专利名称：具有改善鉴别能力的y染色体str基因座荧光标记复合扩增试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，一般地涉及在个体中检测短串联重复序列基因座(Short Tandem Repeat,简称STR)多态性所采用的扩增试剂盒。具体地,本发明涉及一种具有改善鉴别能力的Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增试剂盒。
背景技术：
人类基因组DNA中有3X109bp，其中10%是串联重复序列，称为卫星DNA。按重复单位的长短又可以分为大卫星、中卫星、小卫星和微卫星，其中重复单位仅由2-7个碱基对组成的叫微卫星，又称它为短串联重复序列基因座(Short Tandem Itepeat，简称STR)，这种串联重复形成的DNA序列可以产生数以亿计的基因型组合，而每一种组合在群体中出现的频率都非常低，也就是说，STR基因座具有极高的个体鉴定能力，所以常作为遗传标记而被用于DNA分析技术中法医个体识别、亲缘关系鉴定，同时也是DNA数据库建立的主流技术。同时，STR基因座的片段小、容易扩增，适宜于检验微量和降解检材，而且各基因座的扩增条件相似而能够复合扩增，因而具有灵敏、准确、快速、信息量大等优点。由于这些优点STR基因座的分型研究与筛选已在国内外人类学、医学遗传学和法医学及各相关领域中得到了广泛的应用。在实践中，DNA检验流程一般包含DNA提取、基因座扩增和电泳分析三大步骤，同时，在基因座扩增时，为观察扩增反应的情况，通常会对基因座所对应的引物进行荧光标记，这样就能实现实时跟踪，对在线反应过程进行监控，并在后续可结合相应的软件对产物进行分析。人类Y染色体是小的近端着丝粒染色体，它由长臂和微小的短臂两部分组成。Y染色体，除拟常染色体区外，在减数分裂中不发生交换重组，呈单倍型独立向下传递，表现出父系遗传特征，同时序列的变异完全由累积的突变所致，并非重组引起。由于Y染色体的这些特点，Y染色体STR基因座(简称Y-STR)遗传标记作为一种工具已经被广泛应用于法医鉴定、亲权鉴定、失踪人员鉴定、人类迁移进化研究、历史和家系进化研究等多个领域。已发现的Y-STR基因座已有400多个，常用来检测的Y-STR基因座有9个欧洲最小单倍型基因座，包括 DYS19、DYS385a/b、DYS389I/II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393 和 2 个美国 DNA 分析方法技术工作组(Scientific Working Group on DNA Analysis Methods,简称 SWGDAM)推荐的基因座，包括DYS438、DYS439。在法医鉴定与亲子鉴定领域，DNA分析主要依赖商业化的试剂盒进行。第一个Y-STR试剂盒是由ReliaGene Technologies在2001年研发的Y_PLEX 6，可复合扩增DYS19、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS393、DYS385a/b ；2002 年 ReliaGene Technologies又研发了可复合扩增 DYS389I、DYS389II、DYS439、DYS438、DYS392 的 Y_PLEX 5，到 2003 年9月ReliaGene Technologies推出了整合了 Y_PLEX 6和Y_PLEX 5所有基因座在内的Y-PLEXtmI2。同年10月，Promega公司推出了 PowerPlex Y试剂盒，可复合扩增12个基因座，其中包括 DYS19、DYS385a/b、DYS3891、DYS38911、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439。2004 年秋，Applied Biosystems 公司(简称 AB 公司)发布了包含 17 个Y-STR基因座的yfiler 试剂盒，其在PowerPlex Y的基础上增加了另外5个具有高度多态性的 Y-STR 基因座，即 DYS456、DYS458、DYS635、Y GATAH4、DYS448。Yfiler 试剂盒是目前可复合扩增Y-STR最多的商品化试剂盒。然而，长期的DNA检验试验表明，STR基因座的遗传多态性在种族间存在一定差异，各个基因座之间的差别也很大。即使是在美国FBI推荐的13个核心基因座中，也有部分基因座遗传多态性不高，或者在不同人群间的差异较大，由此给DNA检验技术的应用及其效率造成一定影响。甚而，应用于法医学实践的Y染色体遗传标记位于Y染色体的非重组区，整个非重组区相当于一个遗传标记，因此Y染色体遗传标记的个人识别能力和亲权鉴定能力不能像常染色体那样使用相乘原则。所以，为了达到足够的排除概率和个人识别概率，就必须不断的增加新的Y染色体遗传标记。所以，为了提高个人鉴别能力，Y-STR试剂盒就需在现有基础上增加多个具有高度遗传多态性的新的Y染色体遗传标记。
