专利名称：：一种新的11个x染色体str基因位点及其分型方法
技术领域：
：本发明涉及一种核酸检测方法，特别涉及11个新的X染色体STR基因位点及其分型方法。
背景技术：
：短串联重复序列(shorttandemr印eats，简称STR)是由2-7个碱基对作为核心单位，串联重复形成的一类微卫星DNA序列，其片段可采用PCR技术扩增。STR主要由于核心重复单位数目的变化形成了STR基因位点的遗传多态性，其等位基因可用银染、荧光标记和放射自显影等技术分型。人类基因组中，平均每6-10kb就存在有一个STR基因位点，为法医个人识别和亲子鉴定提供了高信息基因位点的丰富来源。STR在研究与应用中具有以下显著的优点良好的重复性，分型结果稳定可靠，操作简单快速；片段长度一般在100400bp，容易通过PCR扩增、电泳分型，适用于各种检材及高度降解检材的检测；三核苷酸、四核苷酸重复的STR位点PCR扩增结果稳定，产生的附加带、影子带少，容易分型；是绘制人类遗传图、疾病基因连锁分析、遗传病诊断、个体识别等分析工作的重要工具。STR的分型，目前最常用的是应用PCR扩增STR，将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据片段的大小决定基因型并计算等位基因频率及遗传距离并构建系统发育树。对于PCR产物的检测可用自显影技术，PAGE结合银染，以及荧光标记序列仪自动分析系统。X染色体STR位点广泛存在真核细胞基因组中，高度稳定且具有较高的遗传多态性，但与常染色体和Y染色体STR相比，迄今发现和应用的X—STR位点数量非常少，群体分布、突变率、连锁平衡、基因结构等方面的信息尚不够丰富，在法医学、医学等领域的应用受限，远不及其他DNA遗传标记广泛。但X染色体STR对于亲子鉴定、个体识别、性别鉴定、X连锁遗传致病基因定位、易感基因的检出，多基因遗传病致病基因的定位、发病的分子遗传机理研究、药物的设计及使用等方面有独特的优势。故X染色体的有关研究有重要的意义。X染色体遗传标记的研究在国内还处于初期，目前国际上商品化检测试剂盒仅有德国BiotypeArgusX-8，该类试剂盒在法医学应用实践中存在以下问题1)采用这类试剂盒需要增加遗传标记时遇到困难；2)这些X-STR基因位点都是基于中国群体以外的群体(主要是白人群体)资料而开发的，其中有些基因位点，在中国群体的基因频率分布较差，个人识别能力较低。3)国外商品化试剂盒价格昂贵。这些缺点限制了X染色体遗传标记在国内的应用，不利于进一步在基层推广。
发明内容本发明所要解决的技术问题就是寻找更多的能应用于法医学等领域的X染色体STR位点并进行群体遗传学研究。本发明提供了一种新的11个X染色体STR基因位点及其分型方法，其特征在于，选用的11个X-STR位点覆盖了X染色体全长，在短臂的位点有DXS7130(4.15Mb)，DXS8378(8.78Mb);其余都位于长臂上DXS7132(60.8Mb)、DXS7424(99.39Mb)、DXS6789(91.95Mb)、DXS6799(92.95Mb)、DXS7133(107.8Mb)、DXS101(100.08Mb)、DXS6804(110.8Mb)、HPRTB(123.8Mb)、DXS7423(148.35Mb)。(表l)本发明所选的11个X-STR位点，扩增片段最小的是DXS7133位点，102-126bp;扩增片段最大的位点是DXS6799和HPRTB，271-299bp。所有位点片段大小适中，均适宜PCR扩增。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>ll个X染色体STR等位基因分型方法，其特征在于，包括下列步骤:1.采用PCR分别扩增11个X染色体STR基因位点的DNA，并设计位点的上下游引物序列，将上下游引物稀释成100uM0L/L，作为母液，取出10lii稀释到5uM0L/L，作为工作液；PCR扩增体系的体积为20uL，含IX反应缓冲液，1.5mM0L/LMgc:U，0.5UTaq酶，0.25PMOL/L引物，200uM0L/LdNTP，DNA20200ng。2.PCR扩增基础参数为94。C预变性3min，94"C变性lmin，根据位点的不同复性温度进行30秒、72t:延伸lmin，共计28-32个循环，最后72°C延伸15min;(具体参数见表3)3.