专利名称：一种测定血管内皮细胞膜小凹微区域脂肪酸组成的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医学领域，涉及一种测定血管内皮细胞膜小凹微区域脂肪酸组成的方法，本发明还涉及该方法的应用。
背景技术：
细胞膜小凹微区域(Caveolae)是质膜上直径50～100nm的烧瓶状内陷微区，呈囊泡状结构(见图1)。研究发现这种结构广泛存在于各种类型的细胞中，在内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞中尤为丰富。Caveolae是一种特殊的细胞质膜结构，主要由脂类和蛋白质组成。脂类成分主要包括胆固醇、鞘糖脂(glycosphingolipids，GSLS)、鞘磷(sphingomyelin，SM)。
研究的早期，人们一直以为caveolae的功能主要是参与跨膜物质转运。近年来的研究发现，caveolae亦是细胞信号分子富集和信号转导的枢纽。其主要的结构蛋白-小窝蛋白(caveolin)对许多关键信号分子的活性状态起直接调控作用。实验结果表明，caveolae参与多种生物学过程不依赖包涵素的胞饮作用(potocytosis)、胞吞转运(transcytosis)、胆固醇转运、信号转导以及细菌、病毒的内化等。许多信号传导途径的重要分子存在于细胞膜小凹微区域中，包括G蛋白偶联受体(如缓激肽、内皮素、乙酰胆碱、β-肾上腺素能受体等)、G蛋白、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)等，参与细胞分化、增殖、肿瘤发生、炎症、疾病、衰老等多种病理、生理过程。但是对于Caveolae的脂肪酸组成的测定方法尚未有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种有效的测定血管内皮细胞质膜小凹微区域脂肪酸组成的方法。
本发明技术方案是根据细胞质膜小凹微区域不溶于非离子活性剂，利用化学特征可以进行细胞膜亚区域的分离，再采用气相色谱分析分离的细胞质膜小凹微区域的脂肪酸组成。
本发明是通过以下具体步骤完成的一种测定血管内皮细胞膜小凹微区域脂肪酸组成的方法，包含下列步骤
a.哺乳动物血管内皮细胞的培养；b.破裂细胞，得细胞裂解液；c.采用不连续蔗糖密度梯度超速离心法分离细胞膜小凹微区域；d.提取经分离的血管内皮细胞膜小凹微区域的脂肪酸，采用气相色谱测定分离的膜小凹微区域的脂肪酸组成。
所述的测定血管内皮细胞膜小凹微区域脂肪酸组成的方法，其中血管内皮细胞的培养方法为将哺乳动物脐静脉内皮细胞加入DMEM培养基，培养基中添加占培养基体积百分比10％的热灭活新生牛血清、青霉素100U/ml培养基、链霉素100U/ml培养基，置于二氧化碳培养箱中，在5％CO2于37℃条件下培养。
所述的测定血管内皮细胞膜小凹微区域脂肪酸组成的方法，其中破裂细胞的方法是将血管内皮细胞用PBS洗两次后，收集细胞，离心后沉淀重新悬浮在1ml含有1％(v/v)非离子活性剂Brij58的缓冲液1(500mMNa2CO3pH 11，25mM MES，150mMNaCl，和0.1％(v/v)蛋白酶抑制剂cocktail)中，超声破碎细胞，得细胞裂解液。超声波破碎细胞的方法是本领域普通技术人员公知的技术。
所述的测定血管内皮细胞膜小凹微区域脂肪酸组成的方法，其中采用不连续蔗糖密度梯度超速离心法分离细胞膜小凹微区域的方法是将细胞裂解液与等量的浓度为90％(w/v)的溶解在缓冲液2(25mMMES，pH 6.5，150mMNaCl，和0.1％(v/v)蛋白酶抑制剂cocktail)的蔗糖溶液混合，用5.5ml浓度为36％(w/v)溶解在缓冲液3(250mMNa2CO3，pH 11，25mM MES，150mM NaCl，0.1％(v/v)蛋白酶抑制剂cocktail)中的蔗糖缓慢覆盖其上层，然后再用2.5ml浓度为5％(w/v)的溶解在缓冲液3的蔗糖溶液覆盖在顶层，250000g于4℃下超速离心18小时，从顶部每次取1mL，收集分离组分，-80℃保存。
所述的测定血管内皮细胞膜小凹微区域脂肪酸组成的方法，其中提取经分离的血管内皮细胞膜小凹微区域的脂肪酸是采用萃取法提取血管内皮细胞膜小凹微区域的脂肪酸总脂。
