一种小鼠甲状腺上皮细胞分离及培养方法与流程

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种小鼠甲状腺上皮细胞分离及培养方法。

背景技术：

甲状腺是脊椎动物非常重要的腺体，属于内分泌器官，位于哺乳动物颈部甲状软骨下方，气管两旁。其中，甲状腺上皮细胞(也称为滤泡细胞或主要细胞)在甲状腺细胞中是负责生产和分泌甲状腺激素，包括四碘甲状腺原氨酸(T4)和三碘甲腺原氨酸(T3)，具有调节动物体生长发育、基础代谢及繁殖活动的重要生理功能。甲状腺功能异常会引起甲状腺腺瘤、甲状腺癌、原发性甲状腺功能亢进和减退等疾病，甲状腺细胞的体外培养是甲状腺疾病研究的一种重要方法。目前有关甲状腺原代培养的组织多取材于体型较大的哺乳动物，如猪、狗、绵羊、兔等，成本较高，而且培养的甲状腺细胞的体外生存时间和功能差异也较大。由于小鼠的甲状腺组织较小，取材和后续处理有一定难度，但是小鼠繁殖率高，可以降低实验成本，而且生物学性质清晰而且便于操作等优势，是研究人类疾病最佳的模式生物之一，本发明所提供得甲状腺上皮细胞的分离培养方法可以获得产量高、纯度高且生存时间较长的小鼠甲状腺上皮细胞。

技术实现要素：

本发明的目的是建立一种获得产量高、纯度高且生存时间较长的小鼠甲状腺上皮细胞分离培养的方法。

为了解决上述所涉及到的问题，本发明采取如下方法获得小鼠甲状腺上皮细胞：

小鼠甲状腺上皮细胞分离方法的步骤包括：(a)腹腔注射戊巴比妥钠处死小鼠，酒精消毒后取出与气管相连的小鼠甲状腺组织，置于预冷无菌含双抗的PBS缓冲液中浸泡洗涤，并剥离甲状腺组织；(b)机械解离甲状腺组织后，预热混合酶液震荡消化30-40min，Ficoll分离甲状腺单个核细胞，离心获取细胞沉淀；(c)混合完全培养基重悬细胞沉淀，接种于处理后的细胞瓶中，差速贴壁法获得甲状腺上皮细胞；(d)混合完全培养基培养纯化后的甲状腺上皮细胞。

可选的小鼠为体重20-25g，6-8周龄的小鼠。

可选的消化所用消化酶液为预先在37℃预热的0.05％-0.1％(m/v)胰酶、0.1％-0.2％(m/v)I型胶原酶、0.05％-0.15％(m/v)II型胶原酶和1-2U/mL中性蛋白酶的酶混合液，消化时间为30-40min；

可选的震荡消化的方法为37℃水浴震荡，震荡频率为250-300次/min；

可选的细胞瓶的处理方法为含5％的小鼠血清37℃孵育过夜；

可选的差速贴壁方法为细胞悬液在37℃培养箱中贴壁20-30min后，将未贴壁的细胞悬液重新转接于新的包被板中，重复一次该步骤。

可选的混合完全培养基的基础培养基为RPMI1640、DMEM/F12和α-MEM(1∶1∶1～1∶1.5∶1)。

可选的混合完全培养基中的添加因子为100μg/mL牛垂体和下丘脑提取物、10ng/mL氢化可的松、10μg/mL胰岛素、20-50ng/mL三碘甲状腺原氨酸、20-50ng/mL表皮生长因子EGF和5％-10％的小鼠血清。

本发明提供的小鼠甲状腺上皮细胞分离方法中消化液选用预热的0.05％-0.1％(m/v)胰酶、0.1％-0.2％(m/v)I型胶原酶、0.05％-0.15％(m/v)II型胶原 酶和1-2U/mL中性蛋白酶混合液用以消化细胞，一方面减少了胰酶的用量，降低了胰酶对甲状腺上皮细胞的损伤，提高了细胞的存活率，另一方面节省了消化所需时间。

