肿瘤血管内皮细胞标志物8突变体、其融合蛋白及应用
【专利摘要】本发明公开了一种肿瘤血管内皮细胞标志物8的蛋白突变体，所述蛋白突变体与人血清白蛋白的融合蛋白及其在制备治疗和/或预防炭疽感染药物中的应用。本发明公开的蛋白突变体显著提高了与炭疽PA抗原的亲和力，对炭疽毒素的抑制活性与sCMG2相似，对受炭疽毒素LeTx攻击的大鼠保护率为100％，所述蛋白突变体与人血清白蛋白融合后，其体内半衰期延长了近10倍，能在14天内完全保护受炭疽毒素LeTx攻击的试验动物。
【专利说明】
肿瘤血管内皮细胞标志物8突变体、其融合蛋白及应用
技术领域
[0001] 本发明公开了一种重组的融合蛋白，属于分子生物学领域。
【背景技术】
[0002] 炭疽是由炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)感染引起的人畜共患烈性传染病。 炭疽毒素是炭疽芽孢杆菌的主要毒力因子之一，它包含保护性抗原(Protective Antigen， PA)、致死因子(Lethal Factor，LF)、水肿因子(Edema Factor，EF)三种蛋白质成分。炭疽毒 素通过PA与革E细胞上的受体肿瘤血管内皮细胞标志物8(Tumor Endothelial Marker 8/ Anthrax Toxin Receptor 1，TEM8)或毛细血管形态发生蛋白2(Capillary Morphogenesis Protein 2/Anthrax Toxin Receptor 2，CMG2)结合介导LF和EF进入胞内发挥作用，因此阻 断PA与受体的结合是炭疽毒素抑制剂研究的重要靶点。CMG2和TEM8均为单次跨膜蛋白，通 过胞外区的vWA结构域与PA结合。国外已报道CMG2单体和CMG2-PA复合物的晶体结构，但对 TEM8的结构学研究一直没有进展。
【申请人】前期与中科院生物物理所合作，完成了 TEM8胞外 区vWA结构域的晶体解析(PLoS 0ne2010，5: el 1203)，在此基础上优化了体外结合条件，利 用凝胶过滤层析分离出TEM8-PA的复合物，生长出复合物晶体，利用分子置换法解析了 3.2 A的PA与TEM8VWA结构域复合物的三维晶体结构。
[0003] 分析发现，TEM8和CMG2与PA的结合模式十分相似，都是通过以MIDAS基序为核心的 接触面与PA的结构域IV和结构域II相互作用。通过将TEM8-PA的晶体数据与CMG2-PA进行比 较分析，发现在与PA的结合面上TEM8有多个氨基酸残基与CMG2不同，可能是影响两种受体 与PA亲和力差异的关键位点。为从功能上验证结构学的分析结果，发明人采用E.coli系统 重组表达的方式，构建了一系列的TEM8和CMG2的突变体，将二者与PA接触面的一些关键氨 基酸进行互换。通过发明人建立的对炭疽毒素敏感的J774A.1细胞模型，对突变体的生物学 活性进行了比较分析。结果发现:TEM8上的K51、Y119、E122等与CMG2-致的保守氨基酸残基 对两种受体与PA的亲和力均非常重要;而L56、E152、H154-F159等与CMG2差异的残基是影响 二者与PA亲和力差异的关键位点。当将TEM8上的L56、E152、H154-F159等残基突变为CMG2相 应位置的氨基酸残基时，可显著提高TEM8与PA的亲和力。
[0004] 根据炭疽毒素受体设计的可溶性类受体分子可与细胞膜上的受体竞争，从而阻断 毒素进入细胞。国外重组表达的CMG2vWA结构域(sCMG2)作为竞争性抑制剂在动物试验中可 抵抗炭疽毒素的攻击。由于TEM8与PA的亲和力相对CMG2较弱，重组表达的TEM8vWA结构域 (STEMS)被认为不适合作为毒素抑制剂。而发明人在前期研究中根据结构预测设计出STEMS 突变体L56A与PA的亲和力显著提高，说明基于TEM8设计的类受体分子也可以作为炭疽毒素 抑制剂进行研究(PLoS One 2011，6:e20646)。
[0005] 本发明意欲在L56A基础上，基于TEM8-PA复合物的晶体数据获得具有更高亲和力， 更高保护率的TEM8突变体，以及具有更长半衰期的TEM8突变体融合蛋白，以开发其在医药 制备上的应用。
【发明内容】
[0006] 发明人在获得TEM8-PA复合物的晶体数据后，在L56A基础上，通过联合突变多个影 响TEM8与PA亲和力的关键氨基酸位点，设计了一个新的类受体分子，命名为MT4。
[0007] 因此本发明首先提供了一种肿瘤血管内皮细胞标志物8(TEM8)的蛋白突变体，所 述突变体的序列如SEQ ID NO. 1的第607位至788位氨基酸所示。所述sTEM8在第56、152、 154-159位氨基酸发生了突变（相对于野生型氨基酸改变为：L56A、E152K、H154D、E155G、 D156L、L157V、F158P、F159S、C177A)。
