一种大鼠肺微血管内皮细胞的分离培养与鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物领域，具体涉及一种大鼠肺微血管内皮细胞的分离培养与鉴定方法。
【背景技术】
[0002]肺微血管内皮细胞(pulmonarymicrovascular endothelial cells，PMVECs)在急性肺损伤、肺动脉高压等疾病的研宄中发挥重要的作用，是肺内最早激活的效应细胞。微血管内皮细胞衬附于血管内壁，定位于进行血液-组织交换的微血管，它不仅是构成血管组织间屏障的重要成分，而且在调节机体内环境的稳定、维持正常生理和免疫功能，以及介导疾病的发生、发展和转归等方面都发挥主要的作用。
[0003]血管内皮细胞不仅具有屏障作用，而且能对各种刺激作出不同的应答反应，在生理和病理情况下都起着重要作用。研宄显示，肺大血管和肺微血管内皮细胞的结构和功能存在着差异，而肺微血管内皮细胞较大血管对周围环境具有更强的适应性。肺微血管与急性呼吸窘迫综合征、肺动脉高压等疾病的发生有关，故培养和研宄肺微血管内皮细胞则非常必要。目前国内研宄这方面的文章较少，可能与该细胞不容易原代培养有一定的关系。
[0004]由于肺微血管内皮细胞广泛涉及多种疾病的发病机制，应用体外培养的微血管内皮细胞，可以构建多种实验模型来研宄生理和病理情况下微血管内皮细胞的基因、表型和功能，探讨各种组织细胞相互作用及其调控机制。不同器官和组织起源的微血管内皮细胞在形态、基因、表型和功能方面有所差别。因此，研宄发生于某一器官或组织的微血管病变，应采用这一器官或组织的微血管内皮细胞作为研宄的细胞模型，而不宜使用其他来源的血管内皮细胞来取代。
[0005]但是，由于微血管内皮细胞培养难度较大、研宄成本较高，从而使它的普及和应用受到一定的限制，体外培养PMVECs以构建实验模型，对深入研宄生理和病理情况下PMVECs的基因、表型、功能变化及其调控机制具有重要意义。目前虽然国内外已有许多关于PMVECs体外分离培养和鉴定方法的报道，但PMVECs的原代细胞培养难度仍较大，细胞培养成功率较低，重复性差，而成本较高。
【发明内容】
[0006]针对上述现有技术存在的问题，本发明采用ECM内皮细胞专用培养基培养大鼠肺微血管内皮细胞，建立了一种取材方便、操作简单、繁殖速度快、纯度高的一种大鼠肺微血管内皮细胞的分离培养与鉴定方法。
[0007]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种大鼠肺微血管内皮细胞分离培养与鉴定方法，包括以下步骤:
[0008](I)组织细胞的分离:取四周龄的SD大鼠，雌雄不分，按照50mg/kg比例腹腔注射2%戊巴比妥钠，麻醉后，胸腹部剃毛后在超净台内用75%酒精进行胸腹部的擦拭消毒，打开腹腔，腹主静脉放血并换打开胸腔，剪去左心耳，放出肺循环中的血液；取出心肺，放入DMEM培养液(含100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)中洗涤三次，每次Imin ;除去心脏，将肺组织移入新的DMEM培养液(含100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)中进行清洗2次，清洗后，将肺组织移入干燥培养皿中，加DMEM培养液(含100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)，以刚没过肺脏为宜，用细弯镊撕去肺表面的胸膜，剪下2-3_宽的肺外边缘组织块；将剪下的边缘组织块移入干燥的培养皿中，用PBS液清洗2次，清洗后，将组织块移入无菌的抗生素瓶中，并加入2ml DMEM培养液(含10% FCS)以刚没过组织块为宜，用眼科剪将其剪成约ImmX ImmX Imm大小的组织块，然后用弯头滴管吸取组织块接种到100_培养皿中，于5%CO2培养箱中在37°C条件下培养。
[0009](2)细胞的培养:2h后，加入5-6ml ECM培养液(含5% FBS、I % ECGS)，培养液以每隔48h更换I次培养基继续培养，72h后移除组织块，更换培养基，继续培养；一般培养
3-5天后，细胞可以汇合成单层，可用于培养P3代细胞；原代细胞培养3-5天后，细胞汇合成单层，进行传代培养；弃去培养瓶中的培养液，用PBS溶液洗涤I遍，加入1.5mL 0.125%的胰酶消化，显微镜下见细胞开始皱缩变圆时，吹打培养瓶瓶底使细胞完全脱壁，加入适量含血清培养基终止消化；将消化的细胞转移到无菌离心管中，1000转/分，离心5min ;弃上清，用含5%胎牛血清的内皮细胞专用培养基重悬细胞，移入75cm2培养瓶中传代培养，24h后第一次换液，之后间隔2-3d换液I次并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。
