即高达ICH和OECD中国际调节指南所需的最大剂量水平)。最后给药后约24小时从所有动物采集股骨骨髓样品用于评价微核化的多染性红细胞(MN-PCE)。研究期间未观察到动物死亡，并且未观察到与药物相关的临床体征。未观察到以多染红细胞(PCE)中有意义的降低所衡量的骨髓毒性。1000和1500mg/kg引起MN-PCE频率统计学上增加。总之，在小鼠中未发现剂量依赖性的阳性反应。1.3临床暴露于反应产物IB向人志愿者施用单次口服剂量的化合物1A后，可在血浆中检测到反应产物1B。同样，在其中对象接受日剂量的化合物IA两星期的试验中，可在几名对象中检测到反应产物1B。总之，在向人施用化合物1A后，可在血浆中检测到潜在地诱导突变的硝基反应产物1B。即4吏在相对短的时间(例如14天，如上所述)内给药也是如此。潜在的基因毒素(genotoxin)在其致突变效应方面通常是非剂量依赖性的，因此，甚至低水平的反应产物IB的存在也具有临床相关性。此外，通常会在长时间内给予式I化合物，因此，如果要避免反应产物积累引起的潜在的遗传毒性作用，则防止形成硝基反应产物是极为重要的。1.4总结和结论发现化合物1A的杂质/反应产物即反应产物IB体外诱导人外周淋巴细胞的染色体畸变，并且在小鼠体内微核研究中诱导非剂量依赖性的微核。此外，在短期给予化合物1A后可在人血浆中检测到反应产物1B。因此，清楚的是防止形成硝基反应产物应具有重要的益处，不仅因为潜在的基因毒素可以在非常低的浓度下引起基因毒性作用，还因为式I化合物(比如化合物1A)通常将长期施用。实施例2-硝酸盐源和亚硝酸盐源以及硝化机理2.1引言一种可能的硝化作用源是非经典的亚硝酸盐途径。该途径首次由Uemura等人才艮道(1978,丄C7^附.5Vc/VrA:,Vf7>"/is./，9，1076)。所述亚硝酸盐途径可在适度低的pH(约2)下进行并且能耐受水，这与硝酸盐途径不同。所述亚硝酸盐途径导致产生能与含有羟基化苯的化合物反应的自由基物质(Beake等(1992)/C7^附.5W.i^Wi:/"Tlr冊s.2，10，1653)。本发明人认为该途径可能是口服施用的式I化合物在胃和小肠中进行硝化的主要途径。评价了来自除食物添加剂以外的来源的硝酸盐和亚硝酸盐的平均每日摄入量(T.Hambridge，ra。i^"雄,W50，NitrateandNitrite)。就内源性的亚硝酸盐源而言，已知硝酸盐是由唾液中的硝酸盐通过口月艮硝酸盐还原酶的作用而形成的(Benjamin(2000)49，207)。这导致唾液中亚硝酸盐浓度为约200nM。人均每小时吞咽约500ml唾液。这导致每日摄取约2.4mmol(llOmg)的亚硝酸盐。此计为约1.6mg/kg/天亚硝酸盐(对于平均体重70kg的成人而言)。2.2.体内硝化研究在大鼠体内进行的试验中，发现当将化合物IA与硝酸盐以及亚硝酸盐溶液(每只大鼠分别为54mg和4mg)—起口服施用时，化合物1A所施用剂量的约6%被硝化。222.3.抗氧化剂如上所述，假设化合物1A(以及因此其它含有羟基化苯的化合物，比如式I的那些)的硝化机理是通过亚硝酸盐。并由此是自由基介导的。因此，认为硝化反应可被自由基清除剂/抗氧化剂所抑制。一般而言，根据本发明可使用任何抗氧化剂。"真正的"抗氧化剂是通过与自由基反应(通过给自由基物质提供单电子)而阻断自由基介导的链反应的那些。这样的真正抗氧化剂的一个实例是丁基化羟基甲苯(BHT)。这样物质的其它实例包括酚性抗氧化剂，比如阿魏酸、芸香苷、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素(epigallocatechin)、表儿茶素没食子酸酯/盐(apicatechingallate)和表没食子儿茶素没食子酸酯/盐(epigallocatechingallate)。许多这样的物质是天然存在的，例如类黄酮型或反式芪型抗氧化剂。还原剂是氧化还原电位低于用其来保护的化合物的物质和/或其可用作硝化引诱剂(decoy)的物质。以这种方式作用的试剂的实例是抗坏血酸。此外，某些试剂是"抗氧化剂增效剂"。这些试剂提高抗氧化剂的作用并且还可被包含在本发明的组合物中，一个实例是依地酸钠。还可根据其溶解特性对抗氧化剂进行分组。水溶性的抗氧化剂包括抗坏血酸(或其钠盐)、富马酸、马来酸、单硫代甘油、焦亚硫酸钾(K03S-S02K)、丙酸(CH3CH2C02H)、亚石克酸氬钠(NaHS03)、亚硫酸钠(Na2S03)。