一种免疫荧光层析法检测核基质蛋白22用试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医疗用品技术领域，尤其涉及生物和医学检测用医疗用品技术领域， 具体涉及一种免疫荧光层析法检测核基质蛋白22用试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤。是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是 全身十大常见肿瘤之一，占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位，而在西方其发病率仅次 于前列腺癌，居第2位。2012年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病率为6.61/10万，列恶性肿瘤 发病率的第9位。膀胱癌可发生于任何年龄，甚至于儿童。其发病率随年龄增长而增加，高发 年龄50~70岁，男性膀胱癌发病率为女性的3~4倍。目前诊断膀胱癌主要是尿液脱落细胞 检测和内窥镜检查，但是尿液脱落细胞检查灵敏度太低，只有34%，而内窥镜检查是有创检 查不适合体检，只适合确诊。
[0003] 核基质蛋白22(NMP22)是核基质蛋白家族的一种，由2101个氨基酸组成，NMP22作 为膀胱癌的生物标志物是近几年发现的指标。以10U/毫升为诊断参考值的时候，NMP22诊断 膀胱癌的灵敏度达到82.76%，当以NMP22体检而阳性者用内窥镜确诊的情况下，对膀胱癌 诊断的灵敏度达到86%，特异度达到97%，所以NMP22作为诊断标志物具有非常的科学价值 和经济价值。
[0004] 因此，研究开发出一种简单、快速、准确测定出核基质蛋白22的浓度的方法，对于 膀胱癌的早期诊断和预防具有很大的临床价值和意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种免疫荧光法检测核基质蛋白22用试剂盒，该试剂盒能够 灵敏、快速、准确、特异的测定核基质蛋白22的浓度。
[0006] 同时，本发明的目的还在于提供一种免疫荧光法检测核基质蛋白22用试剂盒的制 备方法。
[0007] 为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] -种免疫荧光层析法检测核基质蛋白22用试剂盒，包括缓冲液和试剂卡；
[0009] 所述缓冲液为含有0.25~0.92ngAil荧光标记的兔抗人核基质蛋白22抗体的磷酸 盐缓冲液；
[0010]所述试剂卡包括试纸条，所述试纸条包括塑料垫板，塑料垫板上设置硝酸纤维素 膜，硝酸纤维素膜上左右间隔设置检测线和质控线，检测线左侧硝酸纤维素膜上设置玻璃 纤维素膜，质控线右侧硝酸纤维素膜上设置吸水纸，玻璃纤维素膜上设置滤血膜;所述检测 线上包被鼠抗人核基质蛋白22抗体;所述质控线上包被羊抗兔抗体。
[0011]所述试剂卡还包括外壳，所述外壳包括连接在一起的上盖和下盖，所述上盖上设 置有血样孔和检测窗;所述血样孔的位置对应滤血膜的位置;所述检测窗的位置对应检测 线和质控线的位置，使检测线和质控线处在检测窗中。
[0012]所述检测线上鼠抗人核基质蛋白22抗体的包被量为50~160ng/cm。
[0013]所述质控线上羊抗兔抗体的包被量为0.3~1 .Oyg/cm。
[0014] 所述磷酸缓冲液的pH=6.5~7.3，磷酸盐浓度为30~80mmol/L。
[0015] 所述检测线和质控线之间的间隔距离为5mm~10mm。
[0016] 所述试剂条的宽度为3mm~6mm。
[0017] 所述荧光标记的兔抗人核基质蛋白22抗体采用的荧光素的激发光波长为652nm， 发射光波长为668nm〇
[0018] 所述试剂盒的使用方法的操作步骤包括：
[0019] I:取不同浓度的核基质蛋白22标准品加入到缓冲液中，混合均匀后加入到试剂卡 的滤血膜上，室温水平放置10~15min后，将试剂卡插入荧光免疫读数仪，设定激发光波长 为652nm，发射光波长为668nm，读取不同浓度核基质蛋白22标准品的荧光值，并将荧光值与 核基质蛋白22标准品的浓度值进行线性分析，绘制荧光值和核基质蛋白22浓度值标准曲 线，得到荧光值和核基质蛋白22的浓度关系式；
[0020] Π :取待测样品加入到缓冲液中，混合均匀后加入到试剂卡的滤血膜上，室温水平 放置10~15min，将试剂卡插入荧光免疫读数仪，设定激发光波长为652nm，发射光波长为 668nm，读取待测样品的荧光值，将该荧光值带入步骤I得到的关系式中，计算得到待测样品 核基质蛋白22的浓度。
[0021] 所述试剂盒储存在4~8°C环境下，在使用时首先将缓冲液在室温下平衡15分钟后 再使用。
[0022] 上述免疫荧光层析法检测核基质蛋白22用试剂盒的制备方法，包括以下操作步 骤：
[0023] 1)制备缓冲液:取荧光标记的兔抗人核基质蛋白22抗体加入磷酸盐缓冲液中，混 合均匀，即得缓冲液；
[0024] 2)制备试剂卡:取硝酸纤维素膜，标记出检测线和质控线，然后在检测线上包被鼠 抗人核基质蛋白22抗体，在质控线上包被羊抗兔抗体，然后将硝酸纤维素膜、玻璃纤维素 膜、吸水纸、滤血膜依次搭接在塑料垫板上，并切割成所需宽度的试剂卡；
