专利名称：保护心脏的δ类阿片受体激动剂和使用该激动剂的方法
背景技术：
发明领域本发明涉及用于心脏保护治疗的组合物和方法，更特别地，涉及调和缺血预处理的心脏保护效果的非肽δ类阿片受体激动剂化合物。
相关技术描述失去血和氧的组织会遭受缺血性坏死或梗塞，并伴有可能的不可逆器官损害。在幸免于心肌梗塞的病人中，由于缺血损害而表现出活心肌层减少。然而，相对于那些没有绞痛的人，有绞痛的人在心脏病发作前由于流向心肌的氧气减少而显示出较少的心肌层组织损害。因此，短暂的缺血具有保护心肌免受缺血损害的效果。
缺血预处理(PC)是一种在很多物种包括人类中被普遍证实的现象，由此通过预先短暂的局部缺血或缺氧，随后进行再灌注和再充氧来保护心肌不受严重缺血事故的影响。使用短持续时间、短暂的缺血来避免随后更长时间的缺血事故的损害已经被Murry等人。证实(Circulation，1986741124-1136)。试验结果表明，在严重长期缺血事故前已经用短期缺血进行预处理的犬类心脏中组织坏死减少了约30％。缺血预处理现象在用于治疗患有缺血性心脏病的病人方面已引起极大的临床关注。
缺血预处理需要身体上血液供应减少，这对大多数病人来说是困难的或不切实际的。已经发现锻炼具有持续约24小时的缺血预处理的效果，但很多病人身体上不能达到从缺血预处理中受益所需的心输出量水平。在冠状动脉架搭桥手术之前由大动脉搭桥引起的间歇缺血已经被用作缺血预处理的临床应用。已经发现在手术过程之后，有过心肌预处理的病人的心输出量显著较高。相对于没有预处理的病人，预处理过的病人还显示出改善的手术后血液动力学行为。然而，多个潜在的问题和大动脉搭桥以实现向心肌的供血减少相关，因此，需要具有一种通过药理学方法加强缺血预处理的治疗。
已经确定许多膜受体与预处理有关，包括类阿片受体。三个主要的类阿片受体亚型为μ、κ和δ。δ类阿片受体刺激在即使不冬眠的动物中也能模仿自然的冬眠，已经被报道能够在向组织供氧最小时提高组织存活。同样地，还证明了δ类阿片受体刺激与缺血预处理有关。利用肽和非肽δ类阿片受体激动剂诱导缺血预处理的效果进行了大量研究。Schultz和Gross(U.S.Patent No.6,103,722)测试了许多表现出缺血预处理效果的非肽δ类阿片受体化合物，包括(-)-2-甲基-4a.α-(3-羟苯基)-1，2，3，4，4a，5，12，12a.β-八氢喹啉并[2，3]异喹啉(TAN67(-))；(±)-4-((αR*)-α-((2S*，5R*)-4-烯丙基-2，5-二甲基-1-哌嗪基)-3-羟苄基)-N，N二乙基苯甲酰胺(BW373U86)；and(+)-4-[(αR)-α-((2S，5R)-4-烯丙基-2，5-二甲基-1-哌嗪基)-3-甲氧基苄基]-N，N-二乙基苯甲酰胺(SNC80).
然而，这些非肽化合物不是没有问题，尤其是因为这些化合物被认为是止痛药，并且已经知道几种化合物由于这些化合物通过血脑屏障而导致服药对象的发作。
同样地，需要具有一种通过药理学方法加强缺血预处理的治疗，该治疗避免了与向心肌供血减少相关的问题以及施用一些δ类阿片受体激动剂化合物导致的潜在发作。
发明概述一方面，本发明涉及治疗缺血损害和/或实现缺血预处理的治疗组合物，该组合物包含有效量的下式的二芳基甲基哌嗪化合物或其药学上可接受的酯或盐
其中Z选自由以下基团氢；卤素；C1-C6烷基，C2-C6烯基，C2-C6炔基；C1-C6卤代烷基；C1-C6烷氧基；C3-C6环烷氧基；具有式SR8的硫化物，其中R8为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、具有C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳基烷基、或C5-C10芳基；具有式SOR8的亚砜，其中R8同上所述；具有式SO2R8的砜，其中R8同上所述；腈；C1-C6酰基；具有式NHCO2R8的烷氧羰基氨基(氨甲酰基)，其中R8同上所述；羧酸、或其酯、酰胺或盐；具有式CH2NR9R10的氨甲基，其中R9和R10可以相同或不同，并且可以为氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C2-C6羟烷基、C2-C6甲氧烷基、C3-C6环烷基或C5-C10芳基，或者R9和R10共同形成5或6个原子的环，环上的原子选自N和C组成的组；具有式CONR9R10的氨甲酰基，其中R9和R10同上所述，或其C2-C30肽共轭物；和具有式SO2NR9R10的磺酰胺，其中R9和R10同上所述；和X选自由氢、羟基、卤素和烷氧基组成的组。
本发明的另一方面涉及一种减轻患者中缺血损害的方法，该方法包括施用有效量的治疗组合物，该治疗组合物包括下式的二芳基甲基哌嗪化合物 或其药学可接受的盐或酯。
本发明的还一方面涉及一种减轻患者中缺血损害和/或实现缺血预处理的方法，该方法包括给所述患者施用有效量的下式的δ类阿片受体
或其药学可接受的盐或酯。
优选地，本发明的二芳基甲基哌嗪化合物为主要作用于外周δ类阿片受体的非止痛化合物。二芳基甲基哌嗪化合物可以在几个不同的有效时间段施用，包括与缺血事故发作同时；在缺血发作前作为预防疗法来防止那些处于缺血性心脏病症状阶段的病人的疾病的发展；可能有血块或其它类型心脏缺血危险的病人的手术前；或在缺血事故发作之后；本发明化合物的功效可以采用受影响区域的非侵害性临床成像方法例如核磁共振(MRI)成像以确定损害面积的大小进行评价。
另一方面，本发明涉及能保持离体器官存活能力的溶液，该溶液包含下式的化合物 或其药学可接受的盐或酯，且浓度能有效地保护器官免受缺血损伤。离体器官可以包括但不限于心脏、肝脏、肾脏、角膜和/或肺。
治疗组合物可以通过任何合适的给药方式施用，例如，选自下组的给药形式包括口服、直肠、局部、舌下、粘膜、鼻、眼、皮下、肌内、静脉内、透皮、脊椎、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管、淋巴和子宫内给药。
本发明的又一方面涉及哺乳动物中抗长期缺血发作和再灌注损伤的方法，该方法包括施用有效量的下式的δ类阿片受体激动剂 或其药学可接受的酯或盐；和具有抗缺血效果的第二种化合物，包括用于抵抗缺血事故后心脏功能下降的盐酸精氨酸，和其它起类似作用的氧化一氮潜在源。
本发明的各种其它方面、特征和实施方式将在接下来的公开内容和附加权利要求中变得更充分明显。
附图简述
图1显示了在对照和治疗动物中梗塞大小的组织学样本。
发明详述及其优选实施方案在本发明的主要方面，给患者施用在下文中更充分描述的二芳基甲基哌嗪化合物以调和缺血预处理，由此达到组织坏死减少、缺血后收缩功能改善以及缺血后节律障碍发生减少。根据本发明的治疗可有利地包括单一疗法治疗，其中将本发明的化合物作为治疗组合物中的单一治疗药剂施用，或联合疗法治疗，其中可与其它被施用以调和矫正性或保护性心脏反应的心脏治疗药剂同期如同时或依次地施用根据本发明的组合物。其它的心脏治疗药剂可包括但不限于硝酸盐、β-肾上腺素阻断剂、钙通道拮抗剂、ACE抑制剂、非肽血管紧张素II拮抗剂、IIb/IIIa拮抗剂和阿司匹林。
根据本发明，本文使用的术语“烷基”旨在被广泛地理解为包括(i)具有直链和支链特征的烷基；(ii)未取代和取代的烷基，其中取代烷基的取代基可包括任何与这种烷基相适合并且不会妨碍二芳基甲基哌嗪化合物预定用途的疗效的空间上可接受的取代基(取代烷基的取代基例子包括卤素(如氟、氯、溴和碘)、氨基、酰氨基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、硝基、羟基等)；(iii)饱和烷基和不饱和烷基，后者包括基团如烯基取代的烷基(如烯丙基、甲代烯丙基、丙代烯丙基(propallyl)、丁烯基甲基等)、炔基取代的烷基和任何其它与这种烷基相适合并且不会妨碍二芳基甲基哌嗪化合物预定用途的疗效的含有空间上可接受的不饱和度的烷基；和(iv)包括键合或桥接部分例如杂原子如氮、氧、硫等的烷基。
根据本发明，本文使用的术语“芳基”旨在被广泛地理解为是指碳环(如苯基、萘基)和杂环芳香基(如吡啶基、噻吩基、呋喃基等)，并包括未取代和取代的芳基，其中取代芳基的取代基可包括与这种芳基相适合并且不会妨碍二芳基甲基哌嗪δ类阿片受体激动剂预定用途的疗效的任何空间上可接受的取代基。取代芳基的取代基例子包括氢、一种或多种卤素(如氟、氯、溴和碘)、氨基、酰氨基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、硝基、三氟甲基、羟基、包含C1-C4烷基部分的羟烷基等。
