专利名称：乙型肝炎病毒基因分型和基因变异诊断芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学体外诊断技术，具体地讲是一种基因芯片。
目前在临床上已开展的实验室诊断方法主要有三大类，即组织培养法、免疫学方法(酶联免疫吸附ELISA和放射免疫法RIA)以及基因诊断技术(斑点杂交和聚合酶链反应PCR)。这些方法对病毒性肝炎的诊断起到了非常积极的作用，但也有不足之处(1)组织培养法对实验室条件要求高，一般医院难以开展，并且周期长，只能区分病毒的种。(2)ELISA和RIA检测往往只能间接推测病毒在体内的感染状况，不能直接判断是否存在以及病毒数量。(3)PCR和斑点杂交虽可直接检测病毒基因组本身，甚至可以用来分析基因型和变异株，但由于对仪器、试剂及场地等要求条件较高，以及方法学上尚有欠妥之处，难以满足临床的大量筛查。并且从目前已获得的结果看，各实验室之间利用基因诊断技术检测肝炎病毒的结果很难取得一致，也缺乏统一的标准。(4)上述方法共同的缺点是要检查多个肝炎病毒标志物时，只能一项项去做，耗时费力，并且抽取患者的血量也较大。上述不足提示我们，多种检测项目用一种仪器一次性检测，并实现程序化和自动化是诊断病毒性肝炎的研究方向之一。近年新兴的生物芯片技术对解决此问题给我们带来极大的希望。
我国是乙型肝炎的高发区，全国乙型肝炎病毒携带者至少有1.3亿以上，每年的发病率在6000万人次，乙肝病毒持续感染最终转化为慢性肝炎、肝硬化或肝癌；总数约占世界感染者的40％。因此，我国自“六五”以来，一直将研究和开发肝炎病毒的新诊断技术和诊断试剂作为医学攻关项目，并取得了一定的进展。但随着研究的深入，人们对肝炎病毒的认识也不断加深，乙肝病毒基因的变异、不同位点的突变可引起不同后果，如免疫逃避、疫苗逃避和抗病毒治疗逃避，在临床表现为漏诊、盲目用药和延误治疗，最终导致患者多花钱而使病情加重。最新研究结果表明，乙肝病毒的基因型与病情的轻重相关，抗病毒药物引起乙肝病毒特定位点的变异而耐药等。但是目前临床常规的检测方法越来越不适应临床诊治的需要，这就需要研究更新的、更能反映肝炎病毒实际状况的试剂或仪器、方法等，对肝炎病毒感染状况进行准确判断，并指导临床治疗方案的制定。
本发明的目的是提供一种乙型肝炎病毒基因分型和基因变异诊断芯片，该基因芯片具有诊断准确、特异性强、信息量高的特点，是目前乙肝病毒感染诊断最好的手段，给数千万乙肝患者带来福音。此芯片成功应用于临床，其潜在市场巨大，并能带来极大的经济效益和社会效益。
本发明是在基质尼龙膜上设置探针，探针在膜上的步阵，与核苷酸类似物等抗病毒药物的耐药相关探针.；与免疫逃亡，临床漏检有关的探针；与干扰素应答，免疫逃避，临床状况有关的探针；与病毒复制和原发性肝癌相关的缺失突变等特异性探针100-1000个左右，在特异探针末端加一段特异引物。
本发明实施的具体步骤是1.设计乙肝病毒特异性探针100-1003个。
乙肝病毒基因组大小为3.2kb，P区从2357核苷酸开始-1621个核苷酸位置终止，在这段基因组中设计探针117-381个，S区分为三段，S12848-3172，S23173-155，S156-833核苷酸，设计探针52-137个，C区分为前C区和C区，从1814-1901-2450个核苷酸，设计探针177-380个，X区1374-1818个核苷酸之间，设计探针37-115个。探针的大小8-25个碱基。
2.合成探针使用上海生物工程有限公司DNA合成仪合成。
3.探针处理由于设计的探针比较短，很难固化在膜上，因此我们在3’末端加了一个尾巴，使它能够固化在尼龙膜上。
4.基因芯片的制备使用罗氏公司生产的带有正点荷的尼龙膜，使用南开大学设计的NKG-Microarray III点样仪(如
图1所示)按预先设定好的顺序进行点样(见表2，表2是乙型肝炎病毒基因分型和基因变异诊断芯片合成的引物序列)。
图1是基因芯片微点阵操作平台示意图。