[0010](3)细胞纯度鉴定:用无菌试管收集P3代的PMVECs两管，每管约2 X 106个细胞，一管加APC标记抗人⑶31抗体，另一管加同型阴性对照，4°C避光孵育30min ；PBS洗涤，1000转/min，离心1min ;弃上清液后再加入0.5mL PBS重悬细胞，200目细胞筛过滤去除细胞团块；流式细胞仪检测细胞纯度。
[0011]本发明的有益效果是:本发明采用ECM内皮细胞专用培养基培养大鼠肺微血管内皮细胞，建立了一种取材方便、操作简单、繁殖速度快、纯度高的一种大鼠肺微血管内皮细胞的分离培养与鉴定方法。
【附图说明】
[0012]图1为本发明的流程框图。
[0013]图2为本发明肺血管内皮细胞原代培养；其中，图a为边缘肺组织消毒后，剪切成ImmX ImmX Imm大小的组织块，组织块法培养肺微血管内皮细胞30h ;图b为组织块培养48h ;图c为培养60h ;图d为原代细胞经5% FBS+1 % ECGS的ECM培养，5天细胞融合。
[0014]图3为流式细胞仪纯度检测结果；结果显示99.28%的细胞表面抗原⑶31表达阳性，即培养的PMVECs纯度高达99.28%。
【具体实施方式】
[0015]下面结合附图对本发明作进一步说明。
[0016]实施例1
[0017]取四周龄的SD大鼠，雌雄皆可，按照50mg/kg比例腹腔注射2%戊巴比妥钠，麻醉后，胸腹部剃毛后在超净台内用75%酒精进行胸腹部的擦拭消毒，打开腹腔，腹主静脉放血并换打开胸腔，剪去左心耳，放出肺循环中的血液；取出心肺，放入DMEM培养液(含100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)中洗涤三次，每次Imin ;除去心脏，将肺组织移入新的DMEM培养液(含100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)中进行清洗2次，清洗后，将肺组织移入干燥培养皿中，加DMEM培养液(含100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)，以刚没过肺脏为宜，用细弯镊撕去肺表面的胸膜，剪下2-3_宽的肺外边缘组织块；将剪下的边缘组织块移入干燥的培养皿中，用PBS液清洗2次，清洗后，将组织块移入无菌的抗生素瓶中，并加入2ml DMEM培养液(含10% FCS)以刚没过组织块为宜，用眼科剪将其剪成约1_X ImmX Imm大小的组织块，然后用弯头滴管吸取组织块接种到10mm培养皿中，于5% CO2培养箱中在37°C条件下培养。2h后，加入5-6ml ECM培养液(含5% FBS、I % ECGS)，培养液以每隔48h更换I次培养基继续培养，72h后移除组织块，更换培养基，继续培养；一般培养3-5天后，细胞可以汇合成单层，可用于培养P3代细胞；原代细胞培养3天后，细胞汇合成单层，进行传代培养；弃去培养瓶中的培养液，用PBS溶液洗涤I遍，加入1.5mL 0.125%的胰酶消化，显微镜下见细胞开始皱缩变圆时，吹打培养瓶瓶底使细胞完全脱壁，加入适量含血清培养基终止消化；将消化的细胞转移到无菌离心管中，1000转/分，离心5min ;弃上清，用含5%胎牛血清的内皮细胞专用培养基重悬细胞，移入75cm2培养瓶中传代培养，24h后第一次换液，之后间隔2换液I次并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。用无菌试管收集P3代的PMVECs两管，每管约2 X 106个细胞，一管加APC标记抗人⑶31抗体，另一管加同型阴性对照，4°C避光孵育30min ；PBS洗涤，1000转/min，离心1min ;弃上清液后再加入0.5mL PBS重悬细胞，200目细胞筛过滤去除细胞团块；流式细胞仪检测细胞纯度，如图3所示，培养的PMVECs纯度尚达99.28% ο
[0018]实施例2
[0019]取四周龄的SD大鼠，雌雄皆可，按照50mg/kg比例腹腔注射2%戊巴比妥钠，麻醉后，胸腹部剃毛后在超净台内用75%酒精进行胸腹部的擦拭消毒，打开腹腔，腹主静脉放血并换打开胸腔，剪去左心耳，放出肺循环中的血液；取出心肺，放入DMEM培养液(含100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)中洗涤三次，每次Imin ;除去心脏，将肺组织移入新的DMEM培养液(含100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)中进行清洗2次，清洗后，将肺组织移入干燥培养皿中，加DMEM培养液(含100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)，以刚没过肺脏为宜，用细弯镊撕去肺表面的胸膜，剪下2-3_宽的肺外边缘组织块；将剪下的边缘组织块移入干燥的培养皿中，用PBS液清洗2次，清洗后，将组织块移入无菌的抗生素瓶中，并