水不溶性的抗氧化剂包括a-生育酚、棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基曱苯(BHT)、油酸乙酯和没食子酸丙酯。2.4.硝化反应及其抑制已知L-酪氨酸可被转化成硝基反应产物，其中N02基在环羟基的邻位上取代。使用测定L-酪氨酸硝化程度的试验过程来测定化合物1A的硝化以及其被所选抗氧化剂的抑制。L-酪氨酸的试验过程是公知的(1998，C7ie附.及dTbjc/co/,11，1578)。简言之，在37。C和存在或不存在磷酸盐緩冲剂的情况下，将化合物1A的溶液(50|uM)暴露于不同pH值的NaN03溶液(2500pM)和/或NaN02溶液(不同浓度)中。硝化反应导致形成化合物1A的5，-硝基反应产物。可利用HPLC检测和定量该反应产物，所述反应产物与母体化合物相比保留时间减少(在所用条件下)。然后将抗氧化剂抑制剂加入到含有NaN02和1A的测试溶液中并重复硝化试验。图1显示在50nM至50fiM反应产物lB的存在下，1A(50jiM)的一系列标准HPLC镨图。利用下述条件通过HPLC-MS/MS进行分析HPLC条件仪器WatersAlliance2795LC保护柱WatersSentry保护柱，SymmetryC183.5jim,2.1x10mm柱WatersSymmetryC183.5nm，2.1x50mm柱温45。C进样体积5pl自动进样器温度10°C流速0.2ml/分钟流动相A=10mM乙酸铵(用乙酸调节pH=4.5)，梯度<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>质谱条件:仪器MicromassQuattromicroAPI模式ESI-实验MRM(多反应监测)化合物1A的MRM转换m/z486.0>399.9(tR=3.47分钟)反应产物IB的MRM转换m/z531.0>444.8(tR=3.91分钟)定量限度(LOQ):MRM中化合物1A的LOQ是10nM(在50%乙腈:50%7片中)。MRM中反应产物IB的LOQ是InM(在50%乙腈:50%水中)。可以清楚地看出，反应产物在所使用条件下的保留时间减少，其中母体化合物1A在约3.5分钟洗脱，反应产物在约4分钟洗脱。当1A与不同浓度的NaN02和/或NaN03—起孵育时，得到表1中的结果。表1:在亚硝酸盐和/或硝酸盐存在下以及在不同pH条件下化合物1A的硝化<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>基于这些数据，可得出几个结论。首先，清楚地证实了亚硝酸盐单独在适当的酸性4Ht下足以引起化合物1A的显著硝化。如阴性对照(第1至4行)所示，当不存在亚硝酸盐和硝酸盐时未观察到硝化结果。第二，磷酸盐緩冲剂的存在可实际上导致对基于亚硝酸盐的反应的显著抑制，所述反应在pH2的HC1溶液中比在pH2的緩冲液进行得程度更大。第三，pH2(HC1或緩冲剂)的硝酸盐不能导致化合物1A的可检测的硝化。第四，硝酸盐似乎显著程度地抑制基于亚硝酸盐的反应。(大于一个数量级，见粗体数字)。因此，这些数据证实，当口服施用时，利用含有羟基化苯的化合物(比如式I的那些(例如化合物1A))所观察的硝化反应是通过亚硝酸盐介导的而不是通过硝酸盐介导的。数据还清楚地证实了酸性环境对于硝化反应的重要性。本发明的肠溶包衣的组合物可降低或防止酸性介质与其中所包含的药理学活性成分相接触。因此，这样的配制方法能显著减少否则将会发生的硝化反应。当在亚硝酸盐存在下向化合物1A中添加所选的抗氧化剂抑制剂时，得到表2的结果。所用的抗氧化剂的量一般是化合物1A的量的约10至20倍。表2:在亚硝酸盐存在下利用抗氧化剂抑制剂抑制化合物1A的硝化<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>由表2的数据可以得出许多重要的结论。清楚的是，除非亚硝酸盐被酸化，否则化合物1A的硝化将不进行或可忽略，甚至在亚硝酸盐浓度增加到高达8倍的情况下也如此。更重要的是，可以看出，在pH和亚硝酸盐浓度处于可导致几乎全部测试化合物转化成其硝基反应产物的条件下，BHT(水不溶性)或抗坏血酸盐(水溶性)的存在导致基本上完全抑制亚硝酸盐介导的硝化(见粗体数字)。