专利名称：ErbB受体激动剂在制备治疗癫痫病的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ErbB受体激动剂在制备治疗癫痫病的药物中的应用。
背景技术：
癫痫(印il印sy)是大脑神经元突发性异常放电，导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病。癫痫患病率很高，中国约有一千万患者，影响总人口的大约1 %，癫痫死亡率约为20%。给家庭、社会造成很大的负担。目前，经过现有的抗癫痫药物治疗，仍有大约30% 的患者不能控制。药物不能控制的癫痫即难治性癫痫的死亡率更高，可达50%，尽管对于药物不能控制的癫痫目前多采取手术治疗，但适合手术的患者只占一小部分。因此，寻找有效和安全的治疗药物是生物医学重要的目标之一。在大脑中，约有10 20%的神经元是GABA能中间神经元，尽管数量不多，但是 GABA能中间神经元在感觉信息的处理、神经环路的同步化、脑电节律、抑制癫痫活动中发挥了重要作用。特别是一种表达钙结合蛋白ParvaIbumin(PV)的细胞占抑制性中间神经元的50%之多，由于其高频的发放特点，又被称作快发放中间神经元。来自不同实验室David Lau, Ikuo Ogiwara等人用在体脑电记录的方式显示PV中间神经元的低功能可以导致癫痫发生。在解剖学上，PV中间神经元与周围神经元主要有两类连接方式，(1)通过投射到椎体神经元的胞体以及轴突起始端来调节椎体神经元发放；( 通过缝隙连接与周围的PV神经元广泛连接，进而影响抑制性网络的同步化活动。神经调节蛋白(Neuregulin，NRG)是生长因子家族的一员，主要由(NRG1 4)所编码，NRGl是被诠释较多的一种。由于不同的转录起始位点和选择性剪切，NRGl可以产生 6种蛋白(I-VI)和至少31种亚型。NRGl的受体ErbB根据亚型分为ErbBl ErbB4四个受体。其中ErbBl和ErbB2没有配体结合区，但是胞内段具备水解和激酶活性；而ErbB3可以结合NRGl但是不具备激酶活性。ErbB4是唯一一个可以特异性结合NRGl并且具有激酶活性的受体。ErbB受体之间可以形成同二聚体或异二聚体。NRGl通过激动ErbB酪氨酸激酶受体，继而激活细胞内信号传导通路，产生一系列细胞反应，包括增生、凋亡、迁移、分化和黏附的活跃或抑制。2010年，！^zzari等人发现ErbB4集中在中间神经元上表达，特别是在PV神经元上。这一结果提示，PV中间神经元很可能是NRGl-ErbB4信号的主要细胞靶点。
发明内容
本发明研究了 ErbB4激动剂NRGl对癫痫的抑制作用，为探索癫痫抑制药物的新型有效“靶标”和分子提供研究方向，为治疗以神经元兴奋性改变为基础的脑系疾病提供候选治疗药物。本发明采用的技术方案是ErbB受体激动剂在制备治疗癫痫病的药物中的应用。所谓ErbB4受体激动剂，是指神经调节蛋白-I (Neuregulin-I)。所述Neuregulin-I分为内源性和外源性激动剂两种。
3外源性Neuregulin-I为人重组蛋白Neuregulin-lbeta 2 (NRGl)，它是由61个氨基酸组成的多肽链。内源性Neuregulin-Ι是由神经元或胶质细胞细胞产生，这里所用ErbB4胞外段 (aal-659, ecto_ErbB4)中和掉的部分。优选的，所述ErbB受体激动剂为ErbB4受体激动剂。具体的，所述ErbB受体激动剂可用于制备增强皮层和海马区域PV中间神经元的兴奋性的药物。优选的，所述ErbB受体激动剂为NRGl (人重组Neuregulin-I beta2)，由61 amino acids组成，序列为shlvkcaekektfcvnggecfmvkdlsnpsrylckcpne ftgd rcqnyvmasfykaeelyq ；分子量为7055道尔顿。ErbB4—旦与NRGl结合，ErbB4即被激活，其羧基末端的络氨酸残基发生磷酸化并聚集连接蛋白如Shc和GA2等，进而激活Ras-Raf-Erk信号通路。本申请发明人经研究发现，ErbB4受体可能是抗癫痫药物的潜在靶点，ErbB4激动剂NRGl对癫痫有一定的抑制作用，其机制是中间神经元上的Kvl. 1钾通道。本发明的有益效果主要体现在本发明揭示了 ErbB4激动剂NRGl对癫痫的抑制作用并对其机理进行了深入研究，为探索癫痫抑制药物的新型有效“靶标”和分子提供研究方向，为治疗以神经元兴奋性改变为基础的脑系疾病的新药筛选提供了基础。
