专利名称：一种培养血管内皮细胞的方法
技术领域：
本发明涉及组织工程学中获得种子细胞的方法。
背景技术：
血管疾病是临床常见的疾病之一。随着人口老龄化进程的加速，膳食习惯的改变，动脉粥样硬化的发病率进一步增高并威胁越来越多人的健康，有统计在60岁以上人群中，动脉粥样硬化的发病率将为80％，而由此引起的肢体动脉缺血性疾病的发病率亦高达7-20％；同时，糖尿病与肥胖病的发病率也在逐年增高，而与动脉缺血性疾病相关的高危因素居高不下。仅在美国，每年接受血管移植的患者就超过一百万之多，但长期以来，缺乏理想的血管移植物严重制约了上述疾病的治疗效果。
临床已经应用的血管移植材料有自体血管、异体血管、和人工高分子材料管道(如涤纶Dacron、膨化聚四氟乙烯ePTEF)，尽管能改善和延长患者的生命，但均未达到理想的程度。目前认为Dacron、ePTEF在临床大口径血管移植中效果可靠，有肯定的远期通畅率，但移植后失败率高。自体血管虽然有较好的远期通畅率，却存在来源不足的问题。随着近年来组织工程学的发展，构建组织工程人工血管日益受到重视。
组织工程化血管是由细胞材料复合物构建的血管替代品，在生物材料降解后所形成的血管由活细胞所构成，具有与正常生理性血管相似的特性，可以随机体的生长而生长。目前，组织工程化血管的构建主要是应用自体组织的同源细胞作为种子细胞来源，存在着来源有限、易老化、不能大规模扩增以及取材对机体造成创伤等问题，种子细胞来源困难已成为阻碍组织工程进一步发展的瓶颈问题。
因此，本领域迫切需要一种将胚胎干细胞(ES)培养为血管内皮细胞的方法，为组织工程化血管提供新的种子细胞；也迫切需要一种理想的血管移植物。
发明内容
本发明的目的是建立一种将hES培养成为血管内皮细胞的方法。
本发明的另一个目的是提供一种血管内皮细胞及其用途。
在本发明的第一方面，提供了一种血管内皮细胞的培养方法，包括步骤a.在基本上不含有动物血清和含维甲酸的培养液中，培养人胚胎干细胞，形成拟胚体；b.用含β1-转化生长因子的培养液将拟胚体培养成具有血管样结构的血管内皮细胞。
在另一优选例中，步骤a中所述培养基基本上不含动物血清是指哺乳动物血清的体积浓度为0-2％，较佳地0-1％，更佳地0-0.5％，最佳地0％。
在另一优选例中，步骤a中所用的维甲酸浓度为0.1-3×10-9mol/L。
在另一优选例中，步骤a和b中的培养是在37±2℃，和5±1％CO2条件下培养1-7天。
在另一优选例中，步骤b中所用的β1-转化生长因子浓度为1-5ng/ml。
在另一优选例中，在步骤a和b之间还包括步骤将拟胚体进行贴壁培养。
在本发明的第二方面，提供了一种用本发明上述方法制得的血管内皮细胞。
在本发明的第三方面，提供了用上述方法得到的血管内皮细胞的用途，它们用作构建组织工程化血管的种子细胞。
或者，所述的血管内皮细胞被用于制备血管移植物。本发明所述的移植物用于治疗血管性疾病。
在另一优选例中，步骤b中的培养条件为37±2℃，5±2％CO2，培养1-7天上述的培养方法中，步骤c中所用的β1-转化生长因子浓度为1-5ng/ml。
在另一优选例中，步骤c中先将拟胚体贴壁培养。
由此，本发明提供了一种将hES培养成为血管内皮细胞的方法，并且提供了一种血管移植物，并可将血管内皮细胞用于治疗血管性疾病。
图1显示了hES在胎鼠成纤维细胞(MEF)细胞的饲养层上的生长，放大60倍。
图2显示了所形成的拟胚体(EB，embryonic body)，左图为第2天放大100倍，右图为第5天放大100倍。
图3显示了EB周围的上皮样和圆形细胞，放大100倍。
图4显示了EB贴壁第3天，血管样结构的出现，放大100倍。
图5显示了EB贴壁第4、5天，血管样结构渐成交叉网状，a1、a2为第4天，b1、b2为第5天；a1、b1放大40倍、a2、b2放大100倍。
图6显示了管道由圆形细胞组成。
图7显示了内皮样细胞围成的管腔。
图8显示了内皮样细胞紧密连接。
图9显示了细胞间紧密连接。