因此，大体上，本文所报道的数据清楚地举例说明了亚硝酸盐(N02)而不是硝酸盐(N03)是含有羟基化苯的化合物(比如式I的那些(例如化合物1A))中所观察到的体内硝化的可能来源。该亚硝酸盐介导的硝化通过自由基机制进行，并仅在酸化的介质中进行到相关的程度。将抗氧化剂引入到包含含有羟基化苯的化合物的组合物中显著地抑制该硝化反应。此外或作为替代，利用肠溶包衣保护所述组合物将防止酸化的亚硝酸盐与含有羟基化苯的化合物相接触，并由此提供了用于稳定化合物对抗硝化的有力策略。实施例3-化合物1A的肠溶包衣的制剂3.1研磨前后化合物1A粒径的测量由于未研磨的化合物1A含有大部分大于约100pm的颗粒，这将影响片剂的含暈均匀性，因此研磨化合物1A。使用RetschMM2000研磨2x2g化合物1A。直径为100pm且密度为1.5g/cm3的球形颗粒的质量为约1吗。利用MalvernMasterSizer2000即激光衍射技术测量粒径分布。将粉末样品分散在吐温20和水中。呆>^磬辨^合#7^.'测量显示中位数直径d(0.5)为101和103mhi。卯％分位数(quartile)直径d(0.9)为158和159pm。^f,^^合浙L4:研磨后，d(0.5)为20nm，d(0.9)为85pm。这是可接受的粒径分布。3.2片剂配方所制备的药物产品是白色、圆形(直径7mm)、凸面的肠溶膜包衣片，为两个剂量规格(strength),即每片含有50吗和300吗化合物1A(下文中为"1A")。下述表3.1提供了所述药物产品的完整组成。表3.1:1A肠溶包衣片的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>制备过程中蒸发圆括号内为干共聚物的量片芯的目标重量是140mg，膜的目标重量是12mg。批配方50ng/片和300fig/片的批配方(参见表3.2)指片剂制备期间片芯为6000片(840g)，包衣期间片芯为5700片(798g)。表3.2:1A肠溶包衣片的批配方<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>由于制备片芯过程中损失而包含6%的过量值**制备过程中蒸发"'圆括号内为干共聚物的量由于包衣过程中损失，包衣混悬物(表格的最后4行)的量包含1155的过量值3.3制备图2给出1A肠溶包衣片的制备过程的流程图。制备了50吗和300吗1A的片芯。所迷片芯是"基本颗粒(basegranulate)，，(含有1A)、甘露醇、羟丙甲基纤维素(hypromellose)和硬脂酸镁的混合物。所述"基本颗粒，，是通过将研磨过的1A混悬在羟丙曱纤维素的水溶液中并将分散体喷雾到MCC上而制得。由于损失而使用过量6%的1A。蒸发水后，将干燥后的产品过筛。将粉末混合物压制成具有合适的脆碎度和崩解时间的圆形凸面片。片重是140mg，直径是7mm。对片芯进行包衣以达到胃抗性(gastricresistance)。聚合物是甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物水分散体(EudragitL30D-55)。将滑石作为助流剂加入到所述聚合物分散体中，柠檬酸三乙酯用作增塑剂。下表中提供了每种赋形剂的功能。表3.3赋形剂的功能<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>3.4肠溶包衣组合物的分析用于评价肠溶包衣片的含量和杂质等的合适方法如下。通过在样品溶剂中搅拌而从片剂中提取化合物1A。离心以除去不溶性的颗粒之后，利用表3.4中所述的仪器条件检测上清液中1A、单个有关物质和总有关物质的量。利用反相色镨和UV检测测定1A及其有关物质的量。表3.4:1A片剂的HPLC方法参数和解决方案方法参数和解决方案<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>可按下面进行溶出试验。溶出试验分为两步第一步测试肠溶包衣的抗性，第二步测试溶出速率。在O.IM盐酸中测试包衣抗性(coatingresistance)3小时。在50mMpH6.8的裤酸钠緩冲剂中测定1小时内的溶出。在分析之前，将提取的样品离心以除去不溶性颗粒。根据表3.5利用反相色镨和UV检测可测定由组合物中释放出来的IA的量。