图1为ErbB4受体敲除老鼠与正常老鼠对致痫药戊四唑以及匹鲁卡品的易感性； 结果表示为平均值士标准误。图2为预先脑室内注射人重组Neuregulin-I组与脑室只注射等量人工脑脊液组对致痫药戊四唑以及匹鲁卡品的易感性；结果表示为平均值士标准误。图3为癫痫患者以及正常对照组大脑皮层ErbB4和ErbB2表达量；结果表示为平均值士标准误。图4为外源性或内源性Neuregulin-I对大脑皮层或海马PV中间神经元的调节作用；结果表示为平均值士标准误。图5为药理学阻断ErbB4受体或基因特异性敲除ErbB4受体后，Neuregulin_l的作用消失了 ；结果表示为平均值士标准误。图6为Neuregulin-I对PV中间神经元上Kvl. 1型钾电流的调节；结果表示为平均值士标准误。图7为细胞膜上Kvl. 1酪氨酸磷酸化水平会受到NRGl_ErBB4信号的调节；结果表示为平均值士标准误。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 :PV中间神经元上特异性敲除ErbB4受体的老鼠更易发癫痫(1)实验材料
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实验动物雄性PV-Cre-ErbB4—ρ小鼠(基因敲除ErbB4受体的小鼠)及同窝的对照ErbB4LoxP/LoxP小鼠(含有ErbB4受体的正常小鼠)，各18只，八周龄，体重24士2克， 饲养于相同的环境，食物和水自由摄取海天给12h的光照。行为学实验在12:00 14:00 之间进行。基因敲除ErbB4受体的小鼠采用国际上广泛应用的Cre-LoxP重组酶系统获得。该系统含有两种成分①一段长Mbp的DNA序列，含有两个13bp的反向重复序列和一个8bp 的核心序列，其序列如下5' -ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT-3'。这段 34bp 序列是重组酶识别的位点，被称为IoxP位点；②Cre重组酶(cyclizationrecombination)， 它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发IoxP位点的DNA重组，Cre重组酶基因编码区序列全长l(^9bp (EMBL数据库登录号X03453)。任何序列的DNA，当其位于两个IoxP 位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个IoxP位点的方向相同)，要么方向发生倒转(两IoxP位点的方向相反)。其中PV-Cre老鼠受赠于美国冷泉港Dr.ZJ Huang 实验室，即在parvalbumin基因的第五号外显子3' UTR端插入Cre重组酶基因，其在美国 Jacksonlab公司的商品号为008069。ErbB4L°xlVL°xP老鼠受赠于美国佐治亚大学Dr. LMei实验室，即一段Ioxp序列置于erbb4上游，另一段置于erbb4下游。上诉两种老鼠杂交，产生的子代老鼠中，经基因鉴定筛选出带有PV-Cre-ErbBfrap^xp基因型的老鼠。试剂PTZ (戊四唑)，pilocarpine (匹鲁卡品)购自美国Sigma公司。仪器透明玻璃笼子(2)实验方法I、根据文献和预实验结果，选用PTZ浓度为40mg/kg，pilocarpine200mg/kg,溶解于PBS，并与腹腔内注射。注射PTZ以后，小鼠单独放予透明玻璃笼子内，观察行为变化 30min。癫痫发作严重程度根据文献分级0级无反应；1级耳朵和面部抽动，包括眨眼、 动须、节奏性咀嚼；2级肌阵挛，但无直立；3级肌阵挛，双侧前肢抬起；4级侧身倒地；5 级背部倒地，全身强直.阵挛发作6级死亡.II、评估了两种老鼠在由PTZ诱发全身发作的发生率。III、还评估了两种老鼠在由匹鲁卡品引起癫痫持续状态的发生率。(3)实验结果I、图la、b所示为PV-Cre-ErbBfxtvtap小鼠对戊四唑诱发的癫痫表现更高的发作级别，以及更多的发作百分比。II、图Ic所示为PV-Cre-ErbB4—M、鼠对匹鲁卡品诱发癫痫表现更高的发生率。(4)结论PV中间神经元上特异性敲除ErbB4受体的老鼠更易发癫痫。实施例2 外源性脑室内注入NRGl可以抑制癫痫的发作(1)实验材料实验动物雄性ErbB4L°xlVL°xP小鼠，共20只，八周龄，体重M+2克，饲养于相同的环境，食物和水自由摄取；每天给12h的光照。行为学实验在12:00 14:00之间进行。试剂PTZ，pilocarpine购自美国Sigma公司；Isoflurane (异氟烷)购自河北九派制药公司；仪器；立体定位仪，型号512600，产于美国Moelting公司；麻醉机。