式(1)、(2)和(3)的化合物的药学上可接受酯的例子包括式(1)中X＝OH的化合物中羟基的羧酸酯，和式(2)和(3)化合物中羟基的羧酸酯，其中酯基团中羧酸部分的非羰基部分选自直链或支链烷基(如正丙基、叔丁基、正丁基)、烷氧烷基(如甲氧基甲基)、芳基烷基(如苄基)、芳氧基烷基(如苯氧基甲基)和芳基(如苯基)；烷基磺酰基、芳基磺酰基或芳基烷基磺酰基(如甲基磺酰基)；氨基酸酯(如L-缬氨酰或L-异亮氨酰)；二羧酸酯(如半琥珀酸酯)；碳酸酯(如乙氧羰基)；氨基甲酸酯(如二甲基甲酰胺、(2-氨乙基)甲酰胺)；和无机酯(如一磷酸酯-、二磷酸酯或三磷酸酯)。
式(1)、(2)和(3)的化合物的药学上可接受的盐的例子包括来源于合适的碱的盐，所述碱如碱金属(例如钠、钾)、碱土金属(例如钙、镁)、铵和NR’4+(其中R’为C1-C4烷基)。氨基的药学上可接受的盐包括以下物质的盐有机羧酸如醋酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、乳糖酸、富马酸和琥珀酸；有机磺酸如甲基磺酸、乙基磺酸、羟乙磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸；和无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸和氨基磺酸。具有羟基的化合物的药学上可接受的盐由所述化合物的阴离子结合适当的阳离子如Na+、NH4+或NR’4+(其中R’为例如C1-4烷基)组成。
本发明还考虑兽医用和人医用的药物制剂，该药物制剂包含本发明的一种或多种二芳基甲基哌嗪化合物作为活性剂。
在这种药物制剂中，活性剂优选与一种或多种为此使用的药学上可接受的载体和任选的任何其它治疗成分一起使用。从与制剂中其它成分相适合的意义上讲，载体必须是药学上可接受的，并不会对其接受者过度有害。如上所述，提供有效量的活性剂以获得最佳的药理学作用，并提供适宜的量以获得最佳日剂量。
制剂包括适于肠胃外给药和非肠胃外给药的那些，具体的给药方式包括口服、直肠、局部、舌下、粘膜、鼻、眼、皮下、肌内、静脉内、透皮、脊椎、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管、淋巴和子宫内给药。
当在包括液体溶液的制剂中使用二芳基甲基哌嗪化合物时，可有利地在肠胃外施用该制剂。当在液体悬浮液制剂中或作为生物相容载体制剂中的粉剂使用二芳基甲基哌嗪化合物时，可有利地经口服、直肠或支气管施用制剂。
当直接以粉状固体的形式使用二芳基甲基哌嗪化合物时，可有利地口服施用。可选择地，通过载气中粉末雾化，经支气管施用，以形成能由病人从包括适当喷雾器装置的呼吸线路中吸入的气态分散物。
在有些应用中，可有利地以“向量化”形式使用二芳基甲基哌嗪化合物，如在脂质体或其它胶囊密封介质中密封活性剂，或在适当的生物分子如选自蛋白质、脂蛋白、糖蛋白和多糖的那些分子上例如通过共价键、螯合作用或联合配位来固定活性剂。
可便利地以单元剂型形式提供包含本发明二芳基甲基哌嗪化合物的制剂，并可通过药剂学领域中众所周知的任何一种方法来制备。这些方法通常包括将二芳基甲基哌嗪化合物与构成一种或多种助剂的载体进行缔合的步骤。典型地，通过均匀且密切地将二芳基甲基哌嗪化合物与液体载体、细碎的固体载体或二者进行缔合，然后，根据需要，将产物成形为所需制剂的剂型来制备制剂。
可以以分散单元如胶囊、扁囊剂、片剂或锭剂的形式提供本发明的适于口服给药的制剂，其各自包含预定量的二芳基甲基哌嗪化合物作为粉剂或颗粒剂；或以水溶液或非水液体的悬浮液提供，如糖浆、酏剂、乳剂或顿服剂。
可通过压缩或模压制成片剂，任选地加入一种或多种助剂。可通过在合适的机器上压缩来制备压缩片剂，其中二芳基甲基哌嗪化合物为自由流动形式如粉末或颗粒，并任选地与粘合剂、崩解剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或拔染剂混合。可通过在合适的机器上模压来制成包含粉状二芳基甲基哌嗪化合物和适当载体的混合物的模压片剂。
可通过向糖如蔗糖的浓缩水溶液中加入本发明的化合物来制成糖浆，还可向该糖浆中加入任何助剂。这类助剂可包括调味剂、合适的防腐剂、防止糖结晶剂和提高任何其它成分溶解度的药剂，如多羟基醇，例如丙三醇或山梨糖醇。
适于肠胃外给药的制剂便利地包括本发明化合物的无菌水制剂，该制剂优选地与接受者的血液浓度相同(如生理盐水溶液)。这类制剂可包括悬浮剂、增稠剂和脂质体或其它被设计为使化合物达到血液成分或一种或多种器官的微颗粒体系。可以以单位剂量或多剂量形式提供制剂。
鼻喷雾制剂包括具有防腐剂和等渗剂的本发明化合物的纯化水溶液。优选将这类制剂调节到与鼻粘膜相适应的pH和等渗状态。
可以以具有合适载体如可可脂、氢化脂或氢化脂肪羧酸的栓剂形式提供用于直肠给药的制剂。
通过与鼻喷雾剂类似的方法制备眼用制剂，除了优选将pH和等渗因子调整到与眼匹配。
局部用制剂包括溶于或悬浮于一种或多种介质如矿物油、石油、多羟基醇的本发明化合物、或其它用于局部药物制剂的主要成分。
通过在触变或凝胶状载体如纤维素类介质例如甲基纤维素或羟乙基纤维素中混入本发明化合物，来制备透皮制剂，然后在透皮设备中包装得到的制剂，以确保与穿戴者皮肤接触时的安全。
除了上述成分，本发明的制剂还可包括一种或多种助剂，其选自稀释剂、缓冲剂、调味剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等。
有时，为了延长本发明的二芳基甲基哌嗪化合物的效果，需要减缓从皮下或肌肉注射时二芳基甲基哌嗪化合物的吸收。这可以通过使用水溶解性差的晶体或无定形材料的液体悬浮液来实现。于是二芳基甲基哌嗪化合物的吸收速率取决于其溶解速率，其又取决于晶体大小和结晶形式。可选择地，肠胃外施用的二芳基甲基哌嗪化合物的延时吸收通过在油性媒介物中溶解或悬浮药物实现。
可通过在可生物降解聚合物如聚交酯-聚乙交酯中形成至少一种本发明化合物的微胶囊基质来制备可注射的贮存形式。根据活性组分和聚合物的比例，和所采用的具体的聚合物的特性，可以控制活性组分的释放速率。其它可生物降解聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酐)。贮存可注射制剂也通过将活性组分装在和身体组织相容的脂质体或微乳中制备。可注射材料可以通过例如用细菌保留过滤器过滤来灭菌。
根据治疗的具体情况，可以以任何合适的治疗上有效且安全的剂量给动物患者施用本发明的化合物，这可由本领域内的熟练技术人员容易地确定，并不需要过度的试验。
通常，尽管根据所涉及的具体条件，在本发明的主要实施中可很大程度地改变治疗使用的本发明化合物的有效剂量，这可由本领域内的熟练技术人员容易地确定，但是对于本文描述的每一种附属组合物，以及为获得本文所述每种条件下的治疗中的治疗益处，本发明化合物的适宜治疗剂量在10微克(μg)至100毫克(mg)/千克接受者体重/天的范围内，优选在50μg至75mg/千克体重/天的范围内，最优选在100μg至50mg/千克体重/天的范围内。可在全天的适宜间隔内施用二次、三次、四次、五次、六次或更多次子剂量的方式提供所需剂量，尤其是快要手术时。此外，单一剂量时间的选择优选在缺血发作后直到4小时内。需要的剂量可重复多次以为心肌提供更多的对任何后续更长时间缺血发作的抵抗力。
以下实施例说明了可有利地用于合成本发明化合物的合成过程。
实施例14-{(2R，5S)-4-[(R)-(4-二乙基氨基甲酰基苯基)(3-羟基苯基)甲基]-2，5-二甲基-1-哌嗪基甲基}苯甲酸 在室温下将3-溴苯酚(400g，2.31mol)、叔丁基氯代二甲基硅烷(391mg，2.54mol)和咪唑(346g，5.08mol)的5000mL二氯甲烷溶液搅拌过夜。将反应溶液倒入2000mL水中，分层。在通过硅胶填料(400g，二氧化硅60，230-400目)前，用1N氢氧化钠水溶液(3×1500mL)和水(2×1500mL)洗涤有机层。用二氯甲烷(2×500mL)洗涤硅胶，合并滤液，并在减压下除去溶剂，得到669g(98.4％)透明浅黄色液体状的3-溴代苯氧基-叔丁基二甲基硅烷。1H NMR(300MHz，CDCl3)7.1(m，2H)；7.0(br s，1H)；6.75(m，1H)；1.0(s，9H)；δ0.2(s，6H)。