扩增产物使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，采用银染显色方法，结合等位基因分型标准物进行标准化分型。上述等位基因分型标准物的制备包括下列步骤-1)将具有不同基因型的纯合子PCR产物分别与载体pGEM—T进行连接反应。2)连接反应产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a;3)涂布在氨苄青霉素琼脂平板上，过夜培养；4)挑菌，大摇，提取质粒DNA，备用；5)以质粒DNA为模板，作PCR扩增，对各等位基因分型标准物进行鉴定；注意同时用25bpDNA标准参照物、测序样本及标准细胞株GM9947A作对照，以确定标准片段大小；6)确定片段大小后大量扩增，将不同大小片段的等位基因混合即成等位基因分型标准物。本发明的ll个X染色体STR基因位点已在申请人的实验室应用于中华民族群体遗传资料调查，并获得了多个民族群体的分型结果，经统计学处理证明，该11个X-STR位点完全可以应用在法医学、人类学、遗传学和疾病等领域的个体识别、亲子鉴定以及基因诊断等方面，结果显示我国人群与国外人群X-STR遗传学特点有显著性差异，具有中国特色。本发明的ll个X染色体STR位点用聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色方法筛选出，可应用于法医学等领域，并制备了各位点等位基因分型标准参照物(Ladder),对X染色体STR位点的PCR引物和扩增条件进行了优化，其中PCR引物和扩增条件的优化和分型标准参照物的制作使本发明可以做到标准化和简单化并适合基层单位普及。本发明带来的技术优点是，扩增产物使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用银染检测分型，所需仪器和设备简单，操作方便，适合在基层单位普及，对于中国目前的情况可以得到良好的效果。本发明可以填补国内没有实用化的X-STR检测技术和方案的空白，并在中国多个民族中获得满意的结果，利用这种技术制备的X染色体段串联重复序列分型试剂盒，可进行商业化生产并推广为国内各个实验室使用该技术克服了使用国外试剂盒无法反映中国多民族遗传特点的缺陷，可以应用于亲子鉴定、个体识别、性别鉴定、X连锁遗传致病基因定位、易感基因的检出，多基因遗传病致病基因的定位、发病的分子遗传机理研究、药物的设计及使用等方面，具有广泛的应用前景。一种复合化合物的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种复合化合物的制备方法，具体来说是一种可用作发光材料前驱物用途的具有特定比表面积和分散指数的复合化合物的制备方法。
背景技术：
：Eu、Tb、Dy、Gd、Ce、Mn元素所具有的特定电子结构使得通过调整基质材料和合成条件，可以得到多种功能材料。尤其是作为发光材料激活剂离子时，发射光谱可覆盖从紫外到近红外的广阔范围，同时由于相应的发光材料具有高的发光强度、高的显色性等优点，目前己经在照明和显示等领域得到广泛的应用,，与之相应的电视、节能灯成为人们日常生活中不可或缺的组成部分。随着科学技术的不断发展，人们对电视、节能灯等器件的要求不断提高，尤其在电视方面，大屏幕、高分辨率、长寿命、高亮度电视已经逐渐成为市场需求的主流。为了适应显示及照明领域的迅速发展，技术方面对发光材料的要求也不断提高，高亮度、高稳定性、粒度分布集中、形貌规则的新型发光材料已经成为市场所趋。为了制备高性能的新型发光材料，科学家们从制备方法、制备原料等方面进行着不懈的努力，尤其近十年内，包括共沉淀法、溶胶凝胶法、燃烧法、喷雾热解法等新型的软化学制备方法层出不穷，逐步在为取代传统的高温固相法奠定了一定的基础，通过前驱物的高温处理来制备发光材料正在成为一个业界共知的趋势。在制备发光材料前驱物的软化学方法中，目前最为常用的是共沉淀法。该过程主要是通过在溶液体系中加入一定量的沉淀剂来生成沉淀，然后过滤、烘干沉淀物，在高温条件下焙烧沉淀物即可得到前驱物。这种方法的优点在于容易大规模生产，并且产物成份的均一性较好，目前在丫203:Eu荧光粉的制备中己经得到大规模的应用。但是，沉淀法的一些缺点却一定程度上限制了其大规模应用，尤其在稀土激活的发光材料方面应用并不广泛。具体如下1)中重稀土离子的沉淀过程容易出现胶状，条件难以控制。