表3.5:1A片剂溶出试验的HPLC方法参数和解决方案<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>发现在0.1MHC1中进行溶出试验之后化合物IA的释放是检测不到的。然而，当在pH6.8的介质中重复溶出试验时，片剂的溶出和化合物1A的释放对于每个所测片剂而言实质上都是完全的。因此，当体内使用时，这样的肠溶包衣组合物在口月Mfe用之后将防止活性成分被暴露于胃中含亚硝酸盐的酸性介质中，由此防止或显著降低这样的活性成分的潜在遗传毒性反应产物的产生。实施例4:其它式I化合物的硝化0发现所有情形下暴露于上述实施例2.4中不同浓度的硝酸盐溶液和亚硝酸盐溶液中均导致硝化。实施例5:临床试验以单次剂量、溶液形式给AXt象施用临^4目关剂量的化合物lA。在数量可观的对象中检测到了硝化反应产物。当以肠溶包衣片的形式施用所述化合物时，观察到了硝化产物的显著降低。权利要求1.一种适于口服施用的药物组合物，其包含(i)式I化合物，或其药学上可接受的盐或酯式I其中z是H或能被NO2通过基于亚硝酸盐的硝化反应而取代的可替代基团；R1选自氢、卤素、三氟甲基或1至6个碳的烷基或3至7个碳的环烷基；X是氧(-O-)、硫(-S-)、羰基(-CO-)、亚甲基(-CH2-)、或-NH-；R2和R3相同或不同，并且是氢、卤素、1至4个碳的烷基或3至6个碳的环烷基，R2和R3中至少一个不是氢；R4是氢或低级烷基；A是氧(-O-)、亚甲基(-CH2-)、-CONR5-、-NR5-或-NR5CO-；R5是H或低级烷基；R6是羧酸(-CO2H)或其酯或其前药；Y是-(CH2)n，其中n是0、1、2、3、4或5，其中一个或多个所述CH2基可以任选地被卤素取代，或者Y是-C＝C-，其可以是顺式或反式的；和R7是氢、或烷酰基或芳酰基，或者R7是能通过生物转化而产生其中R7＝H的游离酚结构的其它基团；(ii)至少一种药学上可接受的赋形剂；和(iii)肠溶包衣。2.权利要求1的组合物，其中X是氧或-CHr。3.权利要求1或2的组合物，其中A是-NH-、-0-、-CH2-或-CONRs-。4.前述权利要求中任一项的组合物，其中&是H、碘或异丙基。5.前述权利要求中任一项的组合物，其中R2和R3各自独立地是囟素或烷基。6.权利要求5的组合物，其中R2和R3各自独立地是C1、Br、I或曱基。7.前述权利要求中任一项的组合物，其中R4是H或曱基。8.前述权利要求中任一项的组合物，其中Y是-(CH2)n,n是l或2。9.前述权利要求中任一项的组合物，其中A是-NRsCO-，Rs是H。10.前述权利要求中任一项的组合物，其中Z是H。11.权利要求l的组合物，其中化合物(i)选自TRIACD1TPA或其药学上可接受的盐或酯。12.权利要求ll的组合物，其中化合物(i)是3或其药学上可接受的盐或酯。13.权利要求ll的组合物，其中化合物(i)是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>或其药学上可接受的盐或酯。14.前述权利要求中任一项的组合物，其中在含有化合物(i)的组合物部分和肠溶包衣(m)之间提供惰性包衣。15.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述肠溶包衣包含丙烯酸酯聚合物、甲基丙烯酸酯聚合物或丙烯酸酯-曱基丙烯酸酯共聚物。16.前述权利要求中任一项的组合物，其是肠溶包衣片形式并且包含以下成分甘露醇、微晶纤维素、羟丙曱基纤维素、硬脂酸镁、水、曱基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物(1:1)、滑石和柠檬酸三乙酯。17.前述权利要求中任一项的组合物，其中当利用USP仪器II在500ml模拟胃液或0.1NHC1中37*€下以50转/分钟的搅拌速度测量释放时，5%或更少的式1化合物在至少1小时内释放。18.前述权利要求中任一项的组合物，其还包含抗氧化剂。19.权利要求18的组合物，其中所述抗氧化剂选自抗坏血酸、富马酸、苹果酸、丙酸、或任何所述酸的盐、单硫代甘油、焦亚硫酸钾、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、ct-生育酚、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯曱醚、丁基化羟基甲苯、油酸乙酯和没食子酸丙酯。