专利名称：猪促甲状腺激素释放激素受体基因trhr的克隆及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于家猪分子辅助选育技术领域，具体涉及一种猪促甲状腺激素释放激素 受体基因TRHR的克隆及其单核苷酸多态性的检测方法和作为猪生产性状的分子遗传标记 应用。
背景技术：
随着人民生活水平的提高，对猪肉需求量以及猪肉品质的提高已引起了生产者和 消费者的广泛关注。猪是我国人民肉制品消费的重要商品来源，而且它也是研究人类异种 移植的重要动物模型并可能成为合适的移植器官供应源。养猪业在我国畜牧业和国民经济 中有重要地位，胴体品质评定已成为遗传、育种学家、生产者以及消费者普遍关心的问题。 所以分离克隆影响猪生长和胴体品质性状的新基因并寻找重要的分子标记用于猪标记辅 助选择，对加速猪新品种的选育，加快我国养猪业的发展具有极其重要的价值。下丘脑合成和分泌的促甲状腺激素释放激素(Thyrotropin-releasinghormone， TRH)作用于垂体，与垂体表面的促甲状腺激素释放激素受体(Thyrotropin-releasing hormone receptor,TRHR)结合激活胞内信使通路，促进促甲状腺激素和催乳素的分泌和合 成。其中促甲状腺激素经血液循环至甲状腺与位于其表面的促甲状腺激素受体结合，启动 胞内信使通路，促进甲状腺对碘的运转和摄取以及甲状腺激素合成和分泌。而甲状腺激素 作用遍及全身，主要功能为促进组织分化、生长和成熟，促进三大营养物质和能量代谢，应 激以及维持个体正常生长发育等。此外，甲状腺激素在机体内有产热作用，影响蛋白质、脂 肪、糖、维生素和水盐的代谢，并对消化、吸收、心血管、性腺、骨骼和神经系统均有重要作用 (陈守良，1996)。实验表明，在猪饲料中添加甲状腺素可提高个体的采食量且不影响肉料 比(重庆市饲料公司饲料研究所，1996)，有效提高猪的生长速度。因此，调控甲状腺激素分 泌水平的促甲状腺激素和促甲状腺激素释放激素及其受体基因是影响猪生长和胴体性状 的重要功能候选基因。然而目前国内外关于猪甲状腺激素分泌相关调控基因的研究寥寥无 几。最近，Liu等的研究显示人类促甲状腺激素释放激素受体TRHR基因中存在的变异是导 致人类个体瘦体重差异的主要原因。TRHR 属于 G 蛋白偶联受体超家族(G protein-coupled receptor superfamily, GPCR)的视紫素/β-肾上腺素受体家族(Family A)。1990年，从小鼠垂体肿瘤cDNA文库 克隆得到第一个TRH受体。随后，其垂直同源受体在其他物种中也得到克隆，包括大鼠、 牛、鸡、羊、非洲爪蟾、白鲤以及人类等，但未见有关猪TRHR基因的报道。本专利申请人利用 辐射杂种细胞系定位等技术将猪TRHR基因定位到猪4号染色体上，发现相应区域存在多个 影响日增重、胴体长、背膘厚和肉质性状相关的QTL，表明猪TRHR基因是一个重要的生长和 胴体品质相关基因。但到目前为止，国内外对猪TRHR基因的研究还是空白。研究突变位点 在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因功能的一个非常有利的手段。所以申 请人克隆了这个基因的cDNA序列和部分DNA序列并进行了多态研究和关联分析，以期能够 揭示它的功能并运用于猪的分子辅助标记选择中。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种猪促甲状腺激素释放激素受体基 因TRHR的克隆及其应用。本发明克隆与猪生产性状相关的促甲状腺激素释放激素受体基 因TRHR的cDNA编码序列全长及DNA序列，并利用该基因的多态性位点作为猪生产性状的 分子标记的应用，为猪的育种提供一种新的标记辅助选择。本发明的目的通过以下技术实现一种猪促甲状腺激素释放激素受体基因TRHR， 它的cDNA序列为SEQ ID NO :1所示的序列，它具有SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 3所示的