图10显示了正常人毛细血管。
图11显示了抗vWF抗体免疫荧光呈阳性，放大100倍，a为vWF抗体免疫荧光阳性、b为阳性对照，c为阴性对照。
图12显示了抗Flk-1抗体免疫荧光呈阳性，放大100倍，a为Flk-1抗体免疫荧光阳性、b为阳性对照，c为阴性对照。
图13显示了抗CD31抗体免疫荧光呈阳性，放大100倍，a为CD31抗体免疫荧光阳性、b为阳性对照，c为阴性对照。
图14显示了Dil-Ac-LDL摄取实验阳性，放大100倍，右图为阴性对照。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，在基本上不含动物血清和含RA培养基中培养人胚胎干细胞，然后在含TGF-β1的培养液中培养，可形成具有血管样结构的血管内皮细胞。在本发明中，尽管基本上不含动物血清(如FBS)，然后通过低浓度RA和TGF-β1协同作用，足以诱导人ES细胞分化为具有血管样结构的血管内皮细胞。该方法为研究胚胎时期体内的血管发生及其机制建立了一个良好的模型，且为组织工程化血管提供新的种子细胞。
本发明所述的血管内皮细胞的培养方法包括步骤a.在基本上不含有动物血清和含维甲酸的培养液中，培养人胚胎干细胞，形成拟胚体；b.用含β1-转化生长因子的培养液将拟胚体培养成具有血管样结构的血管内皮细胞。
在本发明中，使用的培养基是基本上不含动物血清(如哺乳动物胎儿血清)的培养基。
当然，在培养hES的培养基中可以加入一些已知生长因子。此外，所述生长因子可来源于成纤维细胞饲养层。虽然所述生长因子较佳是成纤维细胞生长因子，但是它也可以是其它物质，如设计用来激活成纤维细胞生长因子受体的某些合成的小肽(如由重组DNA变体或突变体产生的肽)。
本发明可提供采用上述步骤a衍生获得的血管内皮细胞系。“衍生”在此使用其广义含义，覆盖了直接或间接衍生的细胞系。
本发明所述的hES的建立可采用本领域所知的方法制备或直接购买获得(例如购自ATCC等保藏中心)。
本发明中RA和TGF-β1可诱导人ES细胞分化为内皮细胞及血管样结构。TGF-β1为胚胎干细胞向内皮细胞定向诱导分化的有效刺激因子。本发明先由未分化的胚胎干细胞分化成为血管细胞(angioblast)，再形成内皮细胞，彼此组成管道状结构。在诱导环境持续存在的情况下。血管形成(vasculogenesis)和血管新生或芽殖(angiogenesis)先后或同时存在，这一现象与胚胎发育中血管形成过程相似。
本发明所述的培养血管内皮细胞的方法中，在培养EB时使用RA，所述的RA为低浓度，是0.1-3.0×10-9mol/L，优选0.5-1.5×10-9mol/L，更优选1.0×10-9mol/L。
转化生长因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)是由112个氨基酸组成的多肽为亚单位，并通过二硫键相连的双聚体分子。近年研究发现，有不少蛋白分子或基因的结构和功能与TGF密切相关，组成拥有20余个成员的TGF-β家族。TGF-β家族有很多同工异构体，其中以TGF-β1研究最多，属于具有多种生理功能的多肽生长因子，参与调节细胞的生长、分化和免疫反应。
本发明所述的培养方法中，优选使用TGF-β1，其浓度为1-5ng/ml，更优选3ng/ml。
本发明所述的EB培养的一个优选例是取生长良好的hES细胞，机械法分割成小块，接种到预先铺过1％琼脂的培养皿，培养液敲除(knock-out)DMEM，去除bFGF，加RA至终浓度为1×10-9mol/L，37℃、5％CO2培养3-5天，收集生长较好的EB，均等地移植到预先用0.1％明胶铺过的培养皿中，加含3ng/mlTGF-β1的无血清DMEM，每隔两天换液培养。
在本发明的另一个方面是用上述的培养方法所获得的血管内皮细胞，所述的血管内皮细胞可以作为组织工程化血管的种子细胞；可以制备血管移植物；也可用于治疗血管性疾病，治疗中可直接注入所述的血管内皮细胞，或含有上述血管内皮细胞的组合物。