20.权利要求18或19的组合物，其中化合物(i)和抗氧化剂基本上4皮均一地混合。21.—种适于口服施用的药物组合物，其包含(i)式I化合物，或其药学上可接受的盐或酯:式I其中Z是H或能被N02通过基于亚硝酸盐的硝化反应而取代的可替代基团；Ri选自氢、卤素、三氟甲基或1至6个碳的烷基或3至7个碳的环烷基；X是氧(-O-)、硫(-S-)、羰基(-CO-)、亚甲基(-CH2-)、或-NH-;R2和R3相同或不同，并且是氢、卣素、l至4个碳的烷基或3至6个碳的环烷基，R2和R3中至少一个不是氢；R4是氢或低级烷基;A是氧(國O隱)、亚甲基(國CHr)、画CONRs画、-NR5-i^-NR5CO-;Rs是H或低级烷基；R6是羧酸(-C02H)或其酯或其前药；Y是-(CH2)n，其中n是0、1、2、3、4或5，其中一个或多个所述CH2基可以任选地被囟素取代，或者Y是-C-C-，其可以是顺式或反式的；和R7是氢、或烷酰基或芳酰基；或者R7是能通过生物转化而产生其中R7=H的游离酚结构的其它基团；(ii)至少一种抗氧化剂；和(iii)至少一种药学上可接受的赋形剂。22.权利要求21的组合物，其中化合物(i)如权利要求2至13中23.权利要求21或权利要求22的组合物，其是固体组合物。24.权利要求21至23中任一项的组合物，其中所述抗氧化剂基本上均一地与所述化合物(i)相混合。25.权利要求21至24中任一项的组合物，其中所述抗氧化剂选自抗坏血酸、富马酸、苹果酸、丙酸、或任何所述酸的盐、单硫代甘油、焦亚硫酸钾、亚硫酸氩钠、亚硫酸钠、焦亚石克酸钠、a-生育酚、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、油酸乙酯和没食子酸丙酯。26.权利要求18至25中任一项的组合物，其中所述抗氧化剂以0.0001至15mmol/剂的量存在。27.权利要求1至26中任一项的组合物，其还包含选自以下的药理学活性成分降血脂剂、抗糖尿病药、抗抑郁剂、骨吸收抑制剂、食欲抑制剂和/或抗肥胖剂。28.—种稳定适于口服施用的药物组合物的方法，所述药物组合物包含(i)权利要求1至13中任一项所定义的式I化合物或其药学上可接受的盐或酯；和(ii)至少一种药学上可接受的赋形剂；所述方法包括提供具有肠溶包衣的组合物。29.肠溶包衣在适于口服施用的药物组合物中用于降低或防止所述化合物硝化的用途，其中所述药物组合物含有权利要求1至13中任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或酯。30.抗氧化剂在适于口服施用的药物组合物中用于降低或防止所述化合物硝化的用途，其中所述药物组合物含有权利要求1至13中任一项所定义的式I化合物或其药学上可接受的盐或酯。31.用于治疗的权利要求1至27中任一项的组合物。32.权利要求1至27中任一项的组合物在制备用于预防、抑制或治疗与代谢异常相关的疾病或依赖于三碘甲状腺原氨酸(T3)所调节基因之表达的疾病的药物中的用途。33.—种预防、抑制或治疗与代谢异常相关的疾病或依赖于三碘甲状腺原氨酸(T3)所调节基因之表达的疾病的方法，所述方法包括给需要这样的预防、抑制或治疗的对象施用权利要求1至26中任一项的组合物。34.—种适于口服施用的联用药物，其包含(1)第一药物组合物，其包含权利要求1至13中任一项所定义的式l化合物或其药学上可^r受的盐或酯；和(2)第二药物组合物，其包含至少一种抗氧化剂，其中所述第一药物组合物和第二药物组合物各自包含至少一种药学上可接受的赋形剂，其中所述第一药物组合物和第二药物组合物可被同时、序贯或分开施用。全文摘要本发明描述了一种组合物，其中某些结合甲状腺激素受体的化合物与肠溶包衣、抗氧化剂或肠溶包衣和抗氧化剂二者配制在一起。这样的制剂用于防止在体内形成不期望的反应产物。文档编号A61K31/185GK101426488SQ200780010966公开日2009年5月6日申请日期2007年3月27日优先权日2006年3月28日发明者威廉·N·沃什伯恩,尼拉伊·加尔格,康拉德·克勒,拉介什·B·甘迪,文卡特拉马纳·M·拉奥,约翰·马尔姆申请人:卡罗生物股份公司;布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司