在回流下将3-溴代苯氧基-叔丁基二甲基硅烷(45.97g，160mmol)和1，2-二溴乙烷(6.01g，32mmol)混合物的150mL无抑制剂的无水四氢呋喃溶液缓慢加入到镁屑混合物(4.28g，176mmol)的400mL无抑制剂的无水四氢呋喃溶液中，形成3-叔丁基二甲基甲硅烷氧苯基溴化镁。在回流下搅拌1小时后，将透明浅棕色溶液冷却到室温。
将4-羧基苯甲醛(100.3g，0.67mol)溶解/悬浮在甲苯(1200mL)中，加入N，N-二甲基甲酰胺(0.15mL)，并在滴加亚硫酰氯(53.5mL，87.2g，0.73mol)时搅拌悬浮液。在氮气下加热反应混合物以回流，并搅拌2小时，其间大量但不是全部醛酸进入溶液。再加入一定量的亚硫酰氯(20mL，32.6g，0.27mol)并回流持续过夜。蒸发透明的反应混合物，并将残余物溶解到无水四氢呋喃(1500mL)中。在冰/水浴中冷却溶液，并向搅拌的溶液中滴加二乙胺(173mL，122g，1.67mol(2.5当量))。移去冰浴并持续搅拌2.5小时。过滤反应混合物以除去白色结晶二乙胺氢氯化物副产物。用乙酸乙酯(2×600mL)洗涤晶体，并留下洗涤物。蒸发四氢呋喃滤出液，并将残余物溶解在乙酸乙酯洗涤物中。依次用1M盐酸(2×600mL)、水(2×300mL)、稀释的碳酸钠溶液(饱和液∶H20/1∶1，2×600mL)、水(2×300mL)和饱和氯化钠溶液(300mL)洗涤溶液。分离有机层，在无水硫酸钠上干燥并蒸发产生淡褐色油状的4-甲酰-N，N-二乙基苯甲酰胺，使用其时无需进一步纯化。(收率115.7g，84％)在装有冷凝器和Dean-Stark收集器的3L圆底烧瓶中，将4-甲酰-N，N-二乙基苯甲酰胺(20.53g，100mmol)、苯并三唑(11.91g，100mmol)和(2R，5S)-1-烯丙基-2，5-二甲基哌嗪(15.43g，100mmol，ChirotechTechnology，Ltd.，Cambridge，England)用1000mL甲苯混合。在氮气下加热反应物以回流，直到在收集器中观察不到额外的水(大约3小时)。将反应物冷却至室温，并在真空下浓缩留下大约300mL的体积。在氮气下向苯并三唑加合物中加入无水四氢呋喃(500mL)并搅拌得到完全的溶液。在室温下通过双头针将该溶液加入到溴化3-叔丁基二甲基甲硅烷氧苯基镁(上述)的溶液中。搅拌1.5小时后，通过加入饱和氯化铵水溶液(50mL)来结束反应，并搅拌15分钟。加入无水硫酸镁(50g)，搅拌1.5小时，并过滤反应物。在减压下除去溶剂并将残余物溶解到乙酸乙酯(1000mL)中。用1M氢氧化钠(5×400mL)、水(4×400mL)和饱和氯化钠水溶液(400mL)洗涤乙酸乙酯溶液。在无水硫酸镁上干燥有机层，并除去溶剂得到深色油。将油溶解在500mL四氢呋喃和300mL3M盐酸中，并在室温下搅拌1.5小时。用水(300mL)稀释反应，并在真空下浓缩至约原体积的一半。用戊烷(2×500mL)萃取溶液。用5M氢氧化钠将水溶液层调节到PH8-9并用乙酸乙酯(250Ml)萃取。分离层，并用另外的乙酸乙酯(250mL)萃取含水部分。用饱和氯化钠水溶液洗涤合并的有机萃取物，在无水硫酸钠上干燥，并在减压下除去溶剂得到褐色油。将该残留物溶解在乙酸乙酯中(25mL)，用可靠的化合物的晶体接晶种，并结晶过夜(Michael J.Bishop and Robert W.McNutt，Seed Crystals Obtained From Hot 2-propanol With Addition of Water，Bioorg.Med.Chem.Lett.(1995)，5，1311-14)。将晶体进行过滤，用少量冷乙酸乙酯洗涤固体。在5mmHg和室温下进行干燥产生白色晶体状的4-[(R)-((2S，5R)-4-烯丙基-2，5-二甲基-1-哌嗪基)(3-羟苯基)甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺。产品在HPLC上显示单峰(Zorbax RX C8，4.6mm×25cm，MeOH中等浓度的40％0.01M NH4OAc，3分钟；线性梯度至100％MeOH，45分钟；等浓度的MeOH，5分钟；1.0mL/min；obs＝210nm，Rt＝32.21min)。C27H37N3O2的计算值％C，74.45；H，8.56；N，9.65.测量值％C，74.48；H，8.60；N，9.62.1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.42(d，J＝8.1Hz，2H)；7.28(d，J＝8.4Hz，2H)；7.08(t，J＝7.8Hz，1H)；6.64-6.57(m，3H)；5.94-5.83(m，1H)；5.22(d，J＝8.7Hz，1H)；5.18(s，1H)；5.14(br s，1H)；3.60-3.47(m，2H)；3.42(dd，J＝5.2，13.7Hz，1H)；3.37-3.20(br m，2H)；2.91(dd，J＝8.1，13.5Hz，1H)；2.85(dd，J＝2.6，11.4Hz，1H)；2.70-2.47(m，3H)；2.17(t，J＝10.7Hz，1H)；1.98(t，J＝11.1Hz，1H)；1.23(m，3H)；1.14(d，J＝6.1Hz，3H，与m，3H重叠)；1.02(d，J＝6.2Hz，3H).
在氮气和室温下，使用催化剂溶液将4-[(R)-((2S，5R)-4-烯丙基-2，5-二甲基-1-哌嗪基)(3-羟苯基)-甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺(10.89g，25mmol)和硫代水杨酸(4.63g，30mmol)的无水四氢呋喃(50mL)溶液搅拌1.5小时，该催化剂溶液通过在四氢呋喃(10mL)中溶解双(二亚苄基丙酮)钯(0.718g，1.25mmol)和1，4-双(二苯基膦基)丁烷(0.533mg，1.25mmol)来制备。(J.P.Genet，S.Lemaire-Audoire，M.Savignac，Tetrahedron Letters，36，1267-1270(1995))。在减压下浓缩反应混合物，在乙酸乙酯(150mL)和碳酸钠水溶液间分配残余物。分离层，向有机层中加入二乙醚(250mL)。用5％碳酸钠溶液(2×150mL)萃取有机层。用戊烷(500mL)稀释有机层，并用3M盐酸(6×30mL)萃取。使用饱和碳酸钠水溶液将该水溶液调整到pH9-10，并用二氯甲烷(3×100mL)萃取。在无水硫酸钠上干燥合并的有机萃取物，并在减压下除去溶剂，得到易碎浅黄色泡沫体状的4-[(R)-((2S，5R)-2，5-二甲基-1-哌嗪基)(3-羟苯基)甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺(10.24g)。产品在HPLC上显示单峰(Zorbax C-8，MeOH中等浓度的40％0.01M NH4OAc，3分钟；线性梯度至100％MeOH，45分钟；等浓度的MeOH，5分钟；1.0mL/min；obs＝210nm，Rt＝19.24min)。C24H33N3O20.1EtOAc·0.4CH2Cl2的计算值％C，67.96；H，7.96；N，9.59.测量值％C，67.90；H，8.03；N，9.54.1HNMR(CDCl3，300MHz)δ7.42(d，J＝8.1Hz，2H)；7.26(d，J＝8.3Hz，2H)；7.11(t，J＝7.8Hz，1H)；6.72(d，J＝8.1Hz，1H)；6.65(s，1H)；6.59(d，J＝7.6Hz，1H)；5.16(s，1H)；4.93(v br s，2H)；3.51(br m，2H)；3.27(br m，2H)；3.02-2.97(m，1H)；2.92(d，J＝10.5Hz，1H)；2.66(br d，J＝8.5Hz，2H)；2.60-2.45(m，1H)；1.84(dd，J＝11.3，8.3Hz，1H)；1.27-1.15(m，3H)；1.10(d，J＝6.1Hz，3H与m，3H重叠)；1.02(d，J＝6.1Hz，3H).