所述的血管移植物包括(a)药学上可接受的生物可降解材料；和(b)用上述的培养方法所获得的血管内皮细胞。所述的药学上可接受的生物可降解材料包括(但并不限于)(i)可降解性合成高分子材料，例如聚α-羟基酸(如聚乳酸PLA、聚羟基乙酸PGA、聚羟基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；(ii)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐、藻酸钙凝胶等；各种脱细胞基质；(iii)可注射性材料，如Pluronic(一种市售的聚环氧乙丙烯商品)、藻酸钙凝胶等；(iv)上述材料的混合物或复合材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料，以及固体材料与可注射性材料的复合材料。
本发明所用术语von Willebrand因子(vWF)是存在于血浆中的大分子糖蛋白，在内皮细胞内质网中合成的vWF单体分子量为260KD，在高尔基复合体中加工后降解为230KD。由这些单体聚合形成多聚体主义到W-P小体储存，最后分泌到细胞外。它与凝血因子VIII结合后，以复合物的形式存在于循环血液中。vWF不仅是因子VIII的载体，而且在血小板黏附于内皮下组织的过程中也起重要的作用。vWF主要由内皮细胞合成，因此vWF被作为鉴定内皮细胞的特异性标记。
本发明所用术语CD31是一种相对分子质量为110kD的糖基化跨膜糖蛋白，出现在人类造血祖细胞和血管内皮细胞上，CD31内皮细胞抗原在毛细血管、小血管内皮细胞呈稳定强阳性，被认为是目前血管内皮细胞的最可靠标记。
本发明所用术语Flk-1是血管内皮生长因子(VEGF)的酪氨酸激酶受体，VEGF酪氨酸激酶受体分为两类，VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-1(Flk-1)，大多分布在内皮细胞的表面。VEGF与受体结合后，受体的酪氨酸激酶磷酸化，通过细胞浆内信号传导链，引起细胞核分裂，血管内皮细胞增殖、移行，血管新生。
Yamaguchi等用RT-PCR的方法筛选出在小鼠胚胎干细胞的受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTKs)，这些酶可能在小鼠早期发育中涉及到细胞系的方向和分化。Flk-1是flt相关的基因，用原位杂交发现在胚胎原条期(primitive streak stage)时Flk-1在近外侧中胚层表达，其组织将向心脏衍生；在头褶(head fold)期时，Flk-1表达明确定于原始心内膜以及内脏卵黄囊(visceral yolk sac)和尿囊(allantois)；然后是在胚胎和胚胎外的习惯内皮表达；在早期器官形成时期，flk-1在血管丰富的组织首先表达，如脑、肝脏、肺和胎盘(placente)。由于Flk-1在早期中胚层细胞表达，所以它是内皮前体细胞的标志。
本发明所用术语1’二(十八烷基)-3，3’，3’，3’-四甲基吲哚羰基花青高氯酸盐(1，1’-dioctadecyl-3，3，3’，3’-tetramethylindocarbocyanineperchlorate，DiI)是一种亲脂性碳花青染料，容易嵌进生物质膜内并在膜内做定向扩散运动从而标记整个细胞。荧光染料DiI标记的低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein，LDL)，即Dil-LDL被广泛应用于内皮细胞的鉴定。
本发明的主要优点在于
1.本发明提供用于hES的培养条件，其中，所述条件变化少，并使得形成血管内皮细胞的效率更高；2.发明的培养体系作用于人ES细胞，可在体外模拟人胚胎时期血管形成的演变过程；3.本发明用hES培养血管内皮细胞；4.该培养方法重复性高。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
