专利名称：肽核酸原位荧光杂交技术检测弧菌的方法及pna探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及应用PNA-FISH法鉴定弧菌属的方法，尤其涉及用于鉴定重要致病性弧菌(Vibrio )的方法和PNA探针。
背景技术：
我国水产动物的病害种类达200余种，常年养殖病害发病率达50%以上，损失率 20%左右，估计每年因水产养殖病害问题而造成的直接经济损失就达百亿元之巨，并且还有上升的趋势。从近年来我国海水养殖病害监测报告来看，病害以生物源性疾病为主，其中又以弧菌(Vj·briο )疾病为重,霍乱弧菌(K cholerae )、副溶血弧菌(K parahaemolyticus )、 哈维氏弧菌(K harveyi )、创伤弧菌(K vulnificus )、溶藻弧菌(K alginolyticus )、鳗弧菌(K 梅氏弧菌(K等都是重要的细菌病原。因此,发展对弧菌病原菌的快速检测和鉴定技术对于食品安全、水产养殖等均具有十分重要的意义。肽核酸是1991年由丹麦科学家Nielsen等人设计的一种以中性酰胺键为骨架的全新的DNA模拟物，其骨架结构单元为(2-氨乙基)甘氨酸，碱基部分通过亚甲基羰基连接与主骨架的氨基N上，可以序列特异地与DNA、RNA结合。其骨架为电中性，与DNA-DNA或 RNA-DNA互补链相比，PNA-DNA和PNA-RNA互补不存在静电排斥作用，因此具有很高的DNA 或RNA亲和性，在无错配的情况下其结合具有高稳定性，且杂交速度快，具有良好的细胞穿透性，是核酸探针的良好选择。同时PNA探针结合原位荧光杂交技术(FISH)，与传统生化鉴定比较，PNA-FISH法可节约大量时间，若不计增菌时间，一般耗时不超过4个小时。与PCR 等方法比较，PNA-FISH法的结果判断基于荧光检测和形态检测两部分，较PCR法等假阳性较低，且PNA-FISH法可省去核酸提取的步骤。
发明内容
本发明的一个目的是设计了具弧菌特异性的PNA探针，本发明的另外一个目的是提供肽核酸原位荧光杂交技术检测弧菌的方法，实现对弧菌属的快速检测。为了实现上述第一个目的，本发明采用以下技术方案
肽核酸原位荧光杂交技术检测弧菌用PNA探针，PNA探针的序列为TAC CCC CCT CTA
CAG。为了验证探针的灵敏度和特异性，用BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/)和 ProbeCheck (http://www. microbial-ecology. net/probecheck)对探针进行了 验证。BLAST搜索发现，所设计的探针具有较高的特异性。但也有一些的非目标细菌与探针 Vib_16S_l 有重合区域，如wodanis, Pantoea agglomerans, Listonella pelagia，Allomonas enterica，Listonella angui11 arum, Exiguobacteri um aurantiacum, Thorsellia anophelis，Antarctic bacterium，Rhodobacter■，但以上非目标细菌与弧菌关系都较疏远，也并非常见食品中的致病菌，因此一般不会导致假阳性结果。ProbeCheck验证结果显示，探针Vib_16S_l能检测到ProbeCheck中小亚基(16S/18S)数据库中所有的2000株弧菌，但同时也能检测到635株非目标菌，其中包括 352个非培养细菌，对弧菌属的特异性为99. 86%，灵敏度为100%。又将PNA探针与大亚基 (23S/28S)数据库匹配检测，发现仅有一株i/i办 a与之匹配，也不会与我们的目标菌混淆。为了实现上述第二个目的，本发明采用以下技术方案
肽核酸原位荧光杂交技术检测弧菌的方法，该方法包括以下的步骤
1)离心收集对数生长期的细菌，用PBS洗涤一次，再用PBS调整菌液浓度至 0D600=0. 5-2. O,取10μ1菌液于98%酒精清洗过的玻片上涂匀，火焰固定，将玻片于80%的酒精中浸泡15分钟，风干；
2)25μ1含500pmole/mlPNA的杂交缓冲液滴加于玻片上，PNA探针的序列为TAC CCC CCT CTA CAG，55°C作用1_1. 5小时，杂交后玻片于55°C预热的洗涤缓冲液中洗涤2次，每次 10分钟，取2 5μ1菌液涂片，风干后显微镜观察其荧光亮度及细菌的形态。作为优选，上述的杂交缓冲液ρΗ7· 5，包括10% (w/v)硫酸葡聚糖，10 mM NaCl, 30% (v/v)甲酰胺,0.1% (w/v)焦磷酸钠,O. 2% (w/v)聚乙烯卩比咯烧酮,O. 2% (w/v)聚鹿糖, 5 mM Na2EDTA,O. 2% (v/v) TritonX-100,50 mM Tris/HCl。作为优选，上述的洗涤缓冲液pHIO，包括5 mM Tris, 15mM NaCl,O. 1% (v/v) TritonX-IOOo2.固相PNA荧光原位杂交
本发明由于采用上述的技术方案，PNA具有与DNA和RNA特异性结合的高稳定性、杂交快速性、及其良好的细胞穿透性，使本发明的检测方法具有快速，准确、灵敏的特性。同时结合原位荧光杂交技术使检测具有分子生物学和形态学的双重保证，更加提高了鉴定的准确率。
具体实施例方式实施例I PNA-FISH敏感度验证
肽核酸原位荧光杂交技术检测弧菌用PNA探针，PNA探针的序列为TAC CCC CCT CTA
CAG。经过BLAST和ProbeCheck验证，所设计的探针Vib_16S_l理论上具有很高的灵敏度和特异性。与阳性对照探针BacUin —起被用于后续检测。表I PNA探针序列
探针序列(5’ -3’ )荧光标记探针位置碱基序列；GenBank号BacllinaCTGCCTCCCGTAGGA-FAM—Vib-16S-ITACCCCCCTCTACAG106-120;HM590221.I
a BacUin 为阳性对照探针；引用自 Perry-0’Keefe, H. , Stender, H. , Broomer, A., Oliveira, Κ. , Coull, J. , Hyldig-Nielsen, J. J. , 2001. Filter-based PNA in situ hybridization for rapid detection, identification and enumeration of specific micro-organisms. J Appl Microbiol 90(2): 180-189.