4-{(2R，5S)-4-[(R)-(4-二乙基氨基甲酰基苯基)(3-羟苯基)甲基]-2，5-二甲基-1-哌嗪甲基}苯甲酸方法A还原性烷基化将冰醋酸(0.635mL，11.1mmol)加入到4-[(R)-((2S，5R)-2，5-二甲基-1-哌嗪基)-(3-羟苯基)甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺(1.98g，5mmol)和4-羧基苯甲醛(1.50g，10mmol)的无水四氢呋喃(35mL)溶液中。在轻轻搅拌下，以50-100mg分份加入三乙酸硼氢化钠(2.12g，10mmol)，在每次添加后允许起泡消退。用HPLC检测反应不存在原料。在室温下搅拌16小时后，加入另外的4-羧基苯甲醛(0.75g，5mmol)，乙酸(0.318mL，5mmol)和三乙酸氢硼化钠(1.06g，5mmol)。再搅拌4小时后，在减压下浓缩反应混合物，在乙酸乙酯(50mL)和3M盐酸(10mL)间分配残余物。分离层，用3M盐酸(5×10mL)再次萃取有机层。使用饱和碳酸钠水溶液将该水溶液调整到pH4.5-5，并用二氯甲烷(3×50mL)萃取。在无水硫酸钠上干燥合并的有机萃取物，并在减压下除去溶剂，得到易碎白色泡沫体状的4-{(2R，5S)-4-[(R)-(4-二乙基氨基甲酰基苯基)(3-羟苯基)甲基]-2，5-二甲基-1-哌嗪基-甲基}苯甲酸(2.34g)。产品在HPLC上显示单峰(Zorbax RX-C8，4.6mm×25cm，MeOH中等浓度的40％0.01M NH4OAc，3分钟；线性梯度至100％MeOH，45分钟；等浓度的MeOH，5分钟；1.0mL/min；obs＝210nm，Rt＝13.75min)。
将4-{(2R，5S)-4-[(R)-(4-二乙基氨基甲酰基苯基)(3-羟苯基)甲基]-2，5-二甲基-1-哌嗪基-甲基}苯甲酸(2.09g，3.5mmol)溶解到乙醇(6mL)中，并加入0.986N盐酸(3.60mL)。用蒸馏水(30mL)稀释该溶液，过滤，快速冷冻，并冻干得到白色固体(2.17g)C32H39N3O4·1.6HCl·1.6H2O计算值％C，62.31；H，7.16；N，6.81；Cl，9.20.测量值％C，62.32；H，7.19；N，6.74；Cl，9.28.1H NMR(D2O+50％v/v 1-MNaOD in D2O，300MHz)δ7.57(d，J＝8.1Hz，2H)；7.17(d，J＝8.0Hz，2H)；7.11(d，J＝8.1Hz，2H)；6.99(d，J＝8.1Hz，2H)；6.81(t，J＝7.8Hz，1H)；6.30(s，1H)；6.29(部分重叠d，J＝7.5，1H)；6.13(d，J＝7.5Hz，1H)；4.89(s，1H)；3.78(d，J＝12.7Hz，1H)；3.22(q，J＝7.2Hz，2H)；3.05(d，J＝12.9Hz，1H)；2.95(q，J＝7.2Hz，2H)；2.60(d，J＝11.2Hz，1H)；2.35(d，J＝11.4Hz，1H)；2.31-2.19(m，2H)；1.87-1.74(m，2H)；0.94(t，J＝7.3Hz，3H)；0.87(t，J＝7.3Hz，3H)；0.77(d，J＝6.3Hz，3H)；0.75(d，J＝6.3Hz，3H；二者双重线重叠)。
方法B直接烷基化将乙腈(15mL)中的4-[(R)-((2S，5R)-2，5-二甲基-1-哌嗪基)(3-羟苯基)甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺(1.41g，3.56mmol)加到碘化钠(80mg，0.53mmol)中，并在先后加入三乙胺(2.0mL，14.3mmol)和4-(溴代甲基)苯甲酸甲酯期间进行搅拌。在氮气下密封反应混合物，在环境温度下搅拌20小时。在减压下浓缩反应混合物，将残余物在乙酸乙酯(50mL)和水(25mL)之间分配。分离有机层，含水层用乙酸乙酯(3×20mL)萃取。用5％碳酸钠溶液(2×50mL)然后用水(50mL)萃取合并的有机萃取物。有机层用戊烷(100mL)稀释，并用1M盐酸(5×30mL)萃取。使用饱和碳酸钠水溶液将该水溶液调整到pH8.5-9，并用二氯甲烷(3×50mL)进行萃取。在无水硫酸钠和硫酸镁上干燥合并的有机萃取物。在减压下除去溶剂，得到淡黄色固体(1.90g)。将残余物溶解在二氯甲烷(5mL)中，涂在预先充填(4×7cm)的Biotage硅胶柱上并用A在B中的20％至60％溶液梯度进行洗脱[A＝乙酸乙酯和2％NH4OH，B＝二氯甲烷]。在减压下浓缩包含产品的所需馏分[硅胶t.l.c.(EtOAc和2％NH4OH∶CH2Cl2/1∶1)Rf＝0.39]，并在2mmHg和室温下进一步干燥，产生乳白色固体状的4-{(2R，5S)-4-[(R)-(4-二乙基氨基甲酰基苯基)(3-羟苯基)甲基]-2，5-二甲基-1-哌嗪基甲基}苯甲酸甲酯(1.34g)。C33H41N3O4的计算值％C，72.90；H，7.60；N，7.73.测量值％C，72.68；H，7.57；N，7.64.1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.95(d，J＝8.4Hz，2H)；7.44(d，J＝8.1Hz，2H)；7.37(d，J＝8.2Hz，2H)；7.28(d，J＝8.2Hz，2H)；7.14(t，J＝7.8Hz，1H)；6.73-6.69(m，2H)；6.64(s，1H)；6.05(br s，1H)；5.00(s，1H)；3.94(d，J＝14Hz，1H部分和s，3H重叠)；3.89(s，3H)；3.54(br m，2H)；3.29(br m，2H)；3.24(d，J＝14Hz，1H)；2.68-2.53(m，4H)；2.05-1.94(m，2H)；1.26(br m，3H)；1.23(br m，3H)；1.06(重叠d，J＝5.9Hz，3H)；1.04(重叠d，J＝5.9Hz，3H)。
将该固体(0.88g，1.62mmol)溶解在乙醇(10mL)中，以约1mL的等分试样加入2.5M氢氧化钠溶液(6.4mL，16mmol)。在最后加入后，略微浑浊的反应混合物澄清5分钟，产生黄色溶液，在环境温度下搅拌该溶液16小时。用等体积的水稀释该溶液，通过蒸发除去乙醇和估计为50％的水相体积。用3M盐酸将溶液调整到pH4。得到的絮状白色固体通过过滤进行收集，用少量冷水洗涤。在空气干燥后，在5mmHg真空和室温下进一步干燥该固体，产生标题化合物(0.90g，85.9％)。通过HPLC证明该物质和方法A制得的化合物相同。C32H39N3O4·1.5NaCl·1.6H2O的计算值％C，59.48；H，6.58；N，6.50.测量值％C，59.50；H，6.45；N，6.32.1H NMR((d6-DMSO+20％ v/v 1-MNaOD inD2O，300MHz)；δ0.93(d，J＝6.0Hz，3H)；0.98(d，J＝5.9Hz，3H；二者双重线重叠br m，6H)；1.9(m，2H)；2.54(m，2H，因DMSO而部分模糊)；3.13(br m，2H)；3.22(d，J＝14.2Hz，1H)；3.34(br m，2H)；3.71(d，J＝14.0Hz，1H)；4.66(s，1H)；5.97(d，J＝6.9Hz，1H)；6.16(d，J＝7.9，1H)；6.23(s，1H)；6.72(t，J＝7.7Hz，1H)；7.16(d，J＝7.8Hz，4H)；7.38(d，J＝8.1Hz，2H)；7.72(d，J＝8.1Hz，2H).质谱(ESI-，DP-120V，MeOH)；m/z529.0，(M+，100％)；528，((M-1)+，57％)；512.6，((M-17)+，95％)。
实施例24-{(2R，5S)-4-[(S)-(4-二乙基氨基甲酰基苯基)(3-羟苯基)甲基]-2，5-二甲基-1-哌嗪甲基}苯甲酸 在2000mL的三颈圆底烧瓶中称量4-羧基苯甲醛(100g，666mmol)，并在氮气下在1200mL甲苯中搅拌。向混合物中加入亚硫酰氯(53.5mL，733mmol)，然后加入0.15mL二甲基甲酰胺。将装有氯化钙干燥管的回流冷凝器置于烧瓶上。将反应物置于油浴中并在保持低于120℃的浴温下加热。在得到透明溶液后，使混合物回流1小时，然后冷却至室温。用无水甲苯稀释溶液，并在真空下除去所有的挥发物。
将粗酰基氯溶解在1500mL干四氢呋喃中，并在冰/水浴中冷却。通过滴加漏斗逐滴加入二乙胺(173mL，1.67mol，2.5当量)。使浑浊溶液在1小时内升温至室温，并搅拌过夜。过滤反应混合物以除去白色结晶盐酸二乙胺副产物。用乙酸乙酯(2×600mL)洗涤晶体。蒸发四氢呋喃滤液，将残余物溶解在乙酸乙酯洗涤物中。依次用1M盐酸(2×600mL)、水(2×300mL)、稀释的碳酸钠溶液(饱和液∶H2O，1∶1，2×600mL)、水(2×300mL)和饱和氯化钠溶液(300mL)洗涤溶液。分离有机层，在硫酸钠上干燥，在真空下除去溶剂。得到淡黄色油状的4-甲酰-N，N-二乙基苯甲酰胺(117.14g)，使用其时无需进一步纯化(85％未色谱纯化的收率)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.09-1.25(m，6H)；3.19-3.31(d，J＝6.4Hz，2H)；3.54-3.56(d，J＝6.6Hz，2H)；7.49-7.52(d，J＝8.1Hz，2H)；7.89-7.92(d，J＝8.2Hz，2H)；9.98(s，1H).