实施例1用人胚胎干细胞培养血管内皮细胞a.将人胚胎干细胞(ES细胞)(购自上海组织工程研究与开发中心，上海，中国)，接种到预先铺过1％琼脂的培养皿，培养液为knockout-DMEM(购自Gibco公司)，其中加入20％SR(购自Gibco公司)，1％非必需氨基酸(购自Gibco公司)，1mML-glutamine(购自Sigma公司)，0.1mMβ-mercaptoethanol(购自Sigma公司)，并加RA(购自Sigma公司)至终浓度为1×10-9mol/L。在37℃、5％CO2培养3-5天，收集生长较好的拟胚体(EB)；b.将步骤a中收集的EB均等地移植到预先用0.1％明胶铺过的培养皿中，加含3ng/mlTGF-β1(购自R&D公司)的无血清DMEM(即用TGF-β1替换RA，其他成分同步骤a)，每隔两天换液，继续培养。每天观察照相，并做相关检测。
实施例2检测一、倒置相差显微镜观察体外诱导hES细胞定向分化时，每天在荧光倒置相差显微镜(购自Zeiss公司)下观察、记录EB的形成，及血管内皮细胞的分化过程。
二、电镜检测1.扫描电镜检测取诱导后分化出的上皮样和圆形细胞及血管样结构，以2％戊二醛固定，PBS漂洗，1％锇酸固定，PBS漂洗，梯度酒精脱水，醋酸正戊酯置换，CO2临界点干燥，离子喷射仪喷金，扫描电镜观察。
2.透射电镜检测取诱导后分化出的上皮样和圆形细胞及血管样结构，2％戊二醛固定24小时，收集标本，1％锇酸后固定1小时，梯度酒精脱水，1∶1丙酮包埋液渗透，EPON包埋，常规超薄切片，透射电镜(JEM-1200EX)观察细胞与血管的超微结构。
三、免疫荧光检测将EB放置在0.1％明胶包被的盖玻片上贴壁，按上述条件进行诱导分化。然后将EB爬片分实验组(滴加一抗)、空白对照组(未加一抗)；并以小鼠成纤维细胞作阴性对照组。具体步骤如下1.EB爬片置PBS(购自Hyclone公司)中洗涤，2min×5次；2.4％多聚甲醛固定30min；3.PBS漂洗2min×5次；4.0.25％Triton-100，5％DMSO-PBS作用10min；5.PBS漂洗5min×3次；6.1.5％H2O2-PBS，37℃，15min，以阻断内源性过氧化物酶；7.PBS漂洗3min×3次；8.滴加绵羊血清(10％血清-PBS)，置湿盒内，37℃，45min；9.弃去血清，实验组与阴性对照组细胞爬片滴加一抗(兔抗人VIII因子抗体(购自Santcruz公司)(1∶100)和鼠抗人CD31单抗(购自Santcruz公司)(1∶50)，空白组滴加PBS；三组爬片置湿盒内37℃反应45分钟；10.PBS漂洗5min×3次；11.滴加二抗(羊抗兔IgG-FITC，羊抗鼠IgG-罗丹明)(购自华美公司)，37℃，30min；12.PBS洗3min×3次；13.荧光显微镜下观察并拍照。
四、Dil-Ac-LDL标记检测以无血清DMEM稀释Dil-Ac-LDL为10ug/ml，加至已分化出血管样结构的EB培养皿中，37℃孵育4小时，将其去除，无血清DMEM洗3遍，荧光显微镜观察，照相。
结果一、hES细胞体外诱导EB形成hES细胞在MEF细胞的饲养层上呈巢穴状生长，见图1。
结果显示，接种于1％软琼脂铺底的培养皿内呈悬浮生长，经含1×10-9mol/L RA的培养液培养后，小细胞团细胞增殖，体积渐大；在第5天时形成球形的胚体，好的胚体透亮、边缘光洁，见图2。
二、hES细胞体外诱导分化为内皮细胞hES细胞形成EB后移至白明胶包被的培养皿中贴壁生长。在TGF-β1诱导下，第2天EB周围有上皮样细胞和圆形细胞出现，见图3；第3天开始出现由圆形细胞构成短小的管状结构，管道状结构自EB向周围呈辐射状生长，见图4；渐呈交叉网状，见图5。
三、电镜检测1.扫描电镜结果显示，管状结构的管壁最初由许多圆形细胞和扁平状细胞组成，随着管状结构的延伸，细胞逐渐减少，管壁变得光滑，见图6。
