专利名称：皮下转移的脏器癌荧光原位移植模型建立的方法
技术领域：
本发明涉及一种内脏脏器(如结肠等脏器)癌变的研究方法，尤其是结肠癌变原 位移植模型建立的方法。
二背景技术：
中国专利CN200710019273.0是本申请发明的一种结直肠癌造口原位移植模型的 建立方法，包括以下步骤a)细胞株选择或进行细胞培养，采用结肠腺癌细胞株 细胞浓度制成(1±0.5) 乂106的细胞悬液；b)对动物活体结肠造口，步骤是，将其 盲肠提出腹壁，视实验动物不同长度为0.3-2cm并与周围皮肤固定、愈合；d)造口 处肿瘤原位移植，步骤是，取小鼠结肠腺癌细胞混悬液0.1-lml接种在造口黏膜下， 自然生长。但对动物活体结肠造口原位移植模型的建立在研究观察过程中仍有不足之 处。
结肠癌原位移植模型的建立对于结肠癌的治疗研究有重要的意义，但是由于结肠 癌位置较深，难以观察肿瘤的大小，更无法观察肿瘤转移和复发的情况，在研究中的 应用受到一定的限制。荧光蛋白在激发的情况下可以发生荧光，如果移植的肿瘤中携 带荧光，这样就可以直接观察到肿瘤的生长、转移的情况。但是如果肿瘤生长在腹腔 中，即使有荧光肿瘤观察也不十分容易。
三
发明内容
本发明目的是提出一种皮下转移的脏器癌荧光原位移植模型建立的方法，尤其 是结肠、胰腺等内脏脏器癌荧光原位移植模型建立的方法。
本发明的技术方案是将移植了肿瘤的盲肠转移至皮下，本发明方法使肿瘤生长实验条 件更接近于生长在脏器内，而且荧光观察更为容易，是脏器癌研究方法的重要改进。 本发明的技术方案是皮下转移的脏器癌荧光原位移植模型建立的方法，其特征 是选用人结肠腺癌细胞株或相应脏器的癌细胞株，绿色荧光蛋白(GFP)质粒通过 逆转录病毒pLPCX对脏器的癌细胞株进行转染使脏器的癌细胞株含有GFP的表达
质粒，选择表达GFP的包装细胞，然后细胞株中加入病毒并培养在含有800 ug/叩l of G418的选择液中。.GFP基因通过T4连接酶与pLPCX载体连接，GFP-pLPCX载体 被转染至PT67包装细胞，得到转染的癌细胞株.选用裸鼠并在其皮下接种Lcwo细胞 悬液注入皮下0.2mL/只，注射完毕后，对注射部位进行观察，约4周成瘤，肿瘤生长 至5mm，观察到绿色荧光后开始进行原位移植；结肠皮下转移的结肠癌荧光原位移 植模型建立裸鼠腹腔注射麻醉，左腹部碘酊消毒，将皮肤及腹膜剪一小口，将裸 鼠肓肠提出腹膜外约lcm，缝合盲肠与腹膜间隙，将盲肠转移至皮下；让切开盲肠浆 膜，缝线2块直径约为lmm的携带荧光的肿瘤移植在盲肠处，关闭皮肤。
同样，在胰腺癌模型胃癌建立时，寻找相应的脏器,将脏器的部分转移在皮下,缝合
3腹膜后,在转移在皮下的部分移植带荧光的组织块，缝合腹部.
四
图l:将肿瘤移植在就盲肠处，然后将盲肠移植至皮下的裸鼠照片 图2:皮下肿瘤在荧光灯下显示绿色荧光，可观察肿瘤大小
五具体实施方式
材料与方法
1、试验动物BALB/C nu/nu裸鼠，SPF级，购自北京科丽华实验动物中心，体 重24 28g，分笼饲养于独立送风笼具，室温控制在24°C 25°C ，相对湿度50% 60%。
2、 细胞株及细胞培养选择相应肿瘤得细胞株,以RPMI-1640培养基，10%小 牛血清，在37。C， 5XC02培养，0.25。/。胰酶-EDTA消化，PBS洗2次，调整细胞浓 度制成1乂106的细胞悬液。
3、 绿色荧光蛋白(GFP) pLPCX逆转录病毒质粒的构建和肿瘤细胞的转染含 有GFP的表达质粒pEGFP-N3 (-)购自BD Biosciences Clontech (BD Biossciences, CA USA)，逆转录病毒pLPCX购自Clontech Laboratories, Inc. (Takara, J叩an).使用含有限 制性内切酶BglII和ClaI位点的引物扩增GFP片段，PCR产物在纯化后与pLPCX 逆转录病毒载体使用限制性内切酶Bgl II和Cla I消化，(Takara, Dalian, China).GFP 基因通过T4连接酶(Takara, Dalian, China).与pLPCX载体连接，GFP-pLPCX载体被 转染至PT67包装细胞(Takara， Japan),使用G418 (Gibico, USA)选择表达GFP的包装 细胞。肿瘤细胞在转染前24小时裂解，转染前细胞浓度为20-40%。包装细胞培养在 含有10X小牛血清的RPMI1640培养液中，当浓度达到70_80%时候，使用0.4544n 细胞筛进行过滤，然后向HT-29细胞中加入病毒并培养在含有800 ug/ml ofG418的选 择液中。.
