一种大鼠血管内皮细胞体外培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药类技术领域，尤其涉及一种大鼠血管内皮细胞体外培养的方法。
【背景技术】
[0002]心血管疾病是对人类健康构成极大威胁的一类疾病。动脉粥样硬化病变的形成和血管损伤后的血管再生都涉及到血管内皮细胞的活化，血管内皮细胞是血管病理研宄的理想工具细胞，因此如何容易、稳定地获得纯化的血管内皮细胞一直是一个热门研宄方向。目前有大量的文献资料报道人脐静脉血管内皮细胞的培养方法及其广泛的运用于血管病理研宄，但由于人脐静脉血管内皮细胞来源于静脉而非动脉，所以限制了它的研宄价值；同期还有文献资料报道来源于鼠类、眼球和肺部的血管内皮细胞原代培养方法，但是大多数原代培养方法都要求特殊的仪器，例如磁珠、特异抗体、FACS select1n等。
[0003]长期以来，由于鼠胸主动脉管径细小，肋间动脉分支多，虽然有采用酶消化和内膜翻转等方法，但胸主动脉血管内皮细胞的原代分离培养仍存在细胞获得率和纯度较低等问题，使其应用受到限制。消化过程中还需要翻转血管，不仅增加污染的风险，亦直接影响内皮细胞的活力。内膜翻转法为近些年被更多采用的方法，可以获取较高纯度的血管内皮细胞原代分离培养方法，但该方法的关键点是需要将血管内膜翻出。翻出过程中难以避免细胞间的摩擦，增加了细胞损伤和污染的几率。160-220g大鼠主动脉管径仅约2mm，加之血管壁自身厚度，因此内膜翻转的操作成功率较低并且对取材血管亦未充分利用。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明旨在提出一种大鼠血管内皮细胞体外培养方法，以克服现有技术的缺点。
[0005]为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的:一种大鼠血管内皮细胞体外培养方法，包括如下步骤:
[0006](I)取大鼠主动脉，用无菌PBS液进行冲洗，然后将其沉浸在含肝素的DMEM/F12培养液中以备用；
[0007](2)利用无菌针线将主动脉内膜翻转出来，并在两端打结；
[0008](3)将翻转后的主动脉放在II型胶原酶中消化；
[0009](4)在37°C温箱中培育后，将被消化的主动脉放入无血清的DMEM/F12培养液，将主动脉两端结点剪去使其成为中空管状样，沿纵向剪开并将其分割成小块的主动脉薄片备用；
[0010](5)将主动脉薄片进行贴壁培养，所述主动脉薄片的主动脉内膜部分浸入含肝素和血清的DMEM/F12培养液，每隔48h更换一次培养液；
[0011](6)第3-5天，移除主动脉薄片，之后每天更换培养液，所述培养液与步骤(5)相同，第9天即可获得大量的血管内皮细胞，第14天后可用于细胞传代。
[0012]进一步，所述步骤(I)中的DMEM/F12培养液含1000U/ml肝素。
[0013]进一步，所述步骤(3)中胶原酶为II型胶原酶或I型胶原酶，所述胶原酶的浓度为 2g/Lo
[0014]优选的，所述步骤⑷中37 °C温箱中培育60分钟。
[0015]优选的，所述步骤(4)的主动脉可分割为4 一 5块主动脉薄片，所述主动脉薄片的大小为2cm*4cm，该大小得主动脉薄片非常适用于初级贴壁培养。
[0016]进一步，所述步骤(5)的DMEM/F12培养液中血清含量为20%、肝素含量为50ug/ml ο
[0017]优选的，所述步骤(2)中利用无菌针线将主动脉内膜翻转出来，并在两端打结的具体方法为:用一根无菌细针系上4-0尼龙线，将无菌针线穿过主动脉内腔，穿过后将无菌针剪下，利用尼龙线在主动脉一末端打结固定；利用眼科镊固定尼龙线未打结的一端，然后利用另一个眼科镊将分离的主动脉沿打结端翻转，轻轻的拉扯主动脉外膜直到整个主动脉是主动脉内膜朝外主动脉外膜朝内，将翻转后的主动脉未打结的一端打结。