(2)实验方法根据前面得出的结果可以做出这样的假设药物刺激NRGl_ErbB4轴可能会有抗癫痫的作用。持续异氟烷吸入麻醉，小鼠被固定在立体定位仪下，待麻醉平稳后， 右脑室(AP -O. 5mm, L -lmm, V :-2. 2mm)内注入人重组蛋白 Neuregulin-lbeta 2(6mmol in 3 μ 1)。在十五分钟的恢复后，在进行腹腔内注射PTZ浓度为60mg/kg或，pilocarpine 250mg/kg。相应的，对照组采取注入右脑室相应体积脑脊液，15分钟后，腹腔内注入PTZ浓度为60mg/kg或，pilocarpine250mg/kg。癫痫发作评级同上。(3)实验结果I、所有的老鼠在腹腔注射60mg/kg PTZ后，都会表现出癫痫症状，然而，注射过 NRGl的老鼠发作的级别和发作次数明显低于对照组。II、老鼠在腹腔注射250mg/kg pilocarpine后，预先给NRGl的老鼠癫痫持续状态发生率更低并且发作潜时更长。(4)结论外源性脑室内注入NRGl可以抑制癫痫的发作。实施例3 :ErbB4受体在人的癫痫患者脑中表达量下降(1)实验材料人脑组织5例难治性癫痫患者术后脑组织，符合以下标准1特征性脑电图、药物治疗两年以上仍有癫痫发作、应用2 3种一线抗癫痫药物并已达到血药浓度。II癫痫症状符合1981年国际抗癫痫组织分类标准。IIICT或MRI指引下没有进行性灶点。IV除癫痫外，没有其他神经系统疾病V术前评估属于位置相关的癫痫样放电。对照组脑组织符合以下标准1没有神经系统的疾病史。II除外伤外，没有其他可以引起癫痫的脑结构或功能改变的损伤。这两组之间年龄没有统计学差异。试剂:anti-ErbB4(ErbB4 抗体)和 anti-ErbB2 (ErbB2 抗体)购自美国 Santa Cruz Biotechnology 公司，anti-caveolin-Ι (小凹蛋白 1 抗体)购自美国 Cell Signaling Technology 公司。仪器Western Blotting所需的基本分子实验设备。(2)实验方法蛋白定量裂解细胞，提取蛋白裂解液，用于Wfestern Blotting。Western Blotting — 抗浓度为anti-ErbB4(l 1000)，anti_ErbB2(1 1000)和 anti-caveolin-1(1 ； 1000)。(3)实验结果图3所示癫痫患者大脑皮层地ErbB4表达量只有正常对照组的 60%，然而，ErbB2的表达量却没有发生改变。统计结果见图北。(4)结论ErbB4受体在人的癫痫患者脑中表达量下降。实施例4 =NRGl增强皮层和海马区域PV中间神经元的兴奋性(1)实验材料实验动物B13和G42小鼠受赠于美国冷泉港Dr. ZJ Huang实验室。G42，即一段 GAD67-GFP BAC重组体被插入到GAD67gene的第一段外显子内，其在美国Jacksonlab公司的商品号为007677。B13，即一段Pv-GFPBAC重组体被插入于PV gene内。这两种老鼠的 PV中间神经元上被特异性的标有绿色荧光。试剂NRG1购自美国 Prospec 公司，ecto-ErbB4 转染 ecto_ErbB4 (含有 ErbB4 胞外段aa 1-659的pErbB4ex/Fc与昍以93，经培养、纯化提取ecto_ErbB4。MEM培养基，胎牛血清购自美国Gibco公司。仪器细胞培养设备，培养瓶和培养箱。切片机购自美国Leica公司。红外干涉显微镜购自日本Nikon公司。电生理记录系统MultiClamp 700B放大器，Digidata 1440A数模转换器以及pClamp 10. 2记录软件购自美国Axon Instruments/Molecular Devices公司。(2)实验方法人工脑脊液配制125mMNaCl, 3mM KCl, 1. 25mM NaH2PO4, 2mMMgS04, 2mM CaCl2, 25mM NaHCO3, and IOmM glucose，溶剂为去离子水；电极内液配制130mM K-gluconate, 20mM KCl，IOmM Hepes, 4mMMg2ATP, 0. 3mM NaGTP, IOmM disodium phosphocreatine and 0. 2mMEGTA(pH 7. 2with Κ0Η, 288m0sm), MM 为去离子水；脑片准备动物麻醉后，取脑尽量快速，并保持低温。然后冠状切300微米，在33°C 人工脑脊液孵育60分钟后，转移到22°C室温下，电生理记录全程32°C 33°C。首先在用绿色荧光标记的中间神经元上做了全细胞记录。所用液体全程充气95% 02/5% C02。