专利名称：成年大鼠心脏微血管内皮细胞体外分离、扩增的方法
技术领域：
本发明涉及一种成年大鼠心脏微血管内皮细胞体外分离、扩增的方法，其为 一种利用大鼠心脏微血管内皮细胞的生物学特性，采用胶原酶快速消化及胰蛋 白酶传代分离扩增大鼠心脏微血管内皮细胞的方法。
二背景技术：
微血管起源的内皮细胞不同于大血管起源的内皮细胞，并且不同器官组织 起源的血管内皮细胞也表现出不同的功能特性。内皮细胞内分泌功能相当活跃， 由于其特殊的生理位置，心肌微血管内皮细胞不仅受到血液灌注压力和血液流 动切应力的直接作用，还受到其他器官所没有的反复挤压影响，导致微血管内 细胞无论是在形态，结构，功能还是遗传方面都不同于大血管内皮细胞 一方 面，内皮细胞内分泌功能相当活跃；另一方面，由于其特殊的生理位置，心肌 微血管内皮细胞不仅受到血液灌注压力和血液流动切应力的直接作用，还受到 其他器官所没有的反复挤压影响，导致微血管内细胞无论是在形态，结构，功 能还是遗传方面都展示着不同之处-
形态学方面大血管内皮细胞呈典型内皮细胞的多角形态，而微血管内皮 细胞则形态变化更多，且呈铺路石状生长。
在免疫组化方面VIII因子相关抗原对包括大血管及微血管在内的内皮细 胞具有特异性和敏感性，但是在心内膜内皮细胞它只是弱阳性，在心外膜是阴性。此外，抗CD-31抗体以及抗血管紧张素转化酶(ACE)抗原、乙酰化低密度 脂蛋白(Dil-Ac-LDL)摄取特点在心脏内皮细胞中的表现也提示我们可以用来 进行相关的鉴定其中对乙酰化低密度脂蛋白吞噬的特点是国际公认的鉴定方 法。
在相关的酶活动性实验中微血管内皮细胞包含的Neutral endop印tidase(NEP)要少于大血管内皮细胞，内皮细胞通过纤溶酶原和其抑制 剂参与纤溶系统的运行，大血管和微血管内皮细胞产生的血浆纤溶酶原激活物 (t-PA)相当，但是，微血管内皮细胞产生的t-PA抑制剂却较少。
在遗传方面无论是在体内还是体外，均可以观察到心肌微血管内皮细胞 和大血管内皮细胞在分子水平上所保持的区别。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成年大鼠心脏微血管内皮细胞体外分离、扩增 的方法，其提供了心脏内皮功能相关研究的理想细胞模型以及心肌梗死后血管 新生治疗以及组织工程细胞的补充来源，为深入研究临床治疗心肌梗死、心血 管内皮功能障碍等奠定了基础。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
一种成年大鼠心脏微血管内皮细胞体外分离、扩增的方法，其特征在于.. (1)利用心脏微血管内皮细胞的生物学特性，采用酶消化法分离富集成年大鼠 心脏微血管内皮细胞，利用内皮细胞的自我更新和增殖特性进行扩增，从而获
得大量心脏微血管内皮细胞；(2)分离出的细胞在体外进行分离纯化；(3)分 离出的细胞在体外进行纯化扩增。
在步骤(1)中，采用DMEM +20%新生牛血清作为基本培养基。在步骤(1)中，通过0.2呢n型胶原酶震荡消化5min，加0. 1%胰蛋白酶继续 消化5min,用含20%新生牛血清DMEM培养液终止消化，从而获得高纯度大量心 脏微血管内皮细胞。
在步骤(2)中，将得到的细胞接种于铺有鼠尾胶的培养皿中，置于37'C恒 温的5% C02培养箱中孵育，从而获得高纯度大量心脏微血管内皮细胞。
在步骤(3)中，在传代培养中采用胰蛋白酶降低非CMECs的贴壁能力， 根据不同的贴壁时间达到纯化的目的。
在步骤(3)中，通过及时、反复传代对成年大鼠心脏微血管内皮细胞进行 纯化和扩增培养，从而达到扩增的目的。
