通过给定的因子将人内皮细胞重编程为造血多系祖细胞的制作方法
【专利说明】通过给定的因子将人内皮细胞重编程为造血多系祖细胞
[0001] 相关申请的夺叉参考
[0002] 本申请要求2013年1月15日申请的美国临时申请61/752, 688的优先权，其全部 内容并入本申请。
[0003] 本发_的背景
[0004]通过细胞核移植（Gurdon，J.B?等，Nature182 :64_65 (1958) ;Eggan，K?等， Nature) 428 :44-49 (2004)，Noggle，S?等，Nature478 :70-75 (2011))，细胞融合（Tada， M?等，CurrBiol11:1553-1558(2001) ;Cowan，C.A?等，Science309:1369-1373(2005); Blau，H.M.等，SeminCellDevBiol10:267-272(1999))以及转录因子的强制表 达（Takahashi，K?等，Cell131:861-872(2007);Chen，M.J?等，CellStemCell9: 541-552(2011))已将体细胞重编程为寡能状态。体细胞也被重编程为终末分化细胞，例 如成肌细胞（Davis，R.L?等，Cell51 :987-1000(1987))，类巨噬细胞（Xie，H?等，Cell 117 :663-676(2004))，0 细胞（Zhou，Q?等，Nature455 :627-632(2008))，类肝细胞 (Sekiya，S?等，Nature475 :390_393 (2011))，神经元（Vierbuchen，T?等，Nature463 : 1035-1041(2010))和内皮细胞（Ginsberg，M?等，Cell151 :559-575 (2012))。一些研究 组最近报道了将纤维原细胞直接重编程为神经干细胞/多系神经祖细胞（Han，D.W.等， CellStemCell10:465-472(2012) ;Lujan，E?等，ProcNatlAcadSciUSA109: 2527-2532(2012) ;Thier，M?等，CellStemCell10:473-479(2012))。但是，将体细胞 直接转换成为功能性的可移植的多系造血干细胞和祖细胞（HSPC) -直难以实现（Szabo， E?等.Nature468:521-526(2010) ;Chambers，S.M?等，Cell145:827-830(2011); Pereira，C.F?等，CellStemCell13:205-218(2013))。
[0005] 在鼠科动物的发育过程中，给定的造血干细胞（HSC)起源于主动脉-性腺-中肾 (AGM)区域中的背部主动脉（North，T.E?等，Immunity16:661-672(2002);deBruijn， M.F?等，EMB0J192 :465-2474(2000) ;Medvinsky，A?等，Cell86 :897-906(1996))。在 包括斑马鱼、鼠类以及可能人类的脊椎动物中，HSC被认为从内衬背主动脉底部和脐动脉的 造血血管细胞的层中出现（Zovein，A.C?等，CellStemCell3:625-636(2008) ;Boisset， J.C?等，Nature464 :116-120(2010);Bertrand，J.Y?等，Nature464:108-111(2010); Kissa，K.等，Nature464:112-115(2010))。这个过程依赖于转录因子（TF)RUNXl的表 达（Chen，M.J.等，Nature457 :887-891 (2009))。在胚体中内皮细胞（EC)和HSPC发育 的密切关系引起了造血作用的内皮-造血转化理论（Zovein，A.C.等，CellStemCell3: 625-636(2008))。
[0006] 尽管已知HSCs和给定的红系/骨髓祖细胞（EMP)来自多个含造血内皮细胞的位 置，但仍然很难表征驱动原始造血内皮细胞向造血祖细胞自发个体发育转变的分子模式 (Chen，M.J?等，Nature457:887-891(2009) ;North，T.E?等，Cell137:736-748(2009))， 这是因为关键分子的识别和它们活动的次序仍然难以捉摸（Orkin，S.H.等，Cell132: 631-644(2008))。转录因子在造血内皮细胞子代中的差异化表达与早期发育决定相关联以 产生给定的HSPC或EC(Chen，M.J.etal.CellStemCell9:541-552(2011))。然而，尚 不清楚转录因子是否指引这些细胞命运的决定或者只是简单地推进造血内皮细胞中的预 定程序。通过解剖学上不同的生态位提供的微环境线索-如AGM、胎儿肝脏和胎盘中的那 些-对原始造血HSCs的生理扩增和有效造血发育而言也同样需要（Gekas，C.等，DevCell 8 ：365-375(2005))〇