[0008] 本发明还提供了一种含有上述蛋白突变体的融合蛋白。
[0009] 优选地，在所述融合蛋白中，上述蛋白突变体的氨基端和/或羧基端连接有SEQ ID NO: 1的第1位至585位氨基酸序列所示的多肽，所述多肽为人血清白蛋白HSA。
[0010] 优选地，所述蛋白突变体与所述多肽由连接肽连接，所述连接肽为(G4S)n，其中η为 1-5之间的整数;其中η优选等于3。
[0011]在一个优选的技术方案中，所述融合蛋白的序列为SEQ ID NO: 1所示。
[0012]本发明还提供了一种编码权利要求1所述蛋白突变体的核苷酸序列，所述序列由 SEQ ID N0:2的第1819位至2364位碱基所示。
[0013]本发明提供了能够上述蛋白突变体的表达载体，所述载体为PHAT2。
[0014]本发明又提供了一种能够表达上述蛋白突变体的表达载体，所述载体为所述载体 为PMEX9K。
[0015]优选地，所述载体含有如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。
[0016] 本发明还提供了 一种含有上述表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为GS115毕赤 酵母菌。
[0017] 最后，本发明提供了上述融合蛋白在制备治疗和/或预防炭疽感染药物中的应用。
[0018] 本发明利用E.coli表达系统，制备了带His标签的重组MT4,并采用亲和层析、离子 交换层析等方法进行了纯化，获得的MT4样品纯度在90 %以上，内毒素浓度〈0.25EU/mL。
[0019] 利用BiacoreT200测定了MT4以及项目组前期获得的sCMG2、L56A等类受体候选分 子与PA的体外亲和力。结果显示MT4与PA的亲和力常数为0·374ηΜ，亲和力高于L56A (0.520ηΜ)。利用J774A.1细胞模型评价了上述几种类受体分子对炭疽致死毒素(LeTx)的中 和活性，结果显示MT4的IC 5Q为2.29nM，好于L56A(4.45nM)，较sTEM8提高了近10倍(27.2nM)。 在Fisher 344大鼠模型上进行LeTx的攻击保护试验是评价炭疽毒素抑制剂生物活性的主 要方法。我们重组制备了 LeTx，对上述几种类受体分子进行了大鼠体内炭疽LeTx中和活性 评价。将类受体蛋白与LeTx(20yg PA+10yg LF/只）体外预混30min后，通过尾静脉注射入大 鼠体内，观察大鼠的生存情况，结果显示MT4和sCMG2在与LeTx摩尔比为1:1时能够100%保 护大鼠，而L56A的保护率为40%。以上结果表明，我们构建的基于sTEM8的突变体分子MT4显 著提高了与PA的亲和力，对炭疽毒素的抑制活性与sCMG2相似。
[0020] 与人血清白蛋白HSA融合是提高蛋白类药物血浆半衰期的一种常用策略，本项目 尝试将MT4与HSA进行融合，以期能够延长MT4的血浆半衰期，同时避免对MT4抑制毒素活性 的影响。本发明通过3 X G4S的1 inker将HSA和MT4连接，将基因片段插入酵母表达载体 PMEX9K，通过电转毕赤酵母GS115，进行甲醇诱导分泌表达。SDS-PAGE和Western blot检测 证实HSA和MT4的融合蛋白HSA-MT4能够在酵母培养上清中大量表达，表达量约lOOmg/L。建 立了 HSA-MT4的纯化方法，通过Blue亲和层析柱和阴离子交换层析柱两步纯化可获得纯度〉 90%的融合蛋白。
[0021] 在细胞模型上对HSA-MT4与MT4的毒素中和活性进行了比较，结果显示HSA-MT4和 MT4的IC5Q分别为1.20nM、1.2InM，二者十分接近。在SD大鼠体内，用ELISA法检测不同时间点 HSA-MT4在血液中的浓度，推算HSA-MT4的体内半衰期约为5h，相较MT4的体内半衰期，延长 了近10倍。
[0022]在Fisher344大鼠模型上进行了类受体对炭疽毒素攻击的保护效果评价，将类受 体蛋白在体外与LeTx(20yg PA+10yg LF/只）以不同摩尔比例体外混合30min，再通过尾静 脉注射入大鼠体内，观察大鼠的生存情况，结果显示无论与PA摩尔比为2:1或1:1时，HSA-MT4均能在14天内完全保护试验动物。
【附图说明】
[0023]图1.MT4的凝胶电泳图谱；
[0024] 图2.MT4的WB检测图谱；
[0025] 图3.MT4和L56A与PA83结合的动力学曲线图；