将3-碘苯酚(110g，500mmol)和咪唑(93.6g，1735mmol，2.75当量)置于2000mL烧瓶中的1150mL干二氯甲烷中，并在氮气下在冰/水浴中冷却到15℃。将200mL干二氯甲烷中的氯化叔丁基二甲基甲硅烷(82.9g，550mmol)通过滴加漏斗逐滴加入到反应物中。在氮气下将反应混合物搅拌过夜，进行过滤，用二氯甲烷洗涤。用水(400mL)、0.4N NaOH溶液(600mL)和水(2×300mL)洗涤合并的萃取物。用Na2SO4/NaCl干燥有机层，蒸发产生淡黄色油(166g)。
在室温和氮气下将3-碘代苯氧基-叔丁基二甲基硅烷(48.85g，146mmol)放入装有180mL干四氢呋喃的250mL烧瓶中。通过滴加漏斗加入异丙基氯化镁(73mL，146mmol，四氢呋喃中2.0M溶液)以形成浅黄色的溶液。在室温下搅拌反应物1小时。期间，在另一个1000mL烧瓶中将30g 4-甲酰-N，N-二乙基苯甲酰胺溶解在300mL干四氢呋喃中，并在氮气下冷却到-72℃。将新制备的3-苯氧基-叔丁基-二甲基硅烷氯化镁缓慢加入到1000mL烧瓶中。监控转移速率以保持反应温度在-70℃以下。使反应物在搅拌过夜时升温至室温。用24mL饱和氯化铵水溶液终止混合物，并用600mL二乙醚稀释，先后用600mL水和150mL饱和氯化钠溶液洗涤。用硫酸钠干燥醚溶液，除去溶剂得到黄色油状的粗4-{[3-(叔丁基二甲基硅烷氧)苯基]羟甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺。粗产率为～100％。粗产品在20％乙酸乙酯戊烷溶液中形成浆液。得到的白色沉淀通过过滤进行收集，用戊烷洗涤，干燥过夜(30mmHg，40℃)。
将4-{[3-(叔丁基二甲基硅烷氧基)苯基]羟甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺(50g，120.9mmol)溶解在800mL二氯甲烷中，逐滴加入13.23mL(181.3mmol)亚硫酰氯。在室温下搅拌反应物溶液5小时，在真空下除去溶剂。用色谱法在硅胶(戊烷中17％EtOAc，然后戊烷中17％EtOAc)上纯化残余的黄色油，得到黄色油状的所需产品22.58g(52.26mmol)。
将纯4-{[3-(叔丁基二甲基硅烷氧基)苯基]氯代甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺(22.58g，52.26mmol)溶解在350mL干乙腈中。加入碘化钠(7.83g，52.26mmol)、二异丙基乙胺(13.69mL，78.39mmol)和(2R，5S)-1-烯丙基-2，5-二甲基哌嗪(8.06g，52.26mmol)。在回流下和氮气下搅拌混合物3小时。在减压下除去乙腈，将反应混合物倒入乙酸乙酯(400mL)和碳酸钾溶液(150mL 2M水溶液)中。分离有机层，用水和盐水洗涤，在固体碳酸钾上干燥，并在真空下浓缩。得到深褐色油状的粗产品(30g)，粗产率为～100％。
用色谱法在硅胶上纯化粗产品得到两种二苯甲基差向异构体。先用20％EtOAc的戊烷进行洗脱，然后逐步采用戊烷中30％、40％、50％和80％的EtOAc洗脱，得到11.00g(20.00mmol)黄色油状的4-{(R)-((2S，5R)-4-烯丙基-2，5-二甲基哌嗪-1-基)[3-(叔丁基二甲基硅烷氧基)苯基]甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺和9.27g 4-{(S)-((2S，5R)-4-烯丙基-2，5-二甲基哌嗪-1-基)[3-(叔丁基二甲基硅烷氧基)-苯基]甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺(16.86mmol，黄色油)。利用薄层色谱法(TLC)与实施例1中描述的已知纯异构体比较来识别这些异构体。
将4-{(S)-(2S，5R)-4-烯丙基-2，5-二甲基哌嗪-1-基)[3-(叔丁基二甲基硅烷氧基)苯基]甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺(9.27g，16.86mmol)先后溶解在35mL干乙腈和氟化四乙胺二水合物(4.69g，25.29mmol)中，搅拌过夜。反应溶液浓缩至干燥，将残余物溶解在40mL乙酸乙酯中，用2％NaHCO3水溶液(3×40mL)和水(40mL)萃取。将有机层在硫酸钠上干燥，蒸发得到8.55g红色无定形固体状的4-{(S)-(2S，5R)-4-烯丙基-2，5-二甲基哌嗪-1-基)[3-羟苯基]甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺。
在硫代水杨酸存在条件下采用实施例1中讨论的Genet的方法用Pd(dba)2/DPPB除去烯丙基。浓缩反应物，将残余物倒入200mL乙酸乙酯和300mL二乙醚中。用340mL水洗涤后，用10％柠檬酸(5×80mL)萃取有机溶液。过滤合并的酸性萃取物以除去少量的悬浮固体，用15％NaOH溶液将pH调整到8-8.5。用二氯甲烷(3×300mL)萃取得到的油状悬浮液。干燥(Na2SO4/MgSO4)合并的有机溶液，在减压下浓缩。残余物为浅橙色的固体。
将4-[(S)-((2S，5R)-2，5-二甲基哌嗪-1-基)(3-羟苯基)甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺(0.51g，1.29mmol)溶解在10mL干乙腈中。加入碘化钠(20mg，0.13mmol)，在先后加入三乙胺(0.72mL，5.16mmol)和4-(溴代甲基)苯甲酸甲酯(0.59g，2.58mmol)过程中在氮气和室温下搅拌反应物。在氮气下将反应混合物搅拌过夜。通过蒸发除去溶剂，在乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠溶液间分配残余物。用水洗涤有机层，在Na2SO4/MgSO4上干燥，在减压下浓缩。用色普法在硅胶(CH2Cl2中50％EtOAc)上纯化残余的浅黄色油，得到0.45g(0.83mmol)白色无定形固体状的4-{(2R，5S)-4-[(S)-(4-二乙基氨基甲酰基苯基)(3-羟苯基)甲基]-2，5-二甲基-1-哌嗪基甲基}-苯甲酸甲酯。
用3mL乙醇中的1mL10％NaOH溶液水解上述酯。蒸发反应混合物至干燥，加入2mL水。用2mL EtOAc/Et2O萃取溶液两次以除去杂质，然后逐滴加入1M HCl至pH4-4.5的沉淀点。形成白色凝胶，通过过滤收集，用少量冷水洗涤。在真空烘箱(30mmHg，40℃)中干燥4-{(2R，5S)-4-[(S)-(4-二乙基氨基甲酰基苯基)(3-羟苯基)甲基]-2，5-二甲基哌嗪-1-基甲基}苯甲酸得到180mg白色固体。1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ0.98-1.16(m，12H)；1.89-2.05(m，2H)；2.48-2.65(m，5H)；3.10-3.50(m，5H)；3.76-3.80(d，J＝13.9Hz，1H)；4.94(s，1H)；6.53-6.95(d，J＝8.0Hz，1H)；6.75-6.85(m，2H)；7.02-7.09(t，1H)；7.29-7.40(m，6H)；7.80-7.84(d，J＝8.3Hz，2H)；9.29(s，1H)。