本发明提供一种混合完全培养基培养甲状腺细胞的方法，增加了甲状腺上皮细胞的生存期，以及减少了添加因子的种类，降低了成本。

进一步的，本发明选用加入含有100μg/mL牛垂体和下丘脑提取物、10ng/mL氢化可的松、10μg/mL胰岛素、20-50ng/mL三碘甲状腺原氨酸、20-50ng/mL表皮生长因子EGF和10％的小鼠血清的混合完全培养基作为生长初期的细胞接种液，待细胞长成单层时，更换为含5％小鼠血清的混合完全培养基，促进小鼠甲状腺细胞保持较长时间的上皮样。

本发明解决了甲状腺上皮细胞分离培养过程成本高，存活时间短的问题，使获得的小鼠甲状腺上皮细胞产量高、纯度高且生存时间较长。

附图说明

图1：培养5天的小鼠甲状腺上皮细胞；

图2：小鼠甲状腺上皮细胞免疫荧光鉴定。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优势更清新地展现，现将具体实施方式进一步阐述。此处所阐述的具体实施方式仅针对本发明进行解释，并不用于限定本发明。

本发明选择6-8周龄的雄性小鼠，分离甲状腺上皮细胞。具体操作如下：

1、取6-8周龄的雄性小鼠，腹腔注射戊巴比妥钠处死小鼠，固定小鼠，75％的酒精消毒后取出与气管相连的小鼠甲状腺组织，置于预冷无菌含双抗的PBS 缓冲液中浸泡洗涤，并剥离甲状腺组织；

2、在冰上于显微镜下迅速地去除甲状腺上的包膜、血细胞及结缔组织等附着物，将剥离后的甲状腺转至新的PBS缓冲液中清洗2次；

3、在冰上用解剖剪机械剪碎甲状腺组织，大小约1mm³左右的碎块；

4、将剪碎的组织加入预热的4-5倍体积的消化混合液，于37℃震荡消化30-40min，震荡频率为250-300次/min；所述消化混合液包括0.05％-0.1％(m/v)胰酶、0.1％-0.2％(m/v)I型胶原酶、0.05％-0.15％(m/v)II型胶原酶和1-2U/mL中性蛋白酶；

5、吹打使细胞分散，经200目筛网过滤后，加入至含Ficoll的分离液中，2000r/min离心，取中间白色层，1500rpm/min离心5min，弃上清；

6、制备含10％小鼠血清的混合完全培养基：将RPMI1640、DMEM/F12和α-MEM培养基按照1∶1∶1～1∶1.5∶1比例配置成混合基础培养基，在混合基础培养基中加入100μg/mL牛垂体和下丘脑提取物、10ng/mL氢化可的松、10μg/mL胰岛素、20-50ng/mL三碘甲状腺原氨酸、20-50ng/mL表皮生长因子EGF和10％的小鼠血清。

制备含5％小鼠血清的混合完全培养基：将RPMI1640、DMEM/F12和α-MEM培养基按照1∶1∶1～1∶1.5∶1比例配置成混合基础培养基，在混合基础培养基中加入100μg/mL牛垂体和下丘脑提取物、10ng/mL氢化可的松、10μg/mL胰岛素、20-50ng/mL三碘甲状腺原氨酸、20-50ng/mL表皮生长因子EGF和5％的小鼠血清。

7、用10％小鼠血清的混合完全培养基重悬细胞沉淀，接种于经5％的小鼠血清37℃孵育过夜处理后的细胞瓶中，置于37℃、5％(m/v)的CO₂饱和湿度的培养箱中培养20-30min后，将未贴壁的细胞悬液转移至新的处理后的细胞瓶中， 重复一次上述差速贴壁步骤。

8、培养24h后，更换为5％小鼠血清的混合完全培养基，显微镜下可见细胞贴壁，呈聚集生长，细胞呈圆形或椭圆形。

9、免疫荧光鉴定：(1)待细胞生长5d后，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4％多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；(2)PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；(3)PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4％BSA封闭细胞30min；(4)按1∶100的比例稀释单克隆Cytokeratin-18一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育过夜；(5)PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1∶100的比例稀释二抗，37℃条件下放置1h；(6)用PBS冲洗3次，每次10min，最后DAPI染细胞核并用荧光显微镜拍照。

以上已经对本发明创造的较佳实施例进行详细阐述，但本发明创造不限定于上述实施例，凡在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。