基因序列。该cDNA序列长度为1469bp，序列中包含1198bp的开放阅读框，233bp的5，非翻 译区和38bp的3，非翻译区。序列表SEQ ID NO 2的第442bp处有一个T442-C442碱基突 变，以及第626bp处有一个G626-T626碱基突变。一上述的基因TRHR在猪分子标记辅助选择和动物基因工程中的应用。本发明的有益效果是，本发明克隆与猪生产性状相关的促甲状腺激素释放激素受 体基因TRHR的cDNA编码序列全长及DNA序列，并利用该基因的多态性位点作为猪生产性 状的分子标记的应用，为猪的育种提供一种新的标记辅助选择。
图1是本发明设计和优化的快速突变检测技术所依据的Tetra primersARMS-PCR 方法原理示意图；图中，上、下游外引物(黑色箭头表示)扩增包含此多态位点的大片段， 上、下游内引物(红色和蓝色箭头表示)分别扩增两等位基因中的一种；图2是本发明中猪TRHR基因T442-C442多态性座位的分型电泳图谱；图中，M泳 道为DNA分子量标准；图3是本发明中猪TRHR基因G626-T626多态性座位的分型电泳图谱；图中，M泳 道为DNA分子量标准。
具体实施例方式本发明首先克隆得到猪促甲状腺激素释放激素受体基因TRHR，它的cDNA序列如 序列表SEQ ID NO :1所述，该序列全长为1469bp，序列中包含1198bp的开放阅读框，233bp 的5’非翻译区和38bp的3’非翻译区。即在该序列中，第l-233bp处为5，UTR，第234-1431 位 CDS，第 1432-1469 位为 3，UTR。在此基础上，获得了猪TRHR基因的部分DNA序列如序列表SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 3所述。其中SEQ ID NO 2的DNA片段长度为2188bp，第1-159位为第1外显子序 列，第160-711位为第1内含子，第712-1582位为第2外显子，第1583-2188为部分第2内 含子序列；SEQ ID NO 3的DNA片段长度为947bp，第1-539位为第2内含子部分序列，第 540-947位为第3外显子。所获得的猪TRHR基因部分DNA序列中有如序列表SEQ ID NO :2所述的一个 T442-C442碱基突变和一个G626-T626突变。基于tetra primers ARMS-PCR方法原理设计 并优化用于检测序列表SEQ ID NO :2中两个突变的快速分型技术具体见实施例部分。
本发明中分子标记的克隆及其制备方法按照以下步骤进行(1)利用GeneBank数据库中已知猪TRHR部分DNA序列(959bp)与人TRHR基因 DNA序列和mRNA序列进行比对分析，获得猪TRHR基因第2外显子部分序列；设计3’ RACE 引物，其中猪TRHR基因特异引物序列如SEQ IDNO :4和SEQ ID NO :5所示，上游外引物GGTGTCTTTTATGTTGTGCCAAT上游内引物TCAACAGCACAGTATCTTCAAGG提取猪垂体组织总RNA ；3'RACE PCR扩增和纯化回收产物、克隆并测序；通过序列 分析获得如SEQ ID NO :1所述的序列。根据此序列设计了一对引物，可从猪垂体组织cDNA 中扩增到一长为1256bp，编码猪促甲状腺激素释放激素受体蛋白完整序列的PCR产物，该 产物可应用于动物基因工程领域；所用引物序列如SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7所示
上游引物TTTCAGAGAAACCTCAAGCCACT下游引物TCTTTGTCATACATTTTCTTCTACTCPCR 扩增条件为94°C预变性 3min ;94°C 30s，58°C 45s, 72°C Imin 30s，40 个循 环；72°C延伸 IOmin0(2)根据序列表SEQ ID NO 1所述的cDNA序列，搜索多个猪基因组数据库，筛选 猪DNA序列片断。然后设计引物进行PCR扩增和测序分析，最后确证获得如序列表SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所述的猪TRHR基因DNA序列。