上述方法的详细步骤取2只SD大鼠，3%戊巴比妥钠30mg/Kg腹腔麻醉 后打开胸腔，摘取心脏,用PBS缓冲液冲洗心腔直至冲出液清亮为止；去除心房 及右心室后，沿前壁切开左心室，75%酒精灭活30 s后迅速取出，置于PBS缓冲 液中去除残余的酒精。剪去内、外膜，剪碎心肌组织，0.2%11型胶原酶震荡消 化5min,加0. 1%胰蛋白酶继续消化5min，用含20%新生牛血清DMEM培养液终止 消化；收集消化液，1000 r /min离心10 min。弃上清，用含20%新生牛血清， 青霉素100 IU /ml，链霉素100 u g/ml的DMEM培养液悬浮细胞，接种于铺有鼠 尾胶的培养皿中，置于37"C恒温的5% C02培养箱中孵育6 h换液，以后每三天 换培养液一次至细胞长成融合单层；0. 25%胰蛋白酶消化传代至盖玻片上,待长 满后用PBS洗三遍，置冰丙酮中固定20min备用。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下
确认微血管内皮细胞的最好办法是测定细胞的一系列特征后作出综合评 定。因此，建立科学的心肌微血管内皮细胞的培养方法，并且对其生物学特性和功能进行深入观察和研究，这对于阐明其独特生物学特性及在心血管疾病的 研究中有着非常重要的意义。
四
图1为大鼠心脏微血管内皮细胞体外分离后生物学特性及鉴定图； 图2为大鼠心脏微血管内皮细胞分离纯化后表型及功能鉴定图。 五具体实施例方式
本发明为一种利用大鼠心脏微血管内皮细胞的生物学特性，采用胶原酶快 速消化及胰蛋白酶传代分离扩增大鼠心脏微血管内皮细胞的方法。
本发明采用以下技术方案1)利用心脏微血管内皮细胞的生物学特性，采 用酶消化法分离富集成年大鼠心脏微血管内皮细胞，利用内皮细胞的自我更新 和增殖特性进行扩增，从而达到获得大量心脏微血管内皮细胞细胞的目的。2) 分离出的细胞在体外进行分离纯化的方案，其特征在于将即刻分离的细胞细胞 接种于铺有鼠尾胶的培养皿中进行扩大培养；3)分离出的细胞在体外进行纯化 扩增的方案，其特征还在于采用胰蛋白酶降低非CMECs的贴壁能力，根据不同的 贴壁时间达到纯化并反复传代进行扩增。
实施方式
1.内皮细胞的分离、培养
取2只(150-200g) SD大鼠，3yo戊巴比妥钠(30mg/Kg)腹腔麻醉后打开胸 腔，摘取心脏，用PBS缓冲液冲洗心腔直至冲出液清亮为止。去除心房及右心室 后，沿前壁切开左心室，75%酒精灭活30 s后迅速取出，置于PBS缓冲液中去除 残余的酒精。剪去内、外膜，剪碎心肌组织，0.2%11型胶原酶震荡消化5min,加0. 1%胰蛋白酶继续消化5min，用含20%新生牛血清DMEM培养液终止消化。收 集消化液，1000 r /min离心10 min。弃上清，用DMEM培养液(含20%新生牛血 清，青霉素100 IU /ml，链霉素100u g/ml)悬浮细胞，接种于铺有鼠尾胶的培养 皿中，置于37。C恒温的5% C02培养箱中孵育6 h换液，以后每三天换培养液一 次至细胞长成融合单层。0. 25%胰蛋白酶消化传代至盖玻片上，待长满后用PBS 洗三遍，置冰丙酮中固定20rain备用。
2. 纯化
在传代培养中采用胰蛋白酶是因为原代培养中MECs的生长呈菌落样相互 融合的细胞群，胰蛋白酶消化后会形成单个细胞以便进一步传代培养，同时胰蛋 白酶还能降低非MECs的贴壁能力。根据不同的贴壁时间达到纯化的目的。
3. 鉴定 3. 1形态