如图所示，1为点样臂，为有机玻璃制作，可以是一个以上；2为精密平移台，为一维精密操纵器；3为点样头架，有机玻璃制作，用于装载针架；4针架；5为精密电控平移台Z轴；6为精密电控平移台Y轴；7为精密电控平移台X轴；8为光学平台；9为电控箱；10为计算机；利用计算机控制软件通过电控箱操作机械手自动化点样。
尼龙膜大小1.0-2.5cm×5cm，点数，按照不同的要求从几十点到千点，依针管径粗细点的大小为100-1000微米，点间的距离为200-1500微米，每点上样量为0.05-0.1微升。
5.将点好的膜放在长波紫外灯下进行交联5-10分钟，使DNA牢固固定在膜上。
6.处理血清取20微升血清，加入Lysis Buffer20微升混匀，然后100℃煮沸10分钟，离心。
7.PCR扩增采用套式PCR使用引物见表3(表3套式PCR引物)。第一次PCR反应在PCR反应管中加入PCR mix、处理好的标本和引物1，按下列程序进行PCR扩增。
94℃ 1min，1个循环 第二次扩增在PCR反应管中加入PCR mix、处理好的标本和引物2，按下列程序进行扩增 8.探针的回收采用硅胶树脂的方法进行所需DNA片段的回收。
9.探针标记使用罗氏公司生产的地高辛标记试剂盒，方法参照试剂盒的说明。
10.杂交预杂交为0.5小时-1小时，杂交为3-12小时，在杂交箱中进行。
11.显色参照DAB检测方法试剂盒说明书进行。
12.检测将作好的芯片扫描进入计算机，然后用自设的计算机分析软件自动进行结果分析，将结果输出。
本发明经在天津市第三中心医院120例临床应用，实验证明NKG-450s乙肝病毒基因分型和基因变异诊断芯片具有诊断准确、特异性强、操作简单、信息量大等特点，临床实验深受大夫们的欢迎。
实例1
设计乙肝病毒特异性探针429个。P区117个，S区52个，C区177个，X区37个。探针的大小为18-24碱基。由上海生物工程有限公司使用DNA合成仪合成探针，末端转移酶催化下在3’末端加T尾巴15个以上。
基因芯片的制备使用罗氏公司尘产的带有正点荷的尼龙膜(20×30cm)，和南开大学设计的NKG-Microarray III点样仪按上述预先设定好的顺序进行点样。针管径粗为170微米，点间的距离为1400微米，每点上样量为0.1微升。将点好的膜放在长波紫外灯下进行交联5分钟，使DNA牢固固定在膜上。
芯片使用方法如下处理血清取20微升血清，加入Lysis Buffer20微升混匀，然后100℃煮沸10分钟，离心。
PCR扩增采用套式PCR方法。第一次PCR反应在PCR反应管中加入PCR mix、处理好的标本和引物1，按下列程序进行PCR扩增。
94℃1min，1个循环 第二次扩增在PCR反应管中加入PCR mix、处理好的标本和引物2，按下列程序进行扩增 用硅胶树脂过滤，进行所需DNA片段的回收。使用罗氏公司生产的地高辛标记试剂盒，方法参照试剂盒的说明。杂交预杂交为1小时，杂交为12小时，在杂交箱中进行。参照DAB检测方法试剂盒说明书进行显色，杂交信号呈棕黄色。
将作好的芯片扫描输入计算机，按照表1 NKG-450/s乙肝病毒基因诊断芯片布阵，将结果输出。
表1是NKG-450/s乙肝病毒基因诊断芯片布阵，该乙肝芯片型号为NKG-450/s，其中，1，2，14，15，16，17，29，30，218，219，233，234，421，422，436，437，434，435，449，450号为质控探针，3-36号为乙型肝炎基因分型探针、37-54号为血清分型探针，55-171号为核苷酸类似物等抗病毒药物的耐药相关探针；172-224号为免疫逃亡探针，225-404号为临床漏检；干扰素应答，免疫逃避，临床状况有关的探针；405-448号为病毒复制和原发性肝癌相关的缺失突变等特异性探针。