电生理记录在脑片2或3层，经四十倍水镜，荧光激发指引下找到带有绿色荧光的神经元，做全细胞记录，电流钳模式下注入500毫秒电流。(3)实验结果I、图如所示外源性灌流10纳摩尔的NRGl加快了皮层PV中间神经元动作电位的发放频率。同时热失活NRGl后再灌流，对频率没有影响。统计结果见图如。 II、图4b所示，用ecto_ErbB4拮抗内源性的NRGl，皮层PV中间神经元动作电位的频率明显下降。同时热失活ect0-ErbB4后再灌流，对频率没有影响。统计结果见图如。III图4d所示，在海马区域重复如上实验，得到类似的效果。(4)结论NRG1增强皮层和海马区域PV中间神经元的兴奋性实施例5 :ErbB4受体对于NRGl调节中间神经元的兴奋性是必要的(1)实验材料实验动物G42-ErbB4L。xlVL。xP小鼠，由 G42 与 ErbB4L。xlVL。xP 杂交获得； G42-PV-Cre-ErbB4LoxP/LoxP 小鼠，由 G42_ErbB4L。xlVL。xP 与 PV-Cre_ErbB4L。xlVL。xP 杂交获得。试剂NRG1购自美国 Prospec 公司，ecto_ErbB4 转染含有 ecto_ErbB4 的 pErbB4ex/Fc与HEK293，经培养、纯化提取ecro_ErbB4。MEM培养基，胎牛血清购自美国 Gibco公司。AG1478购自美国Sigma公司。仪器细胞培养设备，培养瓶和培养箱。切片机购自美国Leica公司。红外干涉显微镜购自日本Nikon公司。电生理记录系统MultiClamp 700B放大器，Digidata 1440A数模转换器以及pClamp 10. 2记录软件购自美国Axon Instruments/Molecular Devices公司。(2)实验方法人工脑脊液配制125mMNaCl, 3mM KCl, 1. 25mM NaH2P04, 2mMMgS04, 2mM CaCl2, 25mM NaHCO3, and IOmM glucose，溶剂为去离子水；电极内液配制130mM K-gluconate, 20mM KCl, IOmM Hepes, 4mMMg2ATP, 0. 3mM
7NaGTP, IOmM disodium phosphocreatine and 0. 2mMEGTA(pH 7. 2with KOH, 288m0sm), MM 为去离子水；脑片准备动物麻醉后，取脑尽量快速，并保持低温。然后冠状切300微米，在33°C 人工脑脊液孵育60分钟后，转移到22°C室温下，电生理记录全程32°C 33°C。首先在用绿色荧光标记的中间神经元上做了全细胞记录。所用液体全程充气95% 02/5% C02。电生理记录在脑片2或3层，经四十倍水镜，荧光激发指引下找到带有绿色荧光的神经元，做全细胞记录，电流钳模式下注入500毫秒电流。(3)实验结果1、图如所示，先用了药理学的方法，ErbB4的特异性阻断剂-AG1478，可以阻碍 NRGl对中间神经元兴奋性的调节。而且AG1478本身就可以明显的减慢PV中间神经元的发放频率(图)，这又进一步为内源性NRGl的作用提供了证据。II，图恥所示，用Cre-LoxP的转基因技术方法特异性敲除PV中间神经元上的 ErbB4受体。发现NRGl不再能加快PV中间神经元的兴奋性。这与药理学的结果相一致，进一步为ErbB4的必要性提供证据。(4)结论ErbB4受体对于NRGl调节中间神经元的兴奋性是必要的。实施例6 (1)实验材料实验动物B13和G42小鼠受赠于美国冷泉港Dr. ZJ Huang实验室。G42，即一段 GAD67-GFP BAC重组体被插入到GAD67gene的第一段外显子内，其在美国Jacksonlab公司的商品号为007677。B13，即一段Pv-GFPBAC重组体被插入于PV gene内。这两种老鼠的 PV中间神经元上被特异性的标有绿色荧光；试剂NRG1购自美国 Prospec 公司，ecto_ErbB4 转染含有 ecto_ErbB4 的 pErbB4ex/Fc与HEK293，经培养、纯化提取ecro_ErbB4。MEM培养基，胎牛血清购自美国 Gibco 公司。DiTx-K 购自美国 Alomone Labs.公司。仪器细胞培养设备，培养瓶和培养箱。切片机购自美国Leica公司。红外干涉显微镜购自日本Nikon公司。电生理记录系统MultiClamp 700B放大器，Digidata 1440A数模转换器以及pClamp 10. 2记录软件购自美国Axon Instruments/Molecular Devices公司。(2)实验方法人工脑脊液配制125mMNaCl, 3mM KCl, 1. 