[0007] 治疗血液疾病的现代方法依赖于移植健康的HSPC。目前，有两种主要的可生产足 够数量的同种异体和自体HSPC的方法，而这两者都具有如下局限性：（1)HSPC(例如，来自 脐带血的HSPC)的体外扩增；以及（2)寡能干细胞定向分化为HSPC。健康的HSPC的体外 扩增受限于可使用的供体，并且自体移植时的纯化方法和同种异体移植时的HLA匹配使其 复杂化。寡能细胞的定向分化受限于我们对造血系统发育的理解以及稳定的内皮细胞的产 生，并且尚未得到足够数量的成人可移植的HSPC。
【发明内容】
[0008] 简休
[0009] 本发明涉及通过影响在内皮细胞中的某些转录因子的强制表达以及在内皮饲养 细胞存在下在无血清培养基中培养内皮细胞，来从内皮细胞生成造血多系祖细胞（HMLP)。 按照本发明生成的HMLP可以产生红系、淋巴、骨髓和巨核细胞。这些生成的HMLP可以移植 到小鼠体内，因此可用于对包括造血状况等疾病的治疗性处理中。
[0010] 因此，本发明提供了从人内皮细胞（EC)生成人造血多系祖细胞（HMLP)的方法。所 述方法包括在有内皮饲养细胞的无血清培养基中培养内皮细胞，所述内皮细胞经转化表达 以下每种转录因子：Finkel-Biskis-Jinkins鼠骨肉瘤病毒致癌基因同源物B(FOSB)，生长 因子独立转录抑制子1 (GFI1)，侏儒相关转录因子1 (RUNX1)，脾脏病灶形成病毒原病毒整 合致癌基因（SPI1)，或其功能同源物或F0SB、GF11、RUNX1和SPI1的衍生物。
[0011] 内皮细胞可用于产生HMLP，所述内皮细胞包括胎儿、新生儿、成人或内皮祖细胞。 在一些实施方式中，所述内皮细胞选自人脐带静脉内皮细胞（HUVEC)或成人皮肤微血管内 皮细胞（hDMEC)。
[0012] 在一些实施方式中，通过一种或多种载体转导内皮细胞会影响转录因子的强制表 达，所述载体驱动FOSB、GFI1、RUNX1和SPI1的表达。这些载体中的至少一个还包括可选 择的标记物，如抗生素抗性标记物、酶标记物、表位标记物或可视标记物。在存在所述内皮 饲养细胞的情况下进行培养之前，通过选择表达至少一种可选择标记物的细胞，根据F0SB、 GFI1、RUNX1和/或SPI1的表达来富集所述内皮细胞。在一些实施方式中，FOSB、GFI1、 RUNX1和SPI1中的一种或多种的所述表达为可诱导的和/或瞬时的。
[0013] 内皮饲养细胞可以从多种内皮细胞中进行选择。在一些实施方式中，所述饲养细 胞是人脐带静脉内皮细胞（HUVEC)，所述人脐带静脉内皮细胞（HUVEC)被转化以表达选自 以下的基因：腺病毒E4开放阅读框1 (E40RF1)基因或Akt基因。
[0014] 内皮细胞可以在内皮饲养细胞存在下，在无血清造血培养基中生长，如无血清造 血干细胞培养基。所述无血清造血培养基可以包括生长因子和/或细胞因子，特别是bFGF、 EGF、SCF、FLT3、TP0和IL-6。无血清造血培养基也可以包括IGF-l、IGF-2和IL-3。可以培 养内皮细胞至少五天，以产生HMLP。可以基于⑶45+细胞的选择从细胞培养中分离HMLP。 在一些实施方式中，通过选择⑶45+⑶34+细胞来选择HMLP。生成的HMLP通常是细胞的异 质混合物，但在特定实施方式中，HMLP的混合物包括⑶45+Lin⑶45RA⑶38⑶90+⑶34+和/ 或CD45+LinCD45RACD38CD90CD34+的细胞。
[0015] 本发明还提供了根据本发明所公开的方法产生的HMLP的群体。一种组合物，所述 组合物包括在药学上可接受的运载体中的通过根据权利要求1所述的方法生产的HMLP。
[0016] 本发明还提供了治疗造血功能障碍的方法，包括向给需要治疗的对象给予内皮细 胞生成的HMLP。HMLP可以在移植到接受者后分化成造血细胞。所述造血功能障碍可以选 自，例如，白血病或淋巴瘤。给予所述对象的HMLP可以是与对象自体同源的，或与对象同种 异体。根据所述公开的方法生成的HMLP不会在接受者中引起恶变。
[0017] 附图的简要说明