[0026] 图 4 · MT4、L56A、s TEM8 的 I C5〇 曲线图；
[0027] 图5.MT4、L56A、sTEM8的动物保护率比较图；
[0028] 图6.HSA-MT4的表达质粒示意图；
[0029] 图7.HSA-MT4的凝胶电泳图谱；
[0030] 图8.HSA-MT4的WB检测图谱；
[0031]图9.ELISA检测不同时间点大鼠血浆中HSA-MT4含量曲线图；
[0032]图10. HSA-MT4融合蛋白的细胞模型中和活性评价比较图；
[0033]图11. HSA-MT4融合蛋白的动物模型中和活性评价比较图。
【具体实施方式】
[0034]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
[0035] 实施例1 TEM8突变体MT4的表达 [0036] 1、突变体MT4的表达质粒构建
[0037]以1^564-?说了2为模板，利用反向？0尺技术将152、154-159位氨基酸进行突变，反应 体系为50yL，具体见表1.
[0038] 表1.PCR反应体系（1)
[0039]
[0040] 反应条件为：
[0041]
[0042] 将PCR产物进行模板的消化，然后进行磷酸化并连接过夜;转化DH5a感受态细胞、 涂布含有Amp的LB平板，培养至克隆生长。
[0043]引物序列：
[0044] MT4-R：GCCATCGAGTTTTCCATCAGTCAAAGCAATGATG
[0045] MT4-F：CTGGTGCCGAGCTATTCAGAGAGGGAGGCTAATAG
[0046] 2、蛋白的表达纯化
[0047] 将经过测序并且确认序列正确的MT4-PHAT2质粒转化BL21大肠杆菌感受态中，涂 板待有克隆长出后挑取单克隆进行培养过夜，放大培养至1L待对数生长期时加入IPTG至终 浓度为〇.5mM，降温至16°C培养16h，收菌弃上清。
[0048] 以PHAT2(参考文献:Anal. Biochem. 236，371-373.)为表达载体的MT4在其N端带有 His-tag，因此我们利用这一特点采取了先亲和层析后离子交换层析的纯化策略。第一步采 用His-Trap FF进行亲和层析，结合缓冲液为（20mM Tris+500mM Nacl+20mM imidazole， PH8.0)，洗脱缓冲液为（20mM Tris+500mM Nacl+500mM imidazole，PH8.0)。待洗脱结束，用 20mM Tris，PH7.4对回收峰进行超滤换液，然后上样阴离子层析柱，采用洗脱缓冲液(20mM Tris+500mM Nacl，PH7.4)进行线性洗脱。用roS对洗脱峰进行超滤换液，测内毒素含量，对 蛋白进行BCA法定量，分装冻存于-70 °C (参见图1和图2)。图1 MT4蛋白的SDS-PAG图谱，Μ泳 道为蛋白分子量标准。图2为ΜΤ4的Western Blot分析图谱，采用Anti-TEM8鼠单抗对纯化后 的MT4进行Western Blot分析，以sTEM8为阳性对照、TBC蛋白为无关蛋白对照、Blank为MT4 所处的保存缓冲液，图2结果显示MT4能与抗体很好的结合。
[0049] 3、SPR测定亲和力
[0050] 1)PA83与CM5芯片的偶联；
[0051 ] a.预富集：测试蛋白PA83 (PA83制备参见生物工程学报2004; 20:652-5)在不同醋 酸钠溶液(pH 5.0,4.5,4.0)中在芯片表面的富集能力；
[0052] b.CM5芯片(GE公司产品）的活化；
[0053] c.按比例偶联一定RU(响应值）的蛋白PA到芯片上，考虑到氣基偶联的不定向性， 大约50-70 %有活性，做出相应调整；
[0054] d.乙醇胺封闭多余活化位点。
[0055] 2)PA83与MT4的动力学分析
[0056] a.表面测试:将待测样品适当稀释，进样流过芯片表面，即可观察到两个蛋白是否 结合。同时观察蛋白解离过程，摸索再生条件（将Analyte完全洗脱Ligand，一般使用 Glycine-HCl或者高盐）；
[0057] b.调节浓度和进样时间，得到合适的结合曲线(有饱和的趋势），此时Analyte浓度 为C;
[0058] c.配置浓度C，C/2，C/4，C/8，C/16，C/32，五到六个浓度梯度，依次流过芯片表面； [0059] d.结果通过自带Evaluation软件自动分析，拟合得到结合速率Ka，解离速率Kd，亲 和力 KD=Kd/Ka。
[0060]通过SPR实验对通过细胞模型筛选获得的类受体分子MT4与PA83的亲和力进行测 定，结果显示MT4与PA83的亲和力常数KD = 0.374nM，高于L56A(0.52nM)(参见图3)。