[0025] 3)将步骤1)制备的缓冲液、步骤2)制备的试剂卡，组装，即得所述的免疫荧光层析 法检测核基质蛋白22用试剂盒。
[0026] 上述步骤2)中采用喷点的方式在检测线上包被鼠抗人核基质蛋白22抗体，在质控 线上包被羊抗兔抗体。
[0027] 本发明免疫荧光层析法检测核基质蛋白22用试剂盒，包括缓冲液和层析试剂卡， 缓冲液中加入荧光标记的兔抗人核基质蛋白作为捕获抗体，试剂卡检测线上包被鼠抗人核 基质蛋白22抗体作为检测抗体，采用荧光免疫层析抗体夹心法的原理实现对尿液中核基质 蛋白22浓度的检测。该试剂盒检测核基质蛋白22线性范围好，线性范围为2.5~187U/ml，线 性相关系数R2 0.990,阳性预测值范围2 10U/ml;同时本发明试剂盒检测核基质蛋白22的 重复性好、准确度高，标准品重复测试所得结果的变异系数CV < 8%，相对标准偏差< 9%。
[0028] 本发明免疫荧光层析法检测核基质蛋白22用试剂盒的制备方法，操作简便，易于 控制，适于工业化推广应用。
【附图说明】
[0029] 图1为本发明实施例1提供的免疫荧光层析法检测核基质蛋白22用试剂盒中的试 剂卡结构示意图；
[0030] 图2为本发明实施例1提供的免疫荧光层析法检测核基质蛋白22用试剂盒外壳结 构示意图。
【具体实施方式】
[0031 ]下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0032]下述实施例和试验例中焚光标记的兔抗人核基质蛋白22抗体购自Abeam，商品号 为ab204018;鼠抗人核基质蛋白22抗体购自Abeam，商品号为ab5675;核基质蛋白22抗体标 准品购自Abeam。
[0033] 实施例1
[0034] 本实施免疫荧光层析法检测核基质蛋白22用试剂盒，包括缓冲液和试剂卡；
[0035] 其中缓冲液为含有0.5ngAU荧光标记的兔抗人核基质蛋白22抗体的pH = 7.0、磷 酸盐浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液;其中荧光标记采用的荧光素的激发光波长为652nm， 发射光波长为668nm;
[0036] 所述试剂卡包括试纸条，所述试剂条宽度为5mm，如图1所示，包括塑料垫板1，塑料 垫板上设置硝酸纤维素膜2,硝酸纤维素膜2上左右间隔7mm设置检测线3和质控线4,检测线 3左侧硝酸纤维素膜2上设置玻璃纤维素膜5，质控线4右侧硝酸纤维素膜2上设置吸水纸6， 玻璃纤维素膜5上设置滤血膜7;所述检测线上每厘米包被100ng鼠抗人核基质蛋白22抗体； 所述质控线上每厘米包被〇. 6yg羊抗兔抗体；
[0037] 所述试剂卡还包括外壳，所述试纸条放置于所述外壳内，如图2所示，所述外壳包 括连接在一起的上盖和下盖，所述上盖上设置有血样孔8和检测窗9;所述血样孔8的位置对 应滤血膜的位置;所述检测窗9的位置对应检测线和质控线的位置，使检测线和质控线处在 检测窗中；所述外壳上盖检测窗右侧空白处可作为用于记录数据的记录面10。
[0038] 本实施例免疫荧光层析法检测核基质蛋白22用试剂盒的制备方法，包括以下操作 步骤：
[0039] 1)制备缓冲液:取荧光标记的兔抗人核基质蛋白22抗体30ng，加入60μ1，ρΗ=7.0、 磷酸盐浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液中，混合均匀，即得缓冲液；
[0040] 2)制备试剂卡:取硝酸纤维素膜，标记出检测线和质控线，然后在检测线上喷点包 被鼠抗人核基质蛋白22抗体，在质控线上喷点包被羊抗兔抗体，然后将硝酸纤维素膜、玻璃 纤维素膜、吸水纸、滤血膜依次搭接在塑料垫板上，并切割成所需宽度，然后装入由上盖和 下盖连接在一起形成的外壳中，即得所述的试剂卡;其中外壳上盖上设置有血样孔和检测 窗，所述血样孔的位置对应滤血膜的位置，所述检测窗的位置对应检测线和质控线的位置， 使检测线和质控线处在检测窗中，所述外壳上盖检测窗右侧空白处可作为记录数据的记录 面；
[0041] 3)将步骤1)制备的缓冲液、步骤2)制备的试剂卡，组装，即得所述的免疫荧光层析 法检测核基质蛋白22用试剂盒。
[0042]本实施例试剂盒储存在4~8°C环境下。
[0043] 实施例2
[0044]本实施免疫荧光层析法检测核基质蛋白22用试剂盒，包括缓冲液和试剂卡；
[0045]其中缓冲液为含有0.25ngAU荧光标记的兔抗人核基质蛋白22抗体的pH=6.5、磷 酸盐浓度为80mm〇l/L的磷酸盐缓冲液;其中荧光标记采用的荧光素的激发光波长为652nm， 发射光波长为668nm;
[0046] 所述试剂卡包括试纸条，所述试纸条宽度为3mm，包括塑料垫板，塑料垫板上设置 硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上左右间隔5_设置检测线和质控线，检测线左侧硝酸纤维素 膜上设置玻璃纤维素膜，质控线右侧硝酸纤维素膜上设置吸水纸，玻璃纤维素膜上设置滤 血膜;所述检测线上每厘米包被50ng鼠抗人核基质蛋白22抗体;所述质控线上每厘米包被 〇.3yg羊抗兔抗体；
[0047] 所述试剂卡还包括外壳，所述试纸条放置于所述外壳内，所述外壳包括连接在一 起的上盖和下盖，所述上盖上设置有血样孔和检测窗；所述血样孔的位置对应滤血膜的位 置;所述检测窗的位置对应检测线和质控线的位置，使检测线和质控线