相关引物序列如SEQ ID NO 8 SEQ ID NO 17 所示FO TTGGAAAGGGCTGTGAGGGTTTAG,RO :AGGCTGTGATTGAACAAGAGGAG ；FlTTGAGAGGAAAGGAGGCAGA,Rl:AGGCTGAAGCTGTGTTTGGT ；F2 GGGAGAGAACCACTGCGATA,R2 :ATGGATGTGAAAGCCCAGAC ；F3 :ATCTGTCACCCCATCAAAGC,R3 :ATTCTGGTTTTGCCATCAGC ；F4 CACTTTTGGAGCCGTGAGTAAAC,R4 :GGAATTTCTGGGACATGAGATTG。下面根据附图和实施例详细说明本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。实施例1 (一)基于Tetra primers ARMS-PCR原理建立的检测序列表SEQ ID NO :2所述 的一个T442-C442碱基突变的诊断方法。采集代测个体血样或耳样样本提取基因组，基因组DNA采用传统酚/氯仿抽提 法提取，经紫外分光光度计检测DNA纯度和浓度后，以灭菌蒸馏水稀释到lOng/μ 1。通过 tetra primers ARMS-PCR 在线弓I物设计程序(http //cedar. Renetics. soton. ac. uk/ public html/primerl. html)设计突变分型引物。T442-C442碱基突变的分型引物如SEQ ID NO 18 SEQ ID NO 21 所示上游内引物GATAGCAGATATTGTTTAGGTTTTTTCAAT下游内引物AATGCTCCCTGTTTTGAGAGTGCTAAG
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上游外引物GAAATTGTTCTCTGTTGGGTCTGTAAG下游外引物AGTAATTGGGTTCATAGGTACTCCTGAAPCR 扩增程序均为94°C预变性 3min ;94°C 30s,60°C lmin,72°C lmin，35 个循 环；72°C延伸 lOmin。扩增体系为 10μ 1，其中模板DNA 20ng,rTaq 0. 4U(Takara公司)，IOmM dNTPs 0. 2 μ 1,10 XBuffer 1. O μ 1，10 μ M 的上游外引物 0. 08 μ 1、下游外引物 0. 12μ 1、上 游内引物0. 4 μ 1、下游内引物0. 4 μ 1。PCR产物用2 %琼脂糖凝胶检测。结果如附图2所示非突变特异条带为443bp，即不管个体为何种突变基因型，均 能获得443bp的条带；等位基因T特异产物为200bp，即如果存在T442突变，会出现200bp 的条带；等位基因C特异产物为300bp，即如果存在C442突变，会出现300bp的条带。如果 个体为T442和C442杂合子，则可同时获得200bp和300bp条带；若为纯合子则仅出现其相 应的突变条带。(二)基于Tetra primers ARMS-PCR原理建立的检测序列表SEQ ID NO :2所述 的一个G626-T626碱基突变的诊断方法。基因组DNA提取及引物设计方法同上。G626-T626碱基突变的分型引物SEQ ID NO 22 SEQ ID NO 25 所示上游内引物ACCCAATTACTGCAGATAAATGGAAT下游内引物GTAACTCTCACATCCTCTCTTTTCGTC上游外引物CTTCTTTATTGTACTTTTCCCAAGCATC下游外引物TCACTTACTGTCTCGTTTTCCATCTTTAPCR 扩增程序均为94°C预变性 3min ;94°C 30s, 60°C lmin,72°C lmin，35 个循 环；72°C延伸 lOmin。扩增体系为 10μ 1，其中模板DNA 20ng,rTaq 0. 4U(Takara公司)，IOmM dNTPs 0.2 μ 1, IOXBuffer 1.0 μ 1，10 μ M 的上游外引物 0. 08 μ 1、下游外引物 0.08 μ 1、上 游内引物0. 8 μ 1、下游内引物0. 4 μ 1。PCR产物用2 %琼脂糖凝胶检测。结果如附图3所示非突变特异条带为460bp，即不管个体为何种突变基因型，均 能获得460bp的条带；等位基因G特异产物为296bp，即如果存在G626突变，会出现296bp 的条带。等位基因T特异产物为217bp，即如果存在T626突变，会出现217bp的条带。如果 个体为G626和T626杂合子，则可同时获得296bp和217bp条带；若为纯合子则仅出现其相 应的突变条带。