[0061 ] 4、MT4在细胞模型上中和活性的评价
[0062] 炭疽保护性抗原（PA)和致死因子（LF)可形成炭疽致死毒素，对小鼠巨噬细胞 J774A.1产生致死效应。类受体能够通过结合炭疽毒素发挥保护细胞的作用。噻唑蓝(MTT) 可被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为不溶于水的蓝色结晶，并沉积在细胞中，而死 细胞无此功能。因此可通过溶解结晶后测定特定波长下的吸光值来计算细胞的存活率，从 而推算出类受体的IC 5Q。具体方法参见文献:Plos One 2011.6.e20646。
[0063] 使用J774A.1细胞模型评价MT4毒素中和活性，结果显示MT4、L56A、sTEM8的IC 50分 别为2.29nmo 1/L、4.45nmo 1/L、27.2nmo 1/L;MT4较L56A毒素中和活性提高了一倍以上(参见 图4)。
[0064] 5、动物模型上的毒素中和活性评价
[0065] MT4的体内毒素中和效果评价使用Fisher344大鼠模型，攻毒剂量为每只大鼠 （rPA +rLF = 20yg+10yg/只），具体操作方法见参考文献:Plos 0ne2011 · 6 · e20646。
[0066]当MT4与PA摩尔比为1:1时，能够完全保护大鼠；而在相同摩尔比的情况下，L56A仅 有40 %动物存活；sTEM8在与PA摩尔比6:1情况下仍然不能保护大鼠。以上结果显示，MT4在 体内中和毒素能力大大超越了 sTEM8,并且也优于实验室前期获得的类受体分子L56A(参见 图5)。
[0067]实施例2 HAS-MT4融合蛋白的表达和分析 [0068] 1.HSA与MT4融合蛋白的构建
[0069]与HSA融合是一种常用的延长蛋白半衰期的方法。为了更方便的构建HSA-MT4融合 蛋白，我们对已有的酵母表达质粒PMEX9K-HSA-CMG2进行了改造，在1 inker与CMG2之间插入 了NgoMIV和Spel两个唯一的限制性酶切位点，利用其中的一个限制性酶切位点与质粒上已 有的No 11将MT4连入到表达载体中，模式图如图6所示。
[0070] PCR过程包括两步:第一步在MT4两端添加 NgoMIV/Spel和Notl酶切位点。反应体系 为50yL，具体见表2。
[0071] 表2.PCR反应体系（2)
[0072]
[0073]
[0074]
[0075] 第二步PCR是在HSA-CMG2-pMEX9K质粒linker后加入NgoMIV/Spe頂每切位点。反应 体系为50yL，具体见表3。
[0076] 表3.PCR反应体系（3)
[0077]
[0079] 反应条件为：
[0080]
[0081] 引物序列：
[0082] NSNOT F：CATTGCCGGCACTAGTGCCTGCTACGGCGGATTTGAC
[0083] NSNOT R：CATAGCGGCCGCTTAAATTTCGAT
[0084] GCAGGACTTCTTCAAAATTGAGTG
[0085] PHLV F：CCGGCACTAGTTGCAGAAGAGCCTTTGATC
[0086] PHLV R：CCGATCCGCCACCGCCAGAG
[0087] MT4片段通过Spel和Not頂每切位点连入到HSA-CMG2-pMEX9K中，最终获得的HSA-MT4表达载体经测序确认序列与预期一致。
[0088] 2、HSA-MT4融合蛋白的表达
[0089] 将构建好的HSA-MT4质粒用Sail线性化后，通过电穿孔系统(BI0-RAD，GenePulser Xcell?)转化到GS115毕赤酵母感受态细胞中（Invitrogen)，涂布于MD平板上，30°C培养。挑 取重组GS115/HSA-MT4单克隆接种至含25ml BMGY培养基的250ml摇瓶中过夜培养，然后转 接至含1L BMGY培养基的5L摇瓶中培养至对数生长期收集培养物，去除原培养基，用1L BMMY培养基重悬酵母细胞，开始诱导表达，每隔24h，添加甲醇至终浓度为0.5%，诱导结束 后，收集酵母表达上清。对酵母表达上清进行超滤浓缩换液成20mmol/L PB(磷酸盐缓冲 液），PH7 · 4。使用亲合层析柱Blue-Sepharose(GE，Healthcare)进行粗纯化，在中性pH值上 样，样品使用2mo 1 /L Nac 1洗脱;将洗脱峰回收合并，超滤换液至20mmo 1 /L PB，在中性PH下 上样Q-HP柱(GE，Healthcare)，使用20mmol/L PB+lmol/L Nacl洗脱，收集洗脱峰回收合并， 置换到PBS中保存样品。蛋白含量测定并进行SDS-PAGE凝胶电泳和Western Blot检测(参见 图7和图8)。