[0018]优选的，所述步骤(5)中贴壁培养的方式为，将主动脉薄片平铺在六孔板上，六孔板中每孔加入800ul含肝素和血清的DMEM/F12培养液以便仅仅使主动脉内膜沉浸在培养液中，而不是包括主动脉外膜的整个主动脉沉浸其中。整个过程中，需保持主动脉薄片始终贴壁，更换培养液时也需要防止移动主动脉薄片。
[0019]优选的，所述步骤￠)中移除主动脉薄片后，每天更换培养液，加入量为3ml/孔。
[0020]相对于现有技术，本发明所述的大鼠血管内皮细胞体外培养方法具有以下优势:
1.操作简单快捷，可重复性高，实验所需时间短，大大减少污染和对内皮细胞活性的影响；
2.所需血管量少，充分利用了取材血管，每次分离培养取一只大鼠胸主动脉即可分割成4-5小块，一小块组织可以稳定容易的获得大量血管内皮细胞；3.利用血管内皮细胞最先长出的特点，适时弃去组织块，减少了成纤维细胞及平滑肌细胞的污染机会；4.加入定量的培养液，仅仅使内膜与培养液接触，避免外膜接触培养液，可减少外膜细胞等的污染机会；5.培养液中无须加入促生长因子类物质，使本方法更为经济实用；6.利用无菌针线将血管内膜翻转出来，可以最大程度的避免细胞间的摩擦和损伤，同时因为针线都是无菌的，所以细胞污染的几率非常低，而且此方法翻转操作的成功率接近100%。
【附图说明】
:
[0021]图1为原代内皮细胞培养第三天后，*100镜下照片
[0022]图2为原代内皮细胞培养第三天后*200镜下照片
[0023]图3为原代内皮细胞培养第三天后*400镜下照片
[0024]图4为原代内皮细胞培养第四天后*100镜下照片
[0025]图5为原代内皮细胞培养第四天后*200镜下照片
[0026]图6为原代内皮细胞培养第四天后*400镜下照片
[0027]图7为原代内皮细胞培养第五天后*100镜下照片
[0028]图8为原代内皮细胞培养第五天后*200镜下照片
[0029]图9为原代内皮细胞培养第五天后*400镜下照片
[0030]图10为原代内皮细胞培养第七天后*100镜下照片
[0031]图11为原代内皮细胞培养第七天后*200镜下照片
[0032]图12为原代内皮细胞培养第七天后*100镜下照片
[0033]图13为原代内皮细胞培养第九天后*100镜下照片
[0034]图14为原代内皮细胞培养第九天后*200镜下照片
[0035]图15为原代内皮细胞培养第九天后*400镜下照片
[0036]图16为原代内皮细胞培养第十四天后*100镜下照片
[0037]图17为⑶31抗体免疫细胞化学SABC显色照片
[0038]图18为⑶31抗体免疫细胞化学FITC荧光二抗分析照片
[0039]图19为从大鼠胸主动脉分离的原代内皮细胞及传代培养细胞，在Matrigel基质胶中培养2h后照片
[0040]图20为从大鼠胸主动脉分离的原代内皮细胞及传代培养细胞，在Matrigel基质胶中培养6h后照片
[0041]图21为实施效果例4中1-3代细胞的生长曲线，其中系列I为血管内皮细胞第一代；系列2为血管内皮细胞第二代；系列3为血管内皮细胞第三代
【具体实施方式】
[0042]实施例1
[0043]大鼠血管内皮细胞体外培养方法包括如下步骤:
[0044]1、取大鼠主动脉，用无菌PBS液冲洗分离的主动脉两次，然后将其沉浸在DMEM/F12含1000U/ml肝素培养液中以备用。
[0045]2、一根无菌细针系上4-0尼龙线备用，将无菌针线穿过主动脉内腔，穿过后将无菌针剪下，利用尼龙线在主动脉一末端打结固定。利用眼科镊固定尼龙线未打结的一端，然后利用另一个眼科镊将分离的主动脉沿打结端翻转，轻轻的拉扯主动脉外膜直到整个主动脉是主动脉内膜朝外主动脉外膜朝内，将翻转后的主动脉未打结的一端打结。
[0046]3、将打结翻转后的主动脉放在II型胶原酶中消化以便主动脉内膜完全的接触胶原酶，II