实施例2 猪TRHR基因多态性在不同猪群中的分布在4个国外猪种(皮特兰、长白、杜洛 克、约克夏猪)和2个中国猪种(金华猪和嘉兴黑猪)共228头猪中采用实施例1所述的突 变检测技术进行SNP分型。检测结果如表1所示。T442-C442在所检测的几个猪种中，国外 猪群以及嘉兴黑猪均为T等位基因占优势，而在金华猪中以C等位基因占优势。G626-T626 在所检测的几个猪种中，中国猪种与国外猪种等位基因频率差别较大，国外猪种为T等位 基因占优势，而中国猪种嘉兴黑猪和金华猪均固定为等位基因G。表1.六个猪种中TRHR基因多态性的基因型和基因频率 实施例3 猪TRHR基因多态性标记与生产性状的关联分析申请人选择了 354头金华猪X 皮特兰猪F2代作为关联分析试验材料，分析的性状包括日增重、胴体长、头重、胴体重、后 腿重、后腿肌肉重、后腿脂肪重、蹄重、板油重、四点背膘厚(肩最厚处、6-7肋间、最后肋和 腰荐结合处)、平均背膘厚、眼肌面积、系水力、肌内水份、肌内蛋白、肌内脂肪以及后腿肌肉 和眼肌的PH值、导电率和温度。SNP分型采用实施例1所述的突变检测技术进行。检测结 果采用SAS统计软件(SAS Institute Inc, Version 9· 0) GLM程序进行单标记方差分析，所 采用的模型为Yijklmn = μ +Fi+Dj+S.+Mn+M^+Mn^+ β *XiJklmn+eiJklnm其中，Yijklnm为性状观测值，μ为平均值，Fi父本效应，Dj为母本效应，Sk为性别效 应，M11为多态座位T442-C442基因型效应，M2m为多态座位G626-T626基因型效应，M11^M2m 为两座位交互作用，P*Xijklmn表示以宰前活重为协变量，eijkl 为残差效应。基因型检测结果表明在所检测的354头金华猪X皮特兰猪F2代个体中，多态座 位T442-C442的TT基因型占53. 14%, CC基因型占8%，TC基因型占38. 86% ；多态座位 G626-T626的GG基因型占51. 76%，TT基因型占27. 06%,TG基因型占21.18%。关联分析 结果显示，多态座位T442-C442与后腿脂肪重、板油重、肩部背膘厚、蹄重和肌内水分含量 显著关联(P < 0. 05)；而多态座位G626-T626与日增重、后腿肌肉重、后腿脂肪重、后腿肌 肉温度、蹄重、所有4点背膘厚以及平均背膘厚均有显著关联(P < 0. 05)。两座位的互作效 应与后腿脂肪重、后腿肌肉PH值、眼肌pH值和胴体重有显著关联(P<0. 05)。结果说明本 发明中的猪TRHR基因多态突变可作为以上生产性状的分子辅助选择标记。
权利要求
一种猪促甲状腺激素释放激素受体基因TRHR，其特征在于，它的cDNA序列为SEQ ID NO1所示的序列。
2.根据权利要求1所述的cDNA序列，其特征在于，该cDNA序列长度为1469bp，序列中 包含1198bp的开放阅读框，233bp的5，非翻译区和38bp的3，非翻译区。
3.一种猪促甲状腺激素释放激素受体基因TRHR，其特征在于，它具有SEQ IDNO :2和 SEQ ID NO 3所示的基因序列。
4.根据权利要求3所述的DNA序列，其特征在于序列表SEQID NO 2的第442bp处 有一个T442-C442碱基突变，以及第626bp处有一个G626-T626碱基突变。
5.一种权利要求1-6所述的基因TRHR在猪分子标记辅助选择和动物基因工程中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种猪促甲状腺激素释放激素受体基因TRHR的克隆及其应用，克隆得到如序列表SEQ ID NO1所示的猪TRHR基因cDNA全长和如序列表SEQ ID NO2与SEQ ID NO3所示的DNA序列，经过关联分析发现序列表SEQ ID NO2中一个T442-C442碱基突变和一个G626-T626突变与猪多个生产性状存在显著关联，本发明为猪的标记辅助育种提供了新的分子标记。
文档编号C12N15/12GK101914544SQ20101022040
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月6日 优先权日2010年7月6日
发明者张立凡, 徐宁迎, 蒋晓玲, 蔡兆伟, 陈哲 申请人:浙江大学