探针合成和标记由韩国Panagene完成。 本发明选取了 7种弧菌共12株细菌进行了灵敏度验证试验方法如下所述离心(2000g，5min)收集对数生长期的细菌，用PBS洗涤一次，再用PBS调整菌液浓度至0D_=0. 5-2. O,取10μ1菌液于98%酒精清洗过的玻片上涂匀，火焰固定，将玻片于80% 的酒精中浸泡15分钟，风干；25μ1含500pmole/mlPNA的杂交缓冲液(pH7. 5，10% (w/v)硫酸葡聚糖，10 mM NaCl, 30% (v/v)甲酰胺，0.1% (w/v)焦磷酸钠，O. 2% (w/v)聚乙烯卩比咯烷酮，O. 2% (w/v)聚蔗糖，5 mM Na2EDTA, O. 2% (v/v) TritonX-100, 50 mM Tris/HCl)滴加于玻片上，55°C作用1_1.5小时，杂交后玻片于551预热的洗涤缓冲液(？!110，5 mM Tris, 15mM NaCl,O. 1% (v/v) TritonX-100)中洗涤2次，每次10分钟，取2 5μ1菌液涂片，风干后显微镜观察其荧光亮度及细菌的形态。每次试验(包括以下实例2和3)都同步进行阳性对照和阴性对照试验，阳性对照试验，用探针BacUin替代其他探针，而阴性对照试验中，用空白替代其他探针。结果显示，所有实验的弧菌菌株都与阳性对照探针BacUin和探针Vib-16S-l呈杂交阳性(见表2)。上述结果和预设结果一致，探针Vib-16S-l能检测到自己的目标菌株，有较高的敏感度。杂交条件被优化确立后，我们进一步研究了 Vib-16S_l探针的灵敏度和特异性。 我们选取了 7种弧菌共12株细菌进行了灵敏度验证。如表2所示，
表2 弧菌PNA探针灵敏度验证
权利要求
1.肽核酸原位荧光杂交技术检测弧菌用PNA探针，其特征在于PNA探针的序列为TAC CCC CCT CTA CAG。
2.肽核酸原位荧光杂交技术检测弧菌的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤1)离心收集对数生长期的细菌，用PBS洗涤一次，再用PBS调整菌液浓度至 OD600=O. 5-2. O,取10μ1菌液于98%酒精清洗过的玻片上涂匀，火焰固定，将玻片于80%的酒精中浸泡15分钟，风干；2)25μ1含500pmole/mlPNA的杂交缓冲液滴加于玻片上，PNA探针的序列为TAC CCC CCT CTA CAG，55°C作用1_1. 5小时，杂交后玻片于55°C预热的洗涤缓冲液中洗涤2次，每次 10分钟，取2 5μ1菌液涂片，风干后显微镜观察其荧光亮度及细菌的形态。
3.根据权利要求I所述的肽核酸原位荧光杂交技术检测弧菌的方法，其特征在于杂交缓冲液ρΗ7. 5,包括10% (w/v)硫酸葡聚糖，10 mM NaCl, 30% (v/v)甲酰胺，0.1% (w/ V)焦磷酸钠，O. 2% (w/v)聚乙烯卩比咯烧酮,O. 2% (w/v)聚鹿糖，5 mM Na2EDTA, O. 2% (v/v) TritonX-100,50 mM Tris/HCl。
4.根据权利要求I所述的肽核酸原位荧光杂交技术检测弧菌的方法，其特征在于洗涤缓冲液 pHIO，包括5 mM Tris，15mM NaCl,0. 1% (v/v) TritonX-IOO0
全文摘要
本发明涉及应用PNA-FISH法鉴定弧菌属的方法，尤其涉及用于鉴定重要致病性弧菌(Vibrio)的方法和PNA探针。肽核酸原位荧光杂交技术检测弧菌用PNA探针，PNA探针的序列为TACCCCCCTCTACAG。本发明的PNA具有与DNA和RNA特异性结合的高稳定性、杂交快速性、及其良好的细胞穿透性，使本发明的检测方法具有快速，准确、灵敏的特性。同时结合原位荧光杂交技术使检测具有分子生物学和形态学的双重保证，更加提高了鉴定的准确率。
文档编号C12N15/11GK102586465SQ20121007887
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月23日 优先权日2012年3月23日
发明者吴珊, 帅江冰, 张晓峰, 朱振江, 李可 申请人:浙江省检验检疫科学技术研究院