25mM NaH2PO4, 2mMMgS04, 2mM CaCl2, 25mM NaHCO3, and IOmM glucose，溶剂为去离子水；电极内液配制130mM K-gluconate, 20mM KCl，IOmM Hepes, 4mMMg2ATP, 0. 3mM NaGTP, IOmM disodium phosphocreatine and 0. 2mMEGTA(pH 7. 2with KOH, 288m0sm), MM 为去离子水；脑片准备动物麻醉后，取脑尽量快速，并保持低温。然后冠状切300微米，在33°C 人工脑脊液孵育60分钟后，转移到22°C室温下，电生理记录全程32°C 33°C。首先在用绿色荧光标记的中间神经元上做了全细胞记录。所用液体全程充气95% 02/5% C02。电生理记录在脑片2或3层，经四十倍水镜，荧光激发指引下找到带有绿色荧光的神经元，做全细胞记录，电压钳模式。用了电流相减的分析方法分离出DTx-K敏感的钾电流Kvl. 1以及受到ecto-ErbB4调节的电流。把灌流ecto-ErbB4前后的电流相减得到受到 ecto-ErbB4调节的外向电流。或是把灌流DTx-K前后电流相减得到DTX_k敏感的钾电流 Kvl. 1。(3)实验结果图6所示，ecto-ErbB4可以增加整体的外向钾电流。这一增加的部分被后来的 DTx-K完全的抑制掉(图)。当提前用DTx-k孵育脑片的情况下，ecto-ErbB4不再能增加钾电流(图)。(4)结论这一结果显示，ecto-ErbB4调节的部分电流是DTx-K敏感的钾电流，即 Kvl. 1电流。实施例7 细胞膜上Kvl. 1酪氨酸磷酸化水平会受到NRGl-ErBB4信号的调节。(1)实验材料实验动物PV-Cre-ErbB4—ρ小鼠及同窝的对照小鼠ErbB4L°xPA°xP试剂:anti-Kvl.1 (Kvl. 1 抗体)购自美国 NeuroMab 公司，anti-caveolin-l (小凹蛋白-1抗体)和anti-phosphotyrosine (酪氨酸磷酸化抗体)购自美国Cell Signaling Technology 公司。仪器(2)实验方法免疫沉淀裂解组织，提取膜蛋白裂解液，富集膜上的Kvl. 1蛋白，用于Western Blotting。蛋白定量蛋白定量裂解组织，提取蛋白裂解液，用于Western Blotting。 Western Blotting 一抗浓度为anti_Kvl· 1 (1 1000), anti-phospho-tyrosine 禾口 anti-caveolin-l (1 ； 1000)(3)实验结果I、图7a所示，Kvl. 1总蛋白在NRGl处理后20分钟内都没有明显改变，然而细胞膜上的Kvl. 1通道酪氨酸水平在20分钟内逐渐升高。II、图 7b 所示，PV-Cre-ErbB4L°xlVL°XIVjHllKVl. 1 磷酸化水平低于 ErbB4L°xlVL°xP 小鼠 Kvl. 1水平。(4)结论细胞膜上Kvl. 1酪氨酸磷酸化水平会受到NRGl-ErBB4信号的调节。
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权利要求
1.ErbB受体激动剂在制备治疗癫痫病的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述ErbB受体激动剂为ErbB4受体激动剂。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述ErbB受体激动剂用于制备增强皮层和海马区域PV中间神经元的兴奋性的药物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述ErbB受体激动剂为人重组蛋白 Neuregulin-1 beta 2，其氨基酸序列如下:shlvkcaekektfcvnggecfmvkdlsnpsryIckcpnef tgdrcqnyvmasfykaeelyq0
全文摘要
本发明提供了ErbB受体激动剂在制备治疗癫痫病的药物中的应用。本发明的有益效果主要体现在本发明揭示了ErbB4激动剂NRG1对癫痫的抑制作用并对其机理进行了深入研究，为探索癫痫抑制药物的新型有效“靶标”和分子提供研究方向，为治疗以神经元兴奋性改变为基础的脑系疾病的新药筛选提供了基础。
文档编号A61K45/00GK102327613SQ20111025806
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月2日 优先权日2011年9月2日
发明者卢应梅, 李可心, 李晓明 申请人:浙江大学