Eu、Tb、Dy、Y、Gd等中重稀土离子的氢氧化物、碳酸盐、磷酸盐、草酸盐的Ksp值都很小，调节pH值或者与相应的酸根反应容易生成沉淀，但是，除草酸盐外，中重稀土的大部分反应沉淀物呈胶状，只有精确控制其pH值、温度、浓度等综合条件才能够生成易于过滤的沉淀物。在实际的操作中，这些条件非常苛刻并且难以掌握，一旦任何一个条件发生<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物聚丙烯酰胺凝胶的制备(6%):1)用250ml的小烧杯称取42克超纯的尿素，依次加入54ml的1XTBE溶液、12ml40%丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺胶液(19:1)，放在磁力加热搅拌器上，7(TC左右加热搅拌促进尿素完全溶解。2)尿素完全溶解后，冷却至室温，加350ul的10XAPS和35tU的TEMED摇匀后开始灌胶。3)将胶液快速倒在方平的长玻璃板上，短玻璃板置长玻璃板上水平推动，灌好胶后，将鲨鱼齿梳反向插入胶板之间封口，注意封胶梳插入的深度。用八个燕尾夹将两块玻璃板一起固定住。灌好的胶室温聚合约2小时待用。预电泳、上样和电泳:1)凝胶聚合后将梳子取出，用水冲洗胶板去除多余的凝胶碎片，用纯水将加样槽冲洗干净。将胶板固定到电泳槽上，短板向里，向下压紧海绵垫，将四个螺旋钮扭紧固定住胶板，关闭上槽电极液排放开关。在上槽倒入适量电极液(1XTBE)没过短板，在下电泳槽中倒入适量电极液，将梳子用纯水冲洗干净插入加样槽中(梳子尖插入凝胶约12mm)，关闭上下电泳槽盖，接通电流，预电泳约1小时，使凝胶温度达到3CTC以上。在预电泳前，可将电极缓冲液放在56'C摇床上预热，可以縮短预电泳时间。预电泳条件电压1000V左右，电流30-40rnA，功率约38W。2)将PCR管做好标记，每管加入3.On1的2X上样缓冲液(2Xloadingsolution),然后分别加入1.03.0ul扩增好的样品(包括待检样本和己知的GM9947样本)及等位基因标准品(Ladder),混匀后放入扩增仪中95'C变性310分钟，取出后立即放入冰浴中，准备上样。PCR产物上样量应注意调整。3)结束预电泳后，用吸管吹打加样槽，去除气泡。然后取3.0yl制备好的样品加到鲨鱼齿梳子中，加样过程应避免产生气泡并尽可能减少加样时间。注意加样次序及对照、AL位置。4)样品加完后，立即接通电流，40W恒功率进行电泳。电泳时间根据不同扩增产物大小而定，时间大约为2小时到4小时；4.凝胶的银染及显色1)电泳结束后，取出胶板，将梳子取出，用适当的工具将两玻璃板分开，将粘有胶的长板放入水平摇床上的染色盘中。2)向染色盘中加入1000ml固定液(10%乙酸)，没过凝胶，室温摇动20分钟。将固定液倒出并回收，然后加入纯水，没过凝胶，洗三次，每次25分钟。3)加入1000ml染色液，室温下避光摇动30分钟。将染色液倒出，加入纯水洗10秒钟后将胶板取出，用纯水冲洗胶板的背面，倒掉纯水，将胶板重新放入染色盘中。加入1000ml显色液(预冷至4'C1(TC)，用肉眼进行观察，直到电泳条带清晰后，倒去显色液，加入1000ml停显液(10%乙酸)，10分钟后取出胶板，用蒸馏水冲洗一会儿，晾干，用扫描仪将结果保存到计算机中。5.等位基因分型标准物系统建立1)将具有不同基因型的纯合子PCR产物分别与载体pGEM—T进行连接反应。2)连接反应产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a;3)涂布在氨苄青霉素琼脂平板上，过夜培养；4)挑菌，大摇，提取质粒DNA，备用；5)以质粒DNA为模板，作PCR扩增，对各等位基因分型标准物进行鉴定；注意同时用25bpDNA标准参照物、测序样本及标准细胞株GM9947A作对照，以确定标准片段大小；6)确定片段大小后大量扩增，将不同大小片段的等位基因混合即成等位基因分型标准物。权利要求1.一种新的11个X染色体STR基因位点，其特征在于，该11个X染色体STR位点覆盖了X染色体全长，在短臂的位点有DXS7130，DXS8378；其余都位于长臂上，它们是DXS7132，DXS7424，DXS6789，DXS6799，DXS7133，DXS101，DXS6804，HPRTB，DXS7423；所有位点片段大小适中，均适宜PCR扩增。2.