由此，为了进一步改善市售扩增试剂盒的灵敏性和效率，申请人对男性人群的Y-STR基因座的遗传多态性进行了深入的研究，并以此为依据开发了一种具有改善鉴别能力的Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增试剂盒，此种试剂盒目前未见报道与使用，且目前我国尚无Y-STR荧光标记检测试剂盒，因此是本领域术人员一直期望解决的问题。
发明内容
解决的技术问题本发明针对以上技术问题，对男性人群的Y-STR基因座的遗传多态性进行了深入的研究，并提供一种具有改善鉴别能力的Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增试剂盒，继而验证本发明所提供试剂盒在法医鉴定及亲子鉴定中的应用。技术方案(一 )具有改善鉴别能力的Y染色体STR基因座的确定为实现上述目的，本发明通过对DYS19、DYS381、DYS385a/b、DYS388、DYS3891/II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS425、DYS426、DYS437、DYS438、DYS439、DYS444、DYS447、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS450、DYS468、DYS522、DYS527a/b、DYS630、DYS635、DYS710和Y-GATA-H4等31个基因座在男性人群中的遗传多态性调查。最后确定DYS19、DYS385a/b、DYS388、DYS389I/II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS444、DYS447、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS522、DYS527a/b、DYS635 和 Y-GATA-H4等24个基因座。其中包括目前国内使用最多的AB公司出品的Yfiler试剂盒可扩增的17个基因座，如下DYS391、DYS389I/II、DYS439、DYS438、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、、Y-GATA-H4、DYS19、DYS392、DYS393、DYS390、DYS385a/b ;这其中已包括 9 个欧洲最小单倍型和2个SWGDAM推荐基因座。在此基础上，又增加了 7个具有高度多态性的Y-STR基因座，包括 DYS449、DYS527a/b、DYS522、DYS388、DYS447 和 DYS444。这些基因座既与现有试剂盒兼容，保证已有DNA数据的共享与交流，又能够提高DNA检验系统的累计个体识别能力和累积非父排除率，更加符合DNA检验的技术要求。( 二)具有改善鉴别能力的Y-STR荧光标记复合扩增试剂盒的确定
基于以上具有改善鉴别能力的Y-STR基因座的确定，本发明还提供一种具有改善鉴别能力的Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增试剂盒，包含下列17个Y染色体STR基因座的特异性寡核苷酸扩增弓I物对DYS391、DYS3891/II、DYS439、DYS438、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、、Y-GATA-H4、DYS19、DYS392、DYS393、DYS390、DYS385a/b ;同时还包含下列7个基因座的特异性寡核苷酸扩增引物对DYS449、DYS527a/b、DYS522、DYS388、DYS447和DYS444中的至少一个。进一步地，本发明所提供试剂盒同时包含下列24个Y染色体STR基因座的特异性寡核苷酸扩增引物对DYS391、DY S389I/II、DYS439、DYS438、DYS449、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、DYS527a/b、、Y-GATA-H4、DYS447、DYS19、DYS392、DYS522、DYS393、DYS388、DYS390、DYS385a/b、DYS444。参考24个STR基因座的等位基因范围和Genbank登记号见下表
等
权利要求
1.一种具有改善鉴别能力的Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增试剂盒，包含下列17个Y染色体STR基因座的特异性寡核苷酸扩增引物对DYS391、DYS389I/II、DYS439、DYS438、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、Y-GATA-H4、DYS19、DYS392、DYS393、DYS390、DYS385a/b，其特征在于还包含下列7个基因座的特异性寡核苷酸扩增引物对DYS449、DYS527a/b、DYS522、DYS388、DYS447 和 DYS444 中的至少一个。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其包含下列24种Y染色体STR基因座的特异性寡核苷酸扩增引物对DYS391、DYS389I/II、DYS439、DYS438、DYS449、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、DYS527a/b、Y-GATA-H4、DYS447、DYS19、DYS392、DYS522、DYS393、DYS388、DYS390、DYS385a/b、DYS444。