本发明临床应用实例按照表1所说的NKG-450/s乙肝病毒基因诊断芯片布阵进行检测病例1XXX，男，患乙肝多年，服用贺普丁一年，开始半年病情好转，HBV DNA含量下降，转氨酶也趋于正常；但随后没有彻底缓解开始反弹。2001年1月使用乙肝病毒基因诊断芯片检测后，发现该病人在P区552aa的甲硫氨酸(M)变异为缬氨酸(V)，因此对病人进行换药治疗三个月，经检查各项指标开始恢复正常。
病例2该发明用于血站献血员的检测，从血站所取自愿献血者血液20份，经该乙肝病毒基因芯片检测有2例乙肝病毒携带者。
病例3该患者患乙型肝炎多年，经治疗痊愈，后又去医院复诊，经乙肝病毒基因芯片检测，乙型肝炎复发。
乙型肝炎除做上述检测外，还可以进行药物筛选和药物治疗效果跟踪。
表1NKG-450/s乙肝病毒基因诊断芯片布阵
表2乙肝病毒基因检测芯片合成寡核苷酸引物序列
表3套式PCR引物序列
权利要求
1.一种乙型肝炎病毒基因分型和基因变异诊断芯片，其特征在于在基质尼龙膜上设置探针，探针在膜上的步阵，乙肝病毒特异性探针100-1003个，包括P区从2357核苷酸开始至1621个核苷酸位置终止，与核苷酸类似物和抗病毒药物的耐药相关探针117-381个；S变异区S12848-3172，S23173-155，S156-833个核苷酸，与免疫逃亡，临床漏检有关的探针52-137个；C变异区从1814-1901-2450个核苷酸，与干扰素应答，免疫逃避，临床状况有关的探针177-380个；X变异区1374-1818个核苷酸之间，与病毒复制和原发性肝癌相关的缺失突变探针37-115个；探针的大小8-25个碱基；探针的3’末端加尾巴10个以上。
2.按照权利要求1所说的乙型肝炎病毒基因分型和基因变异诊断芯片，其特征在于所说的探针在膜上的步阵1，2，14，15，16，17，29，30，218，219，233，234，421，422，436，437，434，435，449，450号为质控探针；3-36号为乙型肝炎基因分型探针；37-54号为血清分型探针；55-171号为核苷酸类似物和抗病毒药物的耐药相关探针；172-224号为免疫逃亡探针；225-404号为临床漏检，干扰素应答，免疫逃避，临床状况有关的探针；405-448号为病毒复制和原发性肝癌相关的缺失突变特异性探针。
3.权利要求1所说的乙型肝炎病毒基因分型和基因变异诊断芯片的制备方法，其特征在于它包括下述步骤(1)设计乙肝病毒特异性探针，包括P区、S区、C区、X区；(2)使用DNA合成仪合成探针；(3)在3’末端加尾巴进行探针处理，使它能够固化在尼龙膜上；(4)使用带有正点荷的尼龙膜，用芯片点样机上按预先设定好的顺序进行点样；(5)将点好的膜放在长波紫外灯(365nm)下进行交联5-10分钟，使DNA牢固固定在膜上。
4.权利要求1所说的乙型肝炎病毒基因分型和基因变异诊断芯片的使用方法，其特征在于它包括下述步骤(1)将待检血清加入Lysis Buffer处理血清，然后100℃煮沸10分钟，离心备用；(2)PCR扩增采用套式PCR方法，第一次PCR反应在PCR反应管中加入PCRmix、处理好的标本和引物1，按下列程序进行PCR扩增94℃ 1min，1个循环 第二次扩增在PCR反应管中加入PCR mix、处理好的标本和引物2，按下列程序进行扩增 (3)采用硅胶树脂的方法进行所需DNA片段的回收探针；(4)随机引物标记探针；(5)在杂交箱中进行杂交预杂交为0.5小时-1小时，杂交为3-12小时；(6)显色；(7)将作好的芯片扫描输入计算机检测，输出结果。
全文摘要
本发明涉及医学体外诊断技术,具体地讲是一种基因芯片。乙肝病毒基因分型和变异诊断芯片是100－1003个乙肝病毒特异性探针和20个质控探针构成的基因诊断体外检测芯片,该基因芯片具有诊断准确、特异性强、信息量高的特点,是目前乙肝病毒感染诊断最好的手段,对我国数千万乙肝患者带来福音。
文档编号C12Q1/68GK1339608SQ01116078
公开日2002年3月13日 申请日期2001年5月15日 优先权日2001年5月15日
发明者陈瑞阳, 高英堂, 陈力, 宋文芹 申请人:天津南开基因工程有限公司, 南开大学