A.参见图1A，倒置显微镜观察分离的微血管内皮细胞，2天左右长出单个 细胞，呈三角形或长梭形。3 4天可见细胞分裂增殖形成散在细胞群落;5 6天 细胞紧密排列，连接成片，互不重叠，呈典型的铺路卵石样结构；传代细胞初种时 为明亮的小园球形，3 4 h后大部分细胞贴壁，胞体变大，呈扁平状。以后细胞 迅速分裂增殖，1 2天后细胞融合成单层。
3.1 Dil-Ac-LDL、 UEA-I、 DAPI
0. 25%胰蛋白酶消化传代至盖玻片上，加5ng/mlDiI-Ac-LDL，置37°C、 5% C02
孵箱中培养，激光共聚焦显微镜观察，发红色荧光的细胞为内皮细胞。纯度在 80 90%以上。3.2 VWF(阳性)
将MECs制成5X104化—'的细胞悬液接种于放有盖玻片的6孔板中，每孔3mL。 待细胞长好后取出盖玻片，PBS缓冲液洗2次，冰丙酮固定20inin备用。干燥后 中性树脂将盖玻片粘于载玻片上，VWF抗体染色阳性为MECs。参见图1C，左为 阴性对照，右为阳性大鼠微血管内皮细胞染色阳性。 采用免疫组化SABC法染色
冰丙酮固定的单层细胞爬片PBS振洗3次，每次3min
I
0. 3y。H2O2孵育10min，消除内源性过氧化物酶活性
IPBS振洗3次，每次3min 39&羊血清孵育15min
I PBS振洗3次，每次3min 力口l : IOO稀释兔抗人VWF， 37"C孵育2h
1 PBS振洗3次，每次3min 生物素标记二抗(羊抗兔)h 50孵育15min
4 PBS振洗3次，每次3min 力口l : IOO稀释S-A/HRP
1PBS振洗3次，每次3min DAB显色，苏木素衬染，中性树胶封片，摄片 3. 4 FACS分析
0.25%胰蛋白酶消化传代，加l(￥g/mlDiI-Ac-LDL， 37置37°C、 5% 032孵箱 中培养过夜，FACS分析，发射波长488 nm，接收585 nm。3.5内皮细胞的生长曲线(参见图IB)
取生长状态良好的第3代细胞，接种于24孔培养板内，每孔1X1(T个细胞， 加入lml DMEM培养液，置37。C、 5% C02孵箱中培养；每日(24h)任取3孔， 以0.25%的胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，计数(每次计数3孔，取平均值)，连 续计数7天，绘制生长曲线，计算群体倍增时间(Td)，计算公式Td=t*log2/ (logNt-logNo),其中t代表培养时间，No及Nt分别代表接种后及培养t小时 后的细胞数。
3.6应用Matrigel诱导管腔样结构形成的体外培养体系 Matrigel培养板的准备将冻存于-20 'C的Matrigel于使用前置于4 °C 过夜，融化成黄色胶状液体。根据本实验室的经验，用预冷的微量进样器在短时 间内迅速将Matrigel加等量2XDMEM (含20。/。的胎牛血清/ml、 10ng/mlVEGF、 100U/ml肝素)细胞悬液1.0X107ml混匀，加入预冷的24孔培养板内，每孔 200 ii L/ cm2 ,轻摇培养板使基质胶铺平。然后将培养板放入37 'C孵育箱内，2h 后补充DMEM (含20先的胎牛血清/ml、 10ng/mlVEGF、 100U/ml肝素)培养液。观 察管腔样结构的形成。参见图2A，共聚焦显微镜观察Di1-Ac-LDL， UEA-1摄取， 细胞核为DAPI衬染；参见图2B,流式细胞技术提示8(m以上的细胞为Dil-Ac-LDL 摄取阳性的内皮细胞；参见图2C，细胞混悬于Matrigel培养后24小时，可诱 导管腔样结构。