3.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其中每对所述引物具有一定的引物序列，其用于扩增相应STR基因座，对应关系为基因座引物序列(5’-3’) ~CATTCAATCATACACCCATAGATAGGTAGGCAGGCAGA DYS389T/TT CAGAAGAATGTCATAGATAGA ACCTACTTCTGTATCCAACC ATTT AAGTCTTT AATCT ATCTTG CATTTAAGTCTTTAATCTATCTTG TGATT ACC AAAATT AGTGGGGCCAGGGTCTGGAGTTCGA … CTC AAGCCTGTTCT ATGAADYS449CTGGGGCCGGATAATTGCT … ATGGTCTGTTGTGGGACC DYS456 AGAGGGACAGAACTAATGGA … AGACTGAGC AAC AGGAATGADYS458TTACAAGCATGAGCCACCTATGGGCGTGAGTGCAGAGGAAGACCCTGTCATTC T AGC AGC AAAATTC AC AG DYS635TCTCACTTCAAGCACCAA,,o AGAGGC AAGGATCC AA DYS448TTTCCTCATATTTCTGGCGTGGAAATTGTAGTGAGCa ATTCTAGGAAGATTAGCCYCATA H4 TCATCCATCTAATCTATCC' ' AATGTTATGCTGAGGAGA_
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述引物浓度为
5.根据权利要求1、2或4所述的试剂盒，其特征在于所述的各STR基因座采用位于该基因座核心重复区两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一条引物的5’端用荧光染料
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述荧光染料标记的方法为DYS391、DYS389I/II、DYS439、DYS438 和 DYS449，采用 FAM 标记；DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448 和 DYS527a/b，采用 HEX 标记；Y-GATA_H4、DYS447、DYS19、DYS392 和 DYS522，采用TAMRA 标记；DYS393、DYS388、DYS390、DYS385a/b 和 DYS444，采用 ROX 标记；内标选用橙色突光标记，突光标记物为SIZ。
7.根据权利要求1、2或4所述的试剂盒，其特征在于其中至少2个基因座的复合扩增采用聚合酶链式反应，其扩增产物的检测采用多道或单道毛细管测序基因分析仪来测定。
8.根据权利要求1、2或4所述的试剂盒，其特征为所述基因座采集自基因组DNA样品，包括人的血液、血痕、精液、唾液、体液、毛发、肌肉或组织器官。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征为所述基因组DNA样品的处理方法为Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法。
10.根据权利要求1、2、4或6所述的试剂盒在法医鉴定或亲子鉴定中的应用。
全文摘要
本发明提供一种具有改善鉴别能力的Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增试剂盒，用其进行DNA基因的检测不仅能扩增分析市售试剂盒能够分析的17种STR基因座DYS391、DYS389/、DYS439、DYS438、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、Y-GATA-H4、DYS19、DYS392、DYS393、DYS390、DYS385a/b，而且能同时扩增分析STR基因座DYS449、DYS527a/b、DYS522、DYS388、DYS447和DYS444中的至少一个，提高了系统的累计个体识别力和累积非父排除率，总体上提高个体的鉴别力。
文档编号C12Q1/68GK102703583SQ201210079459
公开日2012年10月3日 申请日期2012年3月23日 优先权日2012年3月23日
发明者葛斌文, 郑卫国 申请人:无锡中德美联生物技术有限公司