所述的测定血管内皮细胞膜小凹微区域脂肪酸组成的方法，其中采用气相色谱法测定分离的血管内皮细胞质膜小凹微区域的脂肪酸组成是在样品中加入正十七碳酸内标后用HP4890气相色谱仪测定。气相色谱法的操作步骤及条件为本领域普通技术人员公知的技术。
所述的测定血管内皮细胞膜小凹微区域脂肪酸组成的方法在血管内皮细胞小凹微区域相关疾病的防治研究，尤其是在动脉硬化和肿瘤抑制方面研究中的应用。
本发明的有益效果本发明采用的方法可以简单准确地测定血管内皮细胞膜小凹微区域的脂肪酸组成。小凹微区域的生理作用，尤其在调节动脉硬化分子机理、一氧化氮合酶(NOS)功能、细胞增殖、细胞迁移和信号传导方面的作用日益受到人们的重视。已证明小凹微区域在调节细胞运输、信号转导、胆固醇运输及细胞增殖、分化、迁移方面发挥着区室化调节功能。近年来的研究发现，小凹微区域的异常和许多疾病密切相关，如肿瘤、动脉硬化、肌营养不良及早老性痴呆、糖尿病等。因此，研究小凹微区域的脂肪酸组成，阐明小凹微区域的生物学特性有利于许多疾病的防治研究，尤其是对肿瘤、动脉硬化方面的研究将开辟一个新领域。
图1是细胞质膜小凹微区域(Caveolae)示意图。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明做进一步阐述，但不限制本发明。
实施例11.实验材料人类脐静脉血管内皮细胞HUEVC(American Type Culture Collection，Manassas，VA)，DMEM培养基、IMDM培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)来源于Invitrogen公司；牛血清白蛋白(组分V)和蛋白酶抑制剂cocktail购于Roche公司。
2.血管内皮细胞培养人类脐静脉内皮细胞加入DMEM培养基，培养基中添加占培养基体积百分比10％的热灭活新生牛血清(购于杭州四季青公司)、青霉素100U/ml培养基、链霉素100U/ml培养基，置于二氧化碳培养箱中，在5％CO2于37℃条件下培养。为调节细胞的脂肪，细胞在无血清含0.4％(w/v)牛血清白蛋白(组分V)IMDM培养基培养。
3.富含caveolae的血管内皮细胞膜小凹微区域的分离。
富含caveolae的血管内皮细胞膜小凹微区域的分离采用不连续蔗糖密度梯度超离心法。血管内皮细胞用冷的(4℃)PBS洗两次后，收集细胞离心后沉淀重新悬浮在1ml含有1％(v/v)非离子活性剂Brij58的缓冲液1(500mMNa2CO3pH 11，25mM MES，150mM NaCl)，并加入占缓冲液1体积0.1％(v/v)的蛋白酶抑制剂cocktail(每ml含0.12mgantipain-HCl，20μg bestatin，40μg chymostatin，0.12mg E-64，20μg leupeptin，20μgpepstatin，0.12mg phosphoramidon，0.8mg pefabloc，40μg aprotinin)，超声破碎细胞。细胞裂解液与等量的浓度为90％(w/v)的溶解在缓冲液2(25mM MES，pH 6.5，150mMNaCl，和占缓冲液2体积0.1％(v/v)蛋白酶抑制剂cocktail)的蔗糖溶液混合，用5.5ml浓度为36％(w/v)的溶解在缓冲液3(250mM Na2CO3，pH 11，25mM MES，150mM NaCl，和占缓冲液3体积0.1％(v/v)蛋白酶抑制剂cocktail)的蔗糖溶液缓慢覆盖其上层，然后再用2.5ml浓度为5％(w/v)的溶解在缓冲液3的蔗糖溶液覆盖在顶层，250000g于4℃下超速离心18小时，从顶部每次取1mL，收集不同的分离组分，-80℃保存。
4.气相色谱分析细胞膜小凹微区域脂肪酸组成取分离的细胞膜小凹微区域组分，冻干后加入1mL甲醇(含0.9％苯骈三氮唑抗氧剂)混匀后，加入4mL氯仿，混匀，再加入1mL的甲醇使氯仿和甲醇的最终体积比为2∶1，混悬后，加入1mL 50mM KCl，混匀后2000g下离心15分钟。收集有机相，水相用1.5mL氯仿洗涤2次，转移有机相，合并3次的有机相，通过有机膜过滤(去除大于0.45μm的物质)，38℃旋转蒸干。