实施例33-{(2R，5S)-4-[(R)-(4-二乙基氨基甲酰基苯基)(3-羟苯基)甲基]-2，5-二甲基-1-哌嗪基甲基}苯甲酸 将4-{(R)-(2S，5R)-4-烯丙基-2，5-二甲基-哌嗪-1-基)-[3-(叔丁基二甲基硅烷氧基)-苯基]甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺(11.00g，20.0mmol，实施例2)溶解在40mL干乙腈中，加入氟化四乙胺二水合物(5.56g，30.00mmol)，搅拌过夜。将反应溶液浓缩至干燥，将残余物溶解在40mL乙酸乙酯中，用2％NaHCO3水溶液(3×40mL)和水(40mL)进行洗涤。将有机层在硫酸钠上干燥，蒸发得到8.55g红色无定形固体状的4-{(R)-(2S，5R)-4-烯丙基-2，5-二甲基-哌嗪-1-基)[3-羟苯基]甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺(10.30g)。
在硫代水杨酸存在条件下采用实施例1中讨论的Genet的方法，用Pd(dba)2/DPPB除去烯丙基。浓缩反应物，将残余物倒入200mL乙酸乙酯和300mL二乙醚中。用340mL水洗涤后，用10％柠檬酸(5×80mL)萃取有机溶液。过滤合并的酸性萃取物以除去少量的悬浮固体，用15％NaOH溶液将pH调整到8-8.5。用二氯甲烷(3×300mL)萃取得到的油状悬浮液。干燥(Na2SO4/MgSO4)合并的有机萃取物，在减压下浓缩。残余物为浅橙色的固体。
将4-[(R)-((2S，5R)-2，5-二甲基哌嗪-1-基)(3-羟苯基)甲基]-N，N-二乙基苯-甲酰胺(2.50g，6.32mmol)和3-羧基苯甲醛(1.90g，12.64mmol)置于装有60mL四氢呋喃和0.80mL(13.91mmol)乙酸的250mL烧瓶中。在室温下搅拌反应物20分钟，分批加入三乙酸硼氢化钠(2.68g，12.64mmol)。反应溶液变得非常浑浊，在氮气下密封，搅拌过夜。将反应混合物蒸发至干燥，在乙酸乙酯(60mL)和3M HCl(12mL)之间分配。用另外的5×12mL 3M HCl萃取有机层。用0.5M NaOH溶液和Na2CO3固体调整合并的含水萃取物至pH4-4.5。得到的凝胶通过过滤收集，并将其溶解在30mL 0.5M NaOH溶液中，用20mL EtOAc/Et2O萃取两次以除去杂质。向水溶液中逐滴加入1M HCL至pH4.5-5的沉淀点。得到的白色溶胶通过过滤收集，用少量冷水洗涤。在真空烘箱(30mmHg，40℃)中干燥3-{(2R，5S)-4-[(R)-(4-二乙基氨基甲酰基苯基)-(3-羟苯基)甲基]-2，5-二甲基哌嗪-1-基甲基}苯甲酸得到1.55g白色固体。1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ0.99-1.20(m，12H)；1.89-2.05(m，2H)；2.48-2.65(m，5H)；3.06-3.57(m，5H)；3.78-3.83(d，J＝12.5Hz，1H)；4.94(s，1H)；6.63-6.84(m，3H)；7.09-7.91(m，9H)；9.36(s，1H)。
实施例4在小鼠输精管(Mouse Vas Deferens ED50)受体系统中评价如上所识别的具有式(3)的化合物(下文称为化合物1)的体外类阿片受体活性。所采用的确定受体活性的分析过程如下所述。
体外生物测定除去小鼠的输精管(MVD)，CD-1株(Harlan，Raleigh，NC)，并在装有改良的Mg++自由Krebs缓冲液的器官浴室中将其悬挂在铂电极之间，拉力为0.5g，缓冲液成分(毫摩尔)如下NaCl，117.5；KCl，4.75；CaCl2，2.6；KH2PO4，1.20；NaHCO3，24.5；以及葡萄糖，11。用95％O2/5％CO2使缓冲液饱和，并保持在37℃。在超大电压下用10-Hz脉冲串刺激组织400毫秒；串的间隔为10秒；在最大电压下脉冲持续时间为1.0毫秒。在1uM CTOP(一种高选择型的μ类拮抗剂；K.Gulya，J.T.Pelton，V.J.Hruby and H.I.Yamamura，Life Sci.382221-2229，(1986))和15nM非-BNI(一种选择性κ类 拮抗剂；P.S.Portoghese，A.W.Lipkowski，和A.E.Takemori，Life Sci.40，1287(1987))存在的条件下通过向器官浴中加入合适浓度的测试化合物和在加入下一次更高浓度前得到最大响应来测定δ类受体活性。μ类受体活性采用相似的方式进行测定，但是在3M TIPP(一种高选择型的δ类拮抗剂；P.W.Schiller，T.M.-D.Nguyen，G.Weltrowska，B.C.Wilkes，B.J.Marsden，C.Lemieux，和N.N.Chung，Proc.Natl.Acad.Sci.89，11871(1992))和15nM选择性κ类拮抗剂非-BNI存在的条件下。
κ受体活性在1uM高选择性μ类拮抗剂CTOP和3uM高选择性δ类拮抗剂TIPP存在的条件下进行测定。
在变化累计浓度下测定化合物电诱导肌肉收缩的抑制百分比。从显示剂量浓度对响应的曲线中外推ED50值(J.A.H.Lord，A.A.Waterfield，J.Hughes，H.W.Kosterlitz，Nature 267，495，(1977))。结果在下表1中列出。
表1 实施例5在大鼠脑膜(μ和δ类阿片)中和在豚鼠小脑(κ类阿片受体)中评价化合物1的体外类阿片受体亲和力。从大鼠整脑或豚鼠小脑中制备用于放射性配体结合的膜，大鼠和豚鼠由Pel-Freeze Biological Inc.(Rogers，AR.)提供。将组织在50mM TRIS(三[羟甲基]氨基甲烷)缓冲液(pH7.4)中均化，该缓冲液包含50μg/ml大豆胰岛素抑制剂、1mM EDTA(乙二胺四乙酸)和100μM PMSF(氟化苯基甲基硫酰)。将均化的脑组织在500×g下离心30分钟(4℃)以除去大的碎片。对上清液polytronically声波处理10秒钟(P.E.设置2，4℃)。用10mM TRIS-蔗糖缓冲液(pH7.4)加入蔗糖溶液至终浓度0.35M，然后将脑膜在40,000×g下离心30分钟(4℃)。用包含50μg/ml大豆胰岛素抑制剂、1mM EDTA和100μMPMSF的10mM TRIS缓冲液(pH7.4)洗涤膜小球两次。
在包含50μg/ml大豆胰岛素抑制剂、1mM EDTA、5mM MgCl2和100μM PMSF的10mM TRIS缓冲液(pH7.4)中进行放射性配体结合分析。采用从New England Nuclear购买的氚标记的DAMGO(μ)、Deltorphin II(δ)或U69593(κ)作为对照实验中的配体(2-3×10-10M终浓度)，对照实验的非特异性结合由0.5×10-6M纳洛酮(从SIGMAChemical Co.购买)定义。所有的结合分析都在室温下进行90分钟，然后使用Brandel半自动细胞收集器(型号M48，Brandel，Gaithersburg，MD)用50mM TRIS缓冲液(4℃，pH7.4)在GF/C玻璃纤维过滤器(Whatman，Hillsboro，OR)上快速过滤来终止。用50mM TRIS缓冲液(4℃，pH7.4)洗涤过滤器两次，将过滤器放置在液体闪烁放射性物质(cocktail)中，用Beckman LS 6500闪烁计数器计数结合放射性。从完整的浓度-效果曲线中确定具有式(3)的化合物(1)抑制放射性同位素示踪的DAMGO(μ)、Deltorphin II(δ)或U69593(κ)结合的能力。使用计算机程序Prism(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)，采用放射性配体结合数据的一元(one-site)非线性回归分析确定IC50值。然后采用Cheng-Prusoff方程(Cheng Y and Prusoff WH(1973)，Relationshipbetween the inhibition constant(Ki)and the concentration of inhibitorwhich causes 50 percent inhibition(I50)of a enzymatic reaction；BiochemPharm.，223099-3108.)将IC50值转换成Ki值。