[0018] 图1A-1E。A?将人脐带静脉内皮细胞（HUVEC)向造血多系祖细胞（rEC-HMLP) 重编程的平台技术的图示。从丢弃的脐带中分离HUVEC，分类以得到表型标记为 ⑶45⑶133cKit⑶31+的内皮细胞（EC)的纯群体，并扩增以用于进一步的实验（-14至0 天）。用FGRS转导HUVEC，并使转基因稳定表达（1-3天）。转导的HUVEC以1/6密度铺 板（第4天），并在无血清培养基中的E40RF1+HUVEC(E4-HUVEC)的血管生态位样层上生 长（12-40天）。在向血管生态位样层上接种转导的细胞两周左右后，观察不同的扁平集落 (12-16天）。随着时间的推移（21-29天），一些菌落呈现了代表假定的rEC-HMLP的三维葡 萄状结构。一个月后（29-40天）rEC-HMLP大量扩增出现典型的造血集落。重编程的过程 细分为两个阶段：阶段I-特异化和阶段II-扩增。常规测定扩增的培养物的形态变化、细 胞数量以及全造血标记物⑶45的表达。灰线代表将HUVEC重编程为rEC-HMLP的细胞数量 动态。黑线说明hES-EC分化成造血祖细胞的低扩增潜力。B.用一组TF(白色箭头）转导 HUVEC两至三个星期后出现圆形造血样⑶45+细胞。比例尺为200ym。C.通过与血管生态 位共培养和无血清环境来增强以及通过血清的存在来阻断从FGRS转导的HUVEC产生造血 状集簇。D.通过逐一去除TF揭示了在HUVEC培养中能够产生造血状集落的最小的一组因 子（FOSB，GFI1，RUNX1和SPI1)。对一组26种TF减去一种TF引起造血状集簇形成（n= 3)的能力进行评估。星号表示，与全组转录因子相比，在转导的HUVEC中的造血状集簇的数 目在统计学上显著（P< 0.05)减少。对照样本代表非转导HUVEC。在无血清造血培养基 中在非转导的E4-HUVEC层上培养转导的细胞。E.逐一去除FGRS因子表明，所有四种FGRS 因子对长效造血状集落的产生是必要的且充分的。
[0019] 图2A-2E。A.对混合的GFPE4-HUVEC饲养血管单层和GFP+FGRS转导的HUVEC的 FACS分析表明，GFP+新生造血细胞失去⑶31的表达（成熟的内皮细胞标记物），并获得 ⑶45 +和⑶45 +⑶34+造血表型。在灰色字体的点图中的百分数是指在左上角点图（GFP+细 胞）的门。在黑色字体的点图中的百分数是指GFP细胞。B.FGRS重编程的HUVEC的免疫表 型分析。对形成的造血细胞进行谱系标记物，⑶45RA、⑶45、⑶34、⑶90和⑶38的表达测试。 如图所示，两个群体CD45+LinCD45RACD38CD90+CD34+和CD45+LinCD45RACD38CD90CD34+ 细胞，分别满足造血干细胞样细胞或多能祖细胞的表型标准。C.在阶段I结束时，在FGRS 转导和血管生态位诱导四周后，对GFPCD45CD34细胞进行分类并进行接种用于CFU测试。在 CFU测试（放大倍数X4)、宽视场（左列）和相应的荧光图像（右列）中出现典型造血集 落。从上到下依次为：粒细胞-红细胞-单核细胞-巨核细胞（GEMM)、红系细胞/骨髓细胞 和粒细胞-巨噬细胞（GM)的集落。下方图像显示血红蛋白化的集落。图表显示了CFU测 试的定量结果。D.从CFU测试集落获得的细胞离心涂片的瑞氏-吉姆萨（Wright-Giemsa) 染色证实了分化中的rEC-HMLP(放大倍数X60)的谱系特异化。我们发现了具有红细胞、 巨噬细胞、粒细胞和巨核细胞前体的典型形态特征的细胞。E.对在CFU试验中生长的细胞 的免疫表型分析表明了⑶235+、⑶llb+、⑶14+、⑶83+和⑶45 +细胞的存在，这表明rEC-HMLP 分化成红细胞、巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞后代。
[0020] 图3A-3G。A?将重编程的细胞（1. 5X106个⑶45 +GFP+细胞）经眼眶后注入到亚致 死剂量照射（275Rad)的小鼠（n= 9 ;辐射1天后）体内。B.在2、5、12和16周在经注射 的小鼠外周血中检测循环的人⑶45+细胞。在2周（n= 7 ;17. 38±7. 73% )、5周（n= 6 ; 15. 1±13.39%)、12周（n= 6 ;14. 14±5.44%)和 22-40周（n= 6 ;21.23±22.27%)对循 环的人CD45+细胞进行检测。将移植22-44周（最多10个月）的小鼠用于进一步分析脊髓异 常增生和纤维性变化。C.在移植16周后，外周血、骨髓和脾的分析表明在所有三种组织中 存在人⑶45+细胞并在外周血中存在h⑶45h⑶235+红细胞。BM结果如图所示。BM和脾聚集 了rEC-HMLP(CD45+CD33+)的髓系后代和少量但易于检测的量的CD41a+细胞（巨核细胞）。 D.甲基纤维素培养物的FACS分析显示⑶45隔室包含⑶235 +(血型糖蛋白A)和非小鼠Terll9+细胞，这表明在CFU试验中人⑶45 +⑶34+细胞强烈的红细胞分化。E.骨髓内体内移 植的rEC-HMLP的表型分析显示少数人细胞被表型标记为⑶45+Lin⑶45RA⑶38⑶90⑶34+ 并且满足多效祖细胞（MPP)的定义。F.在单集落水平上鉴定病毒的整合。将Lin⑶45RA