[0090] 图7显示HSA-MT4蛋白大小与预期较为一致，约为89kDa。图8为HSA-MT4的WB检测图 谱，MT4-Fc作为阳性对照、HSA-CMG2作为无关蛋白阴性对照、Blank是蛋白保存缓冲液(PBS) 作为空白对照，结果显示通过anti-TEM8抗体也检测到相应条带，证明HSA-MT4能够与anti-TEM8抗体特异性的结合。
[0091] 3、HSA-MT4融合蛋白的体内半衰期
[0092]雄性SD大鼠，每只采用尾静脉注射用PBS稀释的HSA-MT4蛋白。在注射前以及注射 后的不同时间点采血，血样收集在用肝素处理的EP管中，分离血浆，分装冻存于-20°C待用。 ELISA双抗体夹心法检测体内待测类受体浓度，PBS包被4yg/mL的anti-TEM8单抗，4°C过夜， 次日用PBST (含0.2%吐温-20)洗涤4次，每次5分钟;然后2%BSA于37°C封闭lh，重复洗涤步 骤;按照5%体积的比例向96孔板中加入待测样品，37°C孵育lh，重复洗涤步骤;加入anti-HSA多抗，37 °C孵育lh，洗涤；加入anti-Rabbi t-HRP孵育后显色，于450/630nm下读取0D值。 利用0D值换算出每个时间点大鼠体内血液中待测样品的浓度，根据浓度与时间的变化关 系，最终推算出待测类受体在SD大鼠体内的半衰期。经计算HSA-MT4在SD大鼠的体内半衰期 为 5.01±2.81h(参见图 9)。
[0093] 4、HSA-MT4融合蛋白的细胞模型中和活性评价
[0094] 评价方法与MT4的细胞模型评价相同。如图10显示，HSA-MT4与MT4的IC5Q分别为 1.20nM和1.21nM，二者之间没有统计学差异，说明融合HSA后没有影响MT4在细胞模型上的 中和活性。
[0095] 5、HSA-MT4融合蛋白的动物模型中和活性评价
[0096] 评价方法与MT4的动物模型评价相同。如图11显示，HSA-MT4和MT4与PA摩尔比为1: 1时均能够完全保护F344大鼠，提示HSA-MT4在动物体内的中和活性与MT4类似。
【主权项】
1. 一种肿瘤血管内皮细胞标志物8的蛋白突变体，其特征在于，所述突变体的序列如 SEQ ID NO: 1的第607位至788位氨基酸所示。2. -种含有权利要求1所述蛋白突变体的融合蛋白。3. 根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，在所述蛋白突变体的氨基端和/或羧 基端连接有人血清白蛋白，所述人血清白蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1的第1位至585 位所示。4. 根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白突变体与所述多肽由连接肽 连接，所述连接肽为(G4S) n，其中η为1 -5之间的整数。5. 根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，η = 3。6. 根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的序列为SEQ ID Ν0:1 所示。7. -种编码权利要求1所述蛋白突变体的核苷酸序列，其特征在于，所述序列由SEQ ID NO: 2的第1819位至2364位碱基所示。8. -种能够表达权利要求1所述蛋白突变体的表达载体，其特征在于，所述载体为 PHAT2。9. 一种能够表达权利要求6所述融合蛋白的表达载体，其特征在于，所述载体为 pMEX9K〇10. 根据权利要求8所述的载体，所述载体含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。11. 一种含有权利要求8-10任一权利要求所述表达载体的宿主细胞，其特在在于，所述 宿主细胞为GS115毕赤酵母菌。12. 权利要求1-6任一所述的融合蛋白在制备治疗和/或预防炭疽感染药物中的应用。
【文档编号】C12N15/81GK106084026SQ201610440827
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月19日
【发明人】陈薇, 徐俊杰, 李亮亮, 郭强, 张军, 董大勇, 殷瑛, 蔡晨光, 付玲
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所