在样品中加入10μg正十七碳酸内标和1mL三氯化硼-乙醚∶甲醇溶液(1∶3，v/v)。置于75℃水浴30分钟，冷却，再加入0.5mL水和1.5mL正己烷，震荡混匀后，2000g离心15分钟。收集上清液，氮气吹干，溶解于25μl氯仿中，2μl进样。使用HP4890气相色谱仪(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)，该系统配备火焰离子化检测器(FID)，HP3398A色谱工作站和HP-FFAP石英毛细管色谱柱(30m长，内径0.32mm，涂层厚度为0.25μm)(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)。载气为高纯氮气，进样器温度是250℃，检测器温度为300℃，载气流速为10psi，程序升温起始温度110℃，以8℃/分升温至180℃，保持10分钟，再以6℃/分升温至230℃，保持8分钟后，10℃/分升温至250℃，保持3分钟。
常规比色法测定磷的含量(用于校正)。
测定结果见表1。
表1是人类脐静脉血管内皮细胞小凹微区域脂肪酸组成测定结果
(注表中脂肪酸表示方式a:b(n-c)中a代表碳原子数，b代表双键数，c代表双键位置)
权利要求
1.一种测定血管内皮细胞膜小凹微区域脂肪酸组成的方法，其特征在于包含下列步骤a.哺乳动物血管内皮细胞的培养；b.破裂细胞，得细胞裂解液；c.采用不连续蔗糖密度梯度超速离心法分离细胞膜小凹微区域；d.提取经分离的血管内皮细胞膜小凹微区域的脂肪酸，采用气相色谱测定分离的膜小凹微区域的脂肪酸组成。
2.根据权利要求1所述的测定血管内皮细胞膜小凹微区域脂肪酸组成的方法，其特征在于，其中血管内皮细胞的培养方法为将哺乳动物脐静脉内皮细胞加入DMEM培养基，培养基中添加占培养基体积百分比10％的热灭活新生牛血清、青霉素100U/ml培养基、链霉素100U/ml培养基，置于二氧化碳培养箱中，在5％CO2于37℃条件下培养。
3.根据权利要求1所述的测定血管内皮细胞膜小凹微区域脂肪酸组成的方法，其特征在于破裂细胞的方法是将血管内皮细胞用PBS洗两次后，收集细胞，离心后沉淀重新悬浮在1ml含有1％(v/v)非离子活性剂Brij58的缓冲液1(500mM Na2CO3pH 11，25mM MES，150mM NaCl，和0.1％(v/v)蛋白酶抑制剂cocktail)中，超声破碎细胞，得细胞裂解液。
4.根据权利要求1所述的测定血管内皮细胞膜小凹微区域脂肪酸组成的方法，其特征在于采用不连续蔗糖密度梯度超速离心法分离细胞膜小凹微区域的方法是将细胞裂解液与等量的浓度为90％(w/v)的溶解在缓冲液2(25mM MES，pH 6.5，150mM NaCl，和0.1％(v/v)蛋白酶抑制剂cocktail)的蔗糖溶液混合，用5.5ml浓度为36％(w/v)溶解在缓冲液3(250mM Na2CO3，pH 11，25mM MES，150mM NaCl，0.1％(v/v)蛋白酶抑制剂cocktail)中的蔗糖缓慢覆盖其上层，然后再用2.5ml浓度为5％(w/v)的溶解在缓冲液3的蔗糖溶液覆盖在顶层，250000g于4℃下超速离心18小时，从顶部每次取1mL，收集分离组分，-80℃保存。
5.根据权利要求1所述的测定血管内皮细胞膜小凹微区域脂肪酸组成的方法，其特征在于提取经分离的血管内皮细胞膜小凹微区域的脂肪酸是采用萃取法提取血管内皮细胞膜小凹微区域的脂肪酸总脂。
6.根据权利要求1所述的测定血管内皮细胞膜小凹微区域脂肪酸组成的方法，其特征在于采用气相色谱法测定分离的血管内皮细胞质膜小凹微区域的脂肪酸组成是在样品中加入正十七碳酸内标后用HP4890气相色谱仪测定。
7.权利要求1所述的测定血管内皮细胞膜小凹微区域脂肪酸组成的方法在血管内皮细胞小凹微区域相关疾病的防治研究，尤其是在动脉硬化和肿瘤抑制方面研究中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种测定血管内皮细胞膜小凹微区域脂肪酸组成的方法及其应用。该方法通过对血管内皮细胞进行培养，破裂细胞，采用不连续蔗糖密度梯度超速离心法分离血管内皮细胞膜小凹微区域，提取经分离的血管内皮细胞质膜小凹微区域的脂肪酸，采用气相色谱法测定脂肪酸组成。该方法能够简单、有效、准确地测定血管内皮细胞质膜小凹微区域的脂肪酸组成，可用于小凹微区域相关疾病的防治研究，尤其是在动脉和肿瘤抑制方面的研究。
文档编号G01N1/28GK1821776SQ20061000553
公开日2006年8月23日 申请日期2006年1月10日 优先权日2005年12月9日
发明者李秋荣, 谭力, 黎介寿 申请人:中国人民解放军南京军区南京总医院