权利要求1所述的11个X染色体STR等位基因分型方法，其特征在于，包括下列步骤采用PCR分别扩增11个X染色体STR基因位点的DNA，并设计位点的上下游引物序列，将上下游引物稀释成100uMOL/L，作为母液，取出10"l稀释到5uMOL/L，作为工作液；PCR扩增体系的体积为20uL，含1X反应缓冲液，1.5mM0L/LMgcl"0.5UTaq酶，0.25PMOL/L引物，200uMOL/LdNTP，DNA20200ng。PCR扩增基础参数为94'C预变性3min,94'C变性lmin，根据位点的不同复性温度进行30秒、72'C延伸lmin，共计28-32个循环，最后72'C延伸15min;扩增产物使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，采用银染显色方法，结合等位基因分型标准物进行标准化分型。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的等位基因分型标准物的制备包括下列步骤1)将具有不同基因型的纯合子PCR产物分别与载体pGEM—T进行连接反应。2)连接反应产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a;3)涂布在氨苄青霉素琼脂平板上，过夜培养；4)挑菌，大摇，提取质粒DNA，备用；4.摩擦凸轮及其齿轮还是与各自的摆动件动配合，各自的摆动件的摆动轴与各自轴承座动配合，各自摆动件带有各自配重件，各自的摆动件摩擦轮的齿轮与对应半环摩擦凸轮的齿轮相互啮合。这样的共轴可以做为输入轴或其中一个齿轮可以同传动机构传动连接。摆动件优选曲轴。机架的驱动传动机构带动多组的摩擦轮共同输入转动，并通过各组啮合的齿轮同步传动，带动各组的摩擦轮和半环摩擦凸轮同步转动；半环摩擦凸轮凸起部分转到搗固锤杆側面时，各组摩擦轮和半环摩擦凸轮就夹持捣固锤杆提起；半环摩擦凸轮凸起部分转离捣固锤杆侧面时，各组摩擦轮和半环摩擦凸轮就不能夹持捣固锤杆，捣固锤在重力的作用下下落夯实煤饼。摆动件的配重体利用重力迫使摆动件带动半环摩擦凸轮趋向捣固锤杆，自动补偿因磨损造成的偏差。每组捣固锤只有一个半环摩擦凸轮，半环摩擦凸轮外缘周一部分为凸起的半圓环形，靠凸起部分转到与捣固锤杆相对的位置，与捣固锤杆接触，靠摩擦力提起捣固锤。半环摩擦凸轮对捣固锤杆的摩擦压力的保持，是靠配重件的重力通过摆动件(如半环摩擦凸轮的偏心轴套或半环摩擦凸轮动配合的曲轴)，使半环摩擦凸轮总是保持压力，并补偿磨损造成的误差。这样不但可以利用配重件使半环摩擦凸轮对捣固锤杆自动产生比较恒定的夹持压力及摩擦压力，特别是半环摩擦凸轮磨及捣固锤杆的摩擦板损后，配重件带动摆动件自动补偿，使半环摩擦凸轮压向捣固锤杆的压力几乎不变，而且结构大大简化，更便于各组捣固锤;^f擦轮、半环摩擦凸轮定位装配。可以单独顶起某组配重体，使相应半环摩擦凸轮偏离捣固锤杆，捣固锤不进行工作而单独进行修理更换。本发明的调心式夹板锤捣固机，夹锤可实现机械调整(工作过程中可随时调整)，安装过程可调整到理想工作点，生产一段时间后，还可以通过配重件进行偏心调整来弥补因摩擦产生的误差，工作过程的波动也可通过自动调心来完成。附图表示了本发明的一种调心式夹板捣固机结构示意图，其中图l调心式夹板捣固机单组机构部分的工作原理结构图，图2为调心式夹全文摘要本发明公开了一种新的11个X染色体STR基因位点及其分型方法，选用的11个X-STR位点覆盖了X染色体全长，在短臂的位点有DXS7130，DXS8378；其余都位于长臂上，它们是DXS7132、DXS7424、DXS6789、DXS6799、DXS7133、DXS101、DXS6804、HPRTB、DXS7423。所有位点片段大小适中，均适宜PCR扩增。本发明的11个X染色体STR基因位点已在申请人的实验室应用于中华民族群体遗传资料调查，并获得了多个民族群体的分型结果，经统计学处理证明，该11个X-STR位点完全可以应用在法医学、人类学、遗传学和疾病等领域的个体识别、亲子鉴定以及基因诊断等方面，结果显示我国人群与国外人群X-STR遗传学特点有显著性差异，具有中国特色。文档编号C12N15/12GK101225387SQ20081001740公开日2008年7月23日申请日期2008年1月25日优先权日2008年1月25日发明者兵余,刘清波,张洪波,李生斌申请人:西安交通大学