4、裸鼠皮下接种模型的建立裸鼠颈部右侧皮肤消毒，用一次性lmL注射器 将肿瘤细胞悬液注入皮下0.2mL/只。注射完毕后，对注射部位进行观察，约4周成瘤， 肿瘤生长至5mm,可以观察到绿色荧光后开始进行原位移植。
5、结肠皮下转移的结肠癌荧光原位移植模型建立氯胺酮(0.17mg/)裸鼠腹腔 注射麻醉，左腹部碘酊消毒，将皮肤及腹膜剪一小口，将裸鼠需要建立模型的脏器 部分提出腹膜外约lcm，缝合脏器与腹膜间隙，将脏器转移至皮下；让切开浆膜，以 8 — 0缝线2块直径约为lmm的携带荧光的肿瘤移植在脏器处(这句能否再解释一下)， 关闭皮肤。
结论10只移植的结肠癌和5只胰腺癌的裸鼠均生存，肿瘤移植后3-5天即可看 到移植的肿瘤发出荧光，2周后肿瘤生长至5mm， 8周后肿瘤生长至20mm，处死动 物，发现有系膜淋巴结转移。当然，采用肝癌和胃癌的裸鼠也是比较适合的，采用本 发明的方法，能够有效的促进肿瘤生物科技的研究。
权利要求
1、皮下转移的脏器癌荧光原位移植模型建立的方法，其特征是选用人结肠腺癌细胞株或相应脏器的癌细胞株绿色荧光蛋白，绿色荧光蛋白GFP质粒通过逆转录病毒pLPCX对脏器的癌细胞株进行转染使脏器的癌细胞株含有GFP的表达质粒，.GFP基因通过T4连接酶与pLPCX载体连接，GFP-pLPCX载体被转染至PT67包装细胞，得到Lovo细胞；选用裸鼠并在其皮下接种Lovo细胞悬液注入皮下，注射完毕后，对注射部位进行观察，约4周成瘤，肿瘤生长至5mm，观察到绿色荧光后开始进行原位移植；裸鼠腹腔注射麻醉，左腹部碘酊消毒，将皮肽及腹膜剪一小口，将裸鼠肓肠提出腹膜外约1cm，缝合盲肠与腹膜间隙，将盲肠转移至皮下；让切开盲肠浆膜，缝线2块直径约为1mm的携带荧光的肿瘤移植在盲肠处，关闭皮肤。
2、 根据权利要求1所述的皮下转移的脏器癌荧光原位移植模型建立的方法，其 特征是肿瘤细胞以RPMI-1640培养基，10%小牛血清，在37。C， 5XC02培养，0.25% 胰酶-EDTA消化，PBS洗2次，调整细胞浓度制成1 X 106的细胞悬液。
3、 、根据权利要求1所述的皮下转移的脏器癌荧光原位移植模型建立的方法，其 特征是逆转录病毒pLPCX.使用含有限制性内切酶Bgl II和Cla I位点的引物扩增 GFP片段，PCR产物在纯化后与pLPCX逆转录病毒载体使用限制性内切酶BglII和 Clal消化，GFP基因通过T4连接酶与pLPCX载体连接，GFP-pLPCX载体被转染 至PT67包装细胞，使用G418选择表达GFP的包装细胞；HT_29细胞在转染前24 小时裂解，转染前细胞浓度为20-40%。包装细胞培养在含有10%小牛血清的 RPMI1640培养液中，当浓度达到70 — 80%时候，使用0.45+m细胞筛进行过滤，然 后向HT-29细胞中加入病毒并培养在含有800ug/mlofG418的选择液中。.
4.根据权利要求1所述的皮下转移的脏器癌荧光原位移植模型建立的方法， 其特征是裸鼠皮下接种模型的建立时，对裸鼠颈部右侧皮肤消毒，用一次性lmL注 射器将Lovo细胞悬液注入皮下0.2mL/只。
全文摘要
皮下转移的脏器癌荧光原位移植模型建立的方法，选用人结肠腺癌细胞株或相应脏器的癌细胞株绿色荧光蛋白，绿色荧光蛋白GFP质粒通过逆转录病毒pLPCX对脏器的癌细胞株进行转染使脏器的癌细胞株含有GFP的表达质粒，.GFP基因通过T4连接酶与pLPCX载体连接，GFP-pLPCX载体被转染至PT67包装细胞，得到Lovo细胞；选用裸鼠并在其皮下接种Lovo细胞悬液，约4周成瘤，观察到绿色荧光后开始进行原位移植；将皮肤及腹膜剪一小口，将裸鼠肓肠提出腹膜外约1cm，缝合盲肠与腹膜间隙，将盲肠转移至皮下；让切开盲肠浆膜，缝线2块直径约为1mm的携带荧光的肿瘤移植在盲肠处，关闭皮肤。
文档编号G01N21/64GK101502444SQ20081024261
公开日2009年8月12日 申请日期2008年12月29日 优先权日2008年12月29日
发明者杨志坚, 金黑鹰 申请人:南京源端生物科技有限公司