2.透射电镜透射电镜结果显示，诱导出的血管样结构由几个内皮样细胞围成，见图7；细胞呈扁平样，表面较光滑，见图8；相临细胞间有紧密连接，见图9。与正常毛细血管结构非常相似，(图10)，证明本发明可成功诱导出血管。
四、免疫荧光检测hES细胞诱导分化的管状结构经vWF、CD31、Flk-1抗体免疫荧光检测均呈阳性，见图11-13，证明由人ES诱导分化而来的细胞具内皮细胞性质。
五、Dil-Ac-LDLDil-Ac-LDL摄取实验结果呈红色荧光，见图14，为阳性。证明hES细胞定向诱导分化的细胞具有内皮细胞的功能。
本实施例中，vWF免疫荧光染色和Dil-LDL直接荧光检测结果均为阳性，表明构成管样结构的细胞具有内皮细胞性质，表明低浓度RA和TGF-β1可诱导人ES细胞分化为内皮细胞及血管样结构。
实施例3血管内皮细胞-生物材料复合物的制备将原代、第一代、第二代、第三代、第四代、第五代、第六代的细胞悬液分别离心(1500r/min)，倾去上清，将细胞沉淀与可注射性生物材料Pluronic F-127(一种市售的聚环氧乙烯商品)在4℃下充分混合，浓度为5×107个细胞/ml，制成细胞-聚环氧乙烯复合物。用2ml注射器吸取复合物备用。
实施例4含血管内皮细胞的组合物的制备将实施例1所得的血管内皮细胞与血管平滑肌细胞混合，制得组合物，将该组合物配制成浓度为5×107个细胞/ml的细胞悬液，取1ml注入体内缺血部位(如心肌梗塞部位)，用于治疗血管性疾病。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种血管内皮细胞的培养方法，其特征在于，包括步骤a.在基本上不含有动物血清和含维甲酸的培养液中，培养人胚胎干细胞，形成拟胚体；b.用含β1-转化生长因子的培养液将拟胚体培养成具有血管样结构的血管内皮细胞。
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤a中所述培养基基本上不含动物血清是指哺乳动物血清的体积浓度为0-2％。
3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤a中所用的维甲酸浓度为0.1-3×10-9mol/L。
4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤a和b中的培养是在37±2℃，和5±1％CO2条件下培养1-7天。
5.如权利要求1或4所述的培养方法，其特征在于，步骤b中所用的β1-转化生长因子浓度为1-5ng/ml。
6.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，在步骤a和b之间还包括步骤将拟胚体进行贴壁培养。
7.一种如权利要求1所述的培养方法所得的血管内皮细胞。
8.根据权利要求1所述的培养方法得到的血管内皮细胞的用途，其特征在于，用作构建组织工程化血管的种子细胞。
9.根据权利要求1所述的培养方法得到的血管内皮细胞的用途，其特征在于，用于制备血管移植物。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的移植物用于治疗血管性疾病。
全文摘要
一种培养血管内皮细胞的方法涉及组织工程学中获得种子细胞的方法，本发明在基本上不含有动物血清的培养基中培养人胚胎干细胞，然后利用RA和TGF－β培养出血管内皮细胞，为组织工程化种子细胞的获得开辟了新的来源。
文档编号C12N5/08GK1990858SQ200510112069
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月27日 优先权日2005年12月27日
发明者曹谊林, 丛笑倩, 王彦, 吴春芳, 唐郑雅, 张文杰, 刘伟, 崔磊 申请人:上海国睿生命科技有限公司