放射性配体结合分析的结果在以下表2中列出。
表2 结果显然，具有式(3)的化合物(1)对所测试的不同种类的受体显示了独特的和不同的结合亲和力。由抑制标记化合物结合需要非常低的浓度说明了该化合物对δ类受体的强亲和力。
实施例6用夹尾测试分析大鼠中痛觉丧失。采用静脉方式施用化合物1。得到1-2小时期间的疼痛反应值。在尾部(离尾末端1英寸)放置一个动脉夹持续一小段时间，直到发生逃避反应(即摆尾或发声)。用秒表记录逃避反应的反应时间。采用20秒的截止时间以防止不必要的组织损伤。观察大鼠的发声或身体运动的疼痛反应。以秒记录引起疼痛反应所需时间作为夹尾反应时间。
通过一半动物在20秒内对动脉夹压迫不表现出任何痛痛反应时的剂量来确定止痛能力中痛觉丧失能力的ED50值(最大有效剂量的一半，ED50)。如表3所示，化合物1不显示止痛活性，这表明被测试化合物不通过血脑屏障，被认为是一种非止痛的化合物。而且，该化合物主要作用于外周δ类阿片受体。更重要的是，即使在50mg/kg的高剂量下，也没有观察到任何测试动物的发作，表明化合物(1)主要限于外周δ受体。
表3 实施例7在闭塞Sprague-Dawley大鼠离体心脏左前降支(LAD)冠状动脉前约15分钟，以1nM、2nM和10nM的浓度施用化合物1。通过大动脉以Langendorff方式用充氧Krebs-Henseleit缓冲液逆行灌注离体心脏。由35分钟局部缺血和随后的120分钟再灌注诱发梗塞。使6-0缝合线通过(LAD)冠状动脉的主分支以形成套圈。
通过拉紧LAD周围的套圈引起局部缺血。在35分钟缺血时间后，松开套圈，用充氧的生理缓冲液再灌注心脏120分钟。在再灌注结束时重新拉紧LAD闭塞器，通过大动脉向心脏中注射含0.125％伊文思蓝的盐水，以可视化非缺血区域。将心脏组织切片，用含1.5％氯化三苯四唑(TTC)的生理缓冲液染色15分钟后估算梗塞的大小。在10％缓冲福尔马林中固定后，将切片安装在载波片之间，用扫描仪数字化获得图像。用Adobe Photoshop 5.0处理图像。采用Optimas 6.2图像分析软件，用计算机化测面法测定非缺血区域、在危险中的区域以及梗塞。
图1显示了一个这样组的结果，其图示了来自用1nM化合物1紧急治疗后的对照和治疗动物的离体心脏组织中梗塞大小的组织学染色切片。发现相对于对照组的梗塞，预处理使梗塞大小减少71％。
表4显示了以本制备中化合物1引起的在危险中区域的百分比(％IS/AAR)表示的缺血性损害的减少。
表4
在对照条件下，35分钟局部性缺血导致在危险中区域的54.7±1.2％的细胞损伤。2nM化合物1产生最大的保护，防止了对照组中出现的几乎90％的损伤。
表5中列出了局部性缺血35分钟和120分钟再灌注后测量的血液动力学参数。
表5
HRXDP，心率x形成压；+dP/dt，收缩变力性(inotropy)；-dP/dt，lustitropy；CF，冠脉流量血液动力学参数结果表明，未进行药理学预处理时在HRXDP参数中有61.8％的抑制，在收缩和舒张压中至少有50％的抑制，伴有冠脉流量减小。相反，如果将动物用本发明化合物1进行预处理，心脏参数有很大改善。一般地说，心脏组织的机能为正常的至少75％，某些参数达90％。这些结果表明，当在缺血事故前施用时，化合物1能够起到心脏保护作用。
实施例8通过腹膜内注射戊巴比妥钠使测试动物(大鼠)麻醉。沿中间胸骨线上反折皮肤，产生一个中线切口。通过啮齿动物呼吸器(Harvard啮齿动物呼吸器)用混有氧气的空气提供流通空气。注意到和在有知觉的大鼠身上所看到一样的正常胸廓扩张。需要精密的解剖，通过用胸骨切开术用剪刀沿胸骨左侧切穿肋骨至大约中胸骨的侧切打开胸腔。在胸骨的最前面需要精密的解剖以避免大的双侧静脉汇流。用5-0丝或单纤丝缝合线使胸腔收缩。用锥形针使7-0丝缝合线在距离正常定位的左心耳尖端1-3mm的冠状动脉左前支下面穿过进行绑扎。将PE-10管的1-mm部分放置在容器的顶端，在管的顶端系一个结以闭塞冠状动脉。闭塞35分钟后，通过用标号11的手术刀片切断PE-10管顶端的结进行再灌注。在绑扎LAD冠状动脉前15分钟，以0.1mg/kg或1.0mg/kg的剂量静脉施用化合物1。通过在缺血和再灌注后用伊文斯蓝和TTC染色2小时、24小时和167小时来测定梗塞大小。
将化合物1溶解在0.9％的盐水中，并注射到测试动物中。使LAD冠状动脉再闭塞，将专利蓝染料注射到静脉导管中将心脏正常灌注区域染色。切除心脏，去除左心室，并切成横断面的切片。这一过程可以使正常区域、非缺血区域、在危险中的区域和梗塞大小可视化。将TTC用作指示剂以分开活组织和非活组织(Klein，H.H.，等.，VirchowsArch(1981)393287-297)。将组织在10％甲醛溶液中储存过夜。次日，用实施例7中所描述的数字图像技术将梗塞大小(IS)计算为在危险中区域的百分比(％)。
发现相对于对照组，在用化合物1预处理的大鼠中梗塞大小明显较小，如表6所示。
表6
用化合物1进行预处理表明，相对于对照组，在紧急施用后梗塞大小减少48％。在初始治疗约7天后，相对于没有治疗的对照组，梗塞大小仍显示减少43％。
实施例9用Inactin(硫化布塔巴比妥钠盐，178mg/kg i.p.)或氨基甲酸乙酯(1.2g/kg i.p.)麻醉雄性大鼠。当达到手术平面后，进行气管切开术(pe-240管)，将该动物在颈静脉(用于i.v.化合物和染料施用)和颈动脉(用于测量血压)中插入pe-50管，然后将动物置于和氧气源相连的呼吸机(Harvard，型号683)，在36-42bpm下进行人工呼吸。将颈动脉导管通过三通注射器阀门连接到PT300压力传感器，用于测量动脉血压和心率。在动物已经稳定后，从颈动脉导管中抽出少量血样(150微升)，用于血内气体分析。
在第五肋间间隔进行左胸廓切开术，然后进行心包切开术和调整左心耳以显示左冠状动脉的位置。使绷带(6-0聚丙烯纺织纤维)通过左心耳下边至左心室的右部分。缝合线末端穿过在一端装有法兰以形成圈套的聚乙烯管。通过拉紧缝合线和采用止血钳将圈套夹在心外膜表面来闭塞冠状动脉。通过心外膜发绀和血压降低来核实冠状动脉的闭塞。保持闭塞30分钟，通过解夹套圈开始再灌注，通过显示心外膜充血反应证实。再灌注的时间为1.5-2小时。在再灌注期间的最后，用套圈再次闭塞冠状动脉，通过i.v.导管注射专利蓝染料(.4Ml 10％w/v盐水)。在染料已经通过循环分散后，立即去除心脏。快速除去心房和右心室，将剩下的左心室切成4-5个切片。将定义为正常(染成蓝色)的区域同危险区域(AAR，未染成蓝色)分离，并将组织放入盛有100mMKH2PO4和0.187％氯化2，3，5-三苯基四唑(TTC)的单独20mL的小瓶内，在37℃下孵育5至10分钟。然后将组织放在装有10％缓冲甲醛溶液的单独的小瓶中，过夜固定。从非梗塞区域分割出梗塞区域，用重量法测量正常；AAR、非梗塞；和梗塞组织。
在闭塞LAD前5分钟(预缺血施用)通过i.v.导管以范围从0.01mg/kg至1.0mg/kg的剂量注射化合物1。
在下表7中提供了由两个单独的实验得到的结果。
表7
在两个测试研究中化合物1的施用一直到1.0mg/kg的剂量都产生了明显的保护效果。对照组显示了在危险中区域(AAR)～50-55％的缺血损伤。以剂量高于0.1施用的化合物1在两个研究中防止了这一损伤的约30至40％。