权利要求
1、一种成年大鼠心脏微血管内皮细胞体外分离、扩增的方法，其特征在于(1)利用心脏微血管内皮细胞的生物学特性，采用酶消化法分离富集成年大鼠心脏微血管内皮细胞，利用内皮细胞的自我更新和增殖特性进行扩增，从而获得大量心脏微血管内皮细胞；(2)分离出的细胞在体外进行分离纯化；(3)分离出的细胞在体外进行纯化扩增。
2、 根据权利要求l所述的成年大鼠心脏微血管内皮细胞体外分离、扩增的 方法，其特征在于在步骤(1)中，采用DMEM +20%新生牛血清作为基本培养 基。
3、 根据权利要求l所述的成年大鼠心脏微血管内皮细胞体外分离、扩增的 方法，其特征在于在步骤(1)中，通过0. 2%11型胶原酶震荡消化5min，加0. 1% 胰蛋白酶继续消化5min，用含20%新生牛血清DMEM培养液终止消化，从而获得 高纯度大量心脏微血管内皮细胞。
4、 根据权利要求l所述的成年大鼠心脏微血管内皮细胞体外分离、扩增的 方法，其特征在于在步骤(2)中，将得到的细胞接种于铺有鼠尾胶的培养皿 中，置于37。C恒温的59&C02培养箱中孵育，从而获得高纯度大量心脏微血管内 皮细胞。
5、根据权利要求1所述的成年大鼠心脏微血管内皮细胞体外分离、扩增 的方法，其特征在于在步骤(3)中，在传代培养中采用胰蛋白酶降低非CMECs 的贴壁能力，根据不同的贴壁时间达到纯化的目的。
6、根据权利要求l所述的成年大鼠心脏微血管内皮细胞体外分离、扩增的方法，其特征在于在步骤(3)中，通过及时、反复传代对成年大鼠心脏微血 管内皮细胞进行纯化和扩增培养，从而达到扩增的目的。
7、根据权利要求l、 2、 3、 4、 5或6所述的成年大鼠心脏微血管内皮细胞 体外分离、扩增的方法，其特征在于取2只SD大鼠，3%戊巴比妥钠30mg/Kg腹腔麻醉后打开胸腔，摘取心脏， 用PBS缓冲液冲洗心腔直至冲出液清亮为止；去除心房及右心室后，沿前壁切开 左心室，75%酒精灭活30 s后迅速取出，置于PBS缓冲液中去除残余的酒精。剪 去内、外膜，剪碎心肌组织，0.2%11型胶原酶震荡消化5min，加0. 1%胰蛋白酶 继续消化5min，用含2(m新生牛血清DMEM培养液终止消化；收集消化液，1000 r /min离心10 min。弃上清，用含20%新生牛血清，青霉素100 IU /ml，链霉素100 ug/ml的DMEM培养液悬浮细胞，接种于铺有鼠尾胶的培养皿中，置于37X:恒 温的5% C02培养箱中孵育6 h换液，以后每三天换培养液一次至细胞长成融合 单层；0. 25%胰蛋白酶消化传代至盖玻片上，待长满后用PBS洗三遍，置冰丙酮 中固定20min备用。
全文摘要
本发明涉及一种成年大鼠心脏微血管内皮细胞体外分离、扩增的方法，其提供了心脏内皮功能相关研究的理想细胞模型以及心肌梗死后血管新生治疗以及组织工程细胞的补充来源，为深入研究临床治疗心肌梗死、心血管内皮功能障碍等奠定了基础。本发明采用的技术方案为(1)利用心脏微血管内皮细胞的生物学特性，采用酶消化法分离富集成年大鼠心脏微血管内皮细胞，利用内皮细胞的自我更新和增殖特性进行扩增，从而获得大量心脏微血管内皮细胞；(2)分离出的细胞在体外进行分离纯化；(3)分离出的细胞在体外进行纯化扩增。
文档编号C12N5/06GK101463341SQ20081001746
公开日2009年6月24日 申请日期2008年1月31日 优先权日2008年1月31日 公开号200810017465.发明者张荣庆, 丰 曹, 王海昌, 魏丽萍 申请人:中国人民解放军第四军医大学