实施例10采用与实施例9中所述相同的实验方法，只是在解除闭塞LDA的绷带前立即施用化合物1(即在初始缺血性损伤后和再灌注之前立即施用)。在该模型中以0.3mg/kg对化合物1进行测试，显示了明显的保护效果。
对照缺血性损伤为危险中区域的～50％，如实施例9中的对照组一样。然而，当在再灌注损害时施用化合物1防止了30-40％这样的损伤，和实施例9中所描述的在缺血性损伤前形成对比。
**********尽管这里根据本发明的具体方面、特征和示例性实施方式描述了本发明，但可以理解到本发明的应用不限于此，而是能扩展到并包括大量的其它方面、特征和实施方式。因此，此后提出的权利要求书旨在能据此被广泛认为包括在其精神和范围内的所有这些方面、特征和
权利要求
1.一种治疗缺血性损伤的治疗组合物，该组合物包括有效量的下式的二芳基甲基哌嗪化合物或其药学上可接受的酯或盐 其中Z选自下列基团氢；卤素；C1-C6烷基，C2-C6烯基，C2-C6炔基；C1-C6卤代烷基；C1-C6烷氧基；C3-C6环烷氧基；具有式SR8的硫化物，其中R8为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、具有C5-C10芳基部分和C1-C6烷基部分的芳基烷基、或C5-C10芳基；具有式SOR8的亚砜，其中R8同上所述；具有式SO2R8的砜，其中R8同上所述；腈；C1-C6酰基；具有式NHCO2R8的烷氧羰基氨基(氨基甲酰基)，其中R8同上所述；羧酸、或其酯、酰胺或盐；具有式CH2NR9R10的氨甲基，其中R9和R10相同或不同，并且可以为氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C2-C6羟烷基、C2-C6甲氧烷基、C3-C6环烷基或C5-C10芳基，或者R9和R10共同形成5或6个原子的环，环上的原子选自N和C；具有式CONR9R10的氨甲酰基，其中R9和R10同上所述，或其C2-C30肽共轭物；和具有式SO2NR9R10的磺酰胺，其中R9和R10同上所述；和X选自氢、羟基、卤素和烷氧基。
2.根据权利要求1的组合物，其中组合物还包括有效量的用于治疗心脏疾病的第二种化合物。
3.根据权利要求2的组合物，其中第二种化合物选自硝酸盐、β-肾上腺素阻断剂、钙通道拮抗剂、ACE抑制剂、非肽血管紧张素II拮抗剂、IIb/IIIa拮抗剂和阿司匹林。
4.根据权利要求2的组合物，其中第二种化合物和二芳基甲基哌嗪化合物同期施用。
5.根据权利要求1的组合物，其中所述二芳基甲基哌嗪化合物为非止痛化合物。
6.根据权利要求5的组合物，其中所述二芳基甲基哌嗪化合物主要作用于外周δ类阿片受体。
7.根据权利要求1的组合物，其中二芳基甲基哌嗪化合物在与缺血事故发作同时、缺血发作前、手术前、或缺血事故发作后施用。
8.一种减轻患者缺血性损害的方法，该方法包括施用有效量的根据权利要求1的组合物。
9.一种治疗缺血性损害的治疗组合物，该组合物包括有效量的下式的非止痛的二芳基甲基哌嗪化合物 或其药学可接受的酯或盐。
10.根据权利要求9的组合物，其中组合物还包含用于调和保护性或矫正性心脏反应或活性的第二种化合物。
11.根据权利要求10的组合物，其中第二种化合物选自硝酸盐、β-肾上腺素阻断剂、钙通道拮抗剂、ACE抑制剂、非肽血管紧张素II拮抗剂、IIb/IIIa拮抗剂和阿司匹林。
12.根据权利要求10的组合物，其中第二种化合物和二芳基甲基哌嗪化合物同期施用。
13.根据权利要求9的组合物，其中非止痛的二芳基甲基哌嗪化合物在与缺血事故发作同时、缺血发作前、手术前、或缺血事故发作后施用。
14.一种减轻患者缺血性损害的方法，该方法包括施用有效量的包含下式的非止痛二芳基甲基哌嗪化合物的治疗组合物 或其药学可接受的盐或酯。
15.一种治疗缺血性损害的治疗组合物，该组合物包括有效量的下式的非止痛二芳基甲基哌嗪化合物 或其药学可接受的酯或盐。
16.根据权利要求15的组合物，其中组合物还包括用于调和保护性或矫正性心脏反应或活性的第二种化合物。
17.根据权利要求16的组合物，其中第二种化合物选自硝酸盐、β-肾上腺素阻断剂、钙通道拮抗剂、ACE抑制剂、非肽血管紧张素II拮抗剂、IIb/IIIa拮抗剂和阿司匹林。
18.根据权利要求16的组合物，其中组合物还包括药学可接受的载体。
19.根据权利要求15的组合物，其中二芳基甲基哌嗪化合物在与缺血事故发作同时、缺血发作前、手术前、或缺血事故发作后施用。
20.一种减轻心脏组织缺血性损害的方法，该方法包括给所述哺乳动物施用有效量的下式的非止痛二芳基甲基哌嗪化合物 或其药学可接受的盐或酯。
21.根据权利要求20的方法，其中在缺血事故发作的同时多次施用二芳基甲基哌嗪化合物。
22.根据权利要求20的方法，其中二芳基甲基哌嗪化合物作为预防疗法给患者施用，以防止处于缺血性心脏病症状阶段的个体的疾病发展。
23.根据权利要求20的方法，其中二芳基甲基哌嗪化合物在缺血事故发作后施用。
24.根据权利要求20的方法，该方法还包括施用实现保护性或矫正性心脏反应的第二种化合物。
25.根据权利要求24的方法，其中第二种化合物选自硝酸盐、β-肾上腺素阻断剂、钙通道拮抗剂、ACE抑制剂、非肽血管紧张素II拮抗剂、IIb/IIIa拮抗剂和阿司匹林。
26.根据权利要求24的方法，其中第二种化合物和二芳基甲基哌嗪化合物同期施用。
27.根据权利要求20的方法，其中二芳基甲基哌嗪化合物以选自以下的给药方式施用肠胃外、非肠胃外、口服、直肠、局部、鼻、眼、皮下、肌内、静脉内、透皮、脊椎、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、舌下、口腔粘膜、支气管、淋巴和子宫内给药。
28.根据权利要求20的方法，其中哺乳动物为人。
29.一种离体器官用的保存溶液，该溶液包含下式的化合物 或其药学可接受的盐或酯。
30.权利要求29的溶液，其中离体器官选自心脏、肝脏、肾脏、角膜、肺及其组合。
31.一种防止哺乳动物缺血和再灌注损害的方法，该方法包括给哺乳动物施用有效量的下式的δ类阿片受体激动剂 或其药学可接受的酯或盐；和实现抗缺血效果的第二种化合物。
32.权利要求31的方法，其中第二种化合物为盐酸精氨酸。
33.一种实现患者心脏组织缺血预处理的方法，该方法包括给患者施用有效量的下式的二芳基甲基哌嗪化合物 或其药学可接受的酯或盐。
34.权利要求33的方法，其中化合物以选自以下的给药方式施用肠胃外、非肠胃外、口服、直肠、局部、鼻、眼、皮下、肌内、静脉内、透皮、脊椎、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、舌下、口腔粘膜、支气管、淋巴和子宫内给药。
35.根据权利要求33的方法，该方法还包括施用实现保护性或矫正性心脏反应的第二种化合物。
36.根据权利要求35的方法，其中第二种化合物选自硝酸盐、β-肾上腺素阻断剂、钙通道拮抗剂、ACE抑制剂、非肽血管紧张素II拮抗剂、IIb/IIIa拮抗剂和阿司匹林。
37.根据权利要求35的方法，其中第二种化合物和二芳基甲基哌嗪化合物同期施用。
38.一种防止患者潜在缺血且不引起患者的受体调和痛觉丧失的方法，该方法包括施用有效量的权利要求33的二芳基甲基哌嗪化合物。
39.根据权利要求38的方法，其中患者为人。
40.根据权利要求39的方法，其中二芳基甲基哌嗪化合物通过口服施用。
全文摘要
本发明涉及通过采用调和缺血预处理心脏保护效果的非肽δ类阿片受体激动剂化合物用于心脏保护的组合物和治疗方法。该化合物用于减轻和心脏组织缺血和再灌注相关的损害。而且，所述化合物可在保存离体器官活性的溶液中使用。
文档编号A61K31/495GK1697657SQ200480000012
公开日2005年11月16日 申请日期2004年1月2日 优先权日2003年1月2日
发明者张宽仁, 威廉·彭德格斯特, 彼得·J·真戈, 马欣 申请人:安达制药公司