使用造血生长因子治疗神经系统疾病的方法

专利名称：使用造血生长因子治疗神经系统疾病的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过给予造血生长因子治疗哺乳动物神经系统疾病的方法，所述 造血生长因子例如粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)和 /或其他造血因子，例如除促红细胞生成素(EPO)外的MCSF。本发明也提供了用于筛选与 神经元细胞表面发现的GCSF或GMCSF受体结合的化合物的方法；所述化合物提供了神经保 护、神经增殖和/或STAT基因激活活性。
背景技术：
生长因子是实质上涉及调节发育神经元细胞生存、增殖、成熟和向外生长的蛋白 质。例如，许多生长因子的表达能增加对各种脑损伤的应答。许多因子显示了内源性神经保 护和神经营养作用(参见 Arvidsson A 等.，Neuroscience 2001 ； 106 :27_41 Larsson E, 等.，JCereb Blood Flow Metab 1999 ；19 1220-8 :Mattson MP.等.，JNeurotrauma 1994 ； 11 3~33 :Semkova I,等Brain Res Brain Res Revl999 ;30 176-88)。在脑外伤和中 风后，在体外和体内进行外源性给药后也报道了这些效应(参见Semkova I.，等.，Brain Res. Rev. 1999 ；30 176-88 :Fisher Μ,等· , J. Cereb. Blood Flow Metab. 1995 ；15 953-9 ； SchabitZ W.等.，Stroke 2001;32:1226-33; SchSbltz WR,等.，Stroke2000 31
2212-7)。在结合到高亲和力膜受体后，通过胞内信号转导事件级联介导了生长因子的效应 (Kernie SG,等.，Arch Neurol 2000 ；57 :654_7)，其诱导细胞生长并分化；或提供用于细 胞生存的营养支持。粒细胞集落刺激因子(GCSF)，一种20kDa蛋白质，与肿瘤坏死因子α (TNF- α )以 及白介素都是生长因子-细胞因子家族成员。GCSF是嗜中性粒细胞产生的重要生长因子。GCSF通过激活属于促红细胞生成素受体超家族的膜受体(GCSF受体)从而发挥功 能，所述膜受体称为I类细胞因子受体(de Koning和Touw, Curr. Opin. Hemato.，1996，3， 180-4)。业已发现许多淋巴因子、造血生长因子和生长激素相关分子的受体具有共同的结 合域。这些受体称为促红细胞生成素受体，相应的配体称为促红细胞生成素。此外，业已 将促红细胞生成素分为两种主要的结构群大/长以及小/短的促红细胞生成素。特有 受体链的一个亚型，即大的促红细胞生成素受体复合物一部分，在其的胞外部分包含共同 的结构成分免疫球蛋白样结构域、促红细胞生成素受体结构域以及3个粘连蛋白III结 构域(2个位于来普汀受体中)。这一亚类称为“gpl30家族受体” (Moslev.等.，J. Biol Chem. 1996，271，32635-43)并包括来普汀受体(LPTR)、粒细胞集落刺激因子受体(GCSFR)、 白介素-6/-11/LIF/0SM/CNTF共有的β链(GP130)、白血病抑制因子受体(LIFR)、制瘤素-M受体β链(OSMR)、白介素-12受体β -1链(IL12RB1)、白介素-12受体β -2链 (IL12RB2)。当结合同类细胞因子时，这些受体链同源二聚体化(GCSFR、GP130、LPTR)或异 源二聚体化(GP130与LIFR或0SMR、IL12RB1与IL12RB2)。此外，这些受体家族具有Prosite 共有模式的特点，其为N-x (4) -S-X (28 , 35) - [LVIM] -x-ff-x (O，3) -Ρ-χ (5，9) - [YF] -χ (1， 2)-[VILM] -x-ff(SEQ ID NO 1)GCSF刺激细胞增殖、生存及成熟，所述细胞通过结合特异的GCSF受体(GCSFR)而 提呈至嗜中性粒细胞系(参见 Hartung T 等.，Curr. Opin. Hemato. 1998 ；5 :221_5)。GCSFR 介导信号转导子及转录激活子(STAT)蛋白家族信号激活，该STAT蛋白易位至细胞核并调 节转录(Darnell TE Tr. ,Science 1997 ；277 1630-5)。通常将GCSF用于治疗人中各种中 性白细胞减少症。其是屈指可数的被批准用于临床使用的生长因子之一。具体而言，其用于 缓解化学疗法(CT)-诱导的血细胞减少症(Viens等·，J of Clin. Oncology, Vol. 20, No. 1， 2002 24-36)。作为可能的辅助剂，也包括将GCSF用于治疗传染性疾病(Hiibel等，J. of Infectious Diseases, Vol. 185 1490-501，2002)。据报道GCSF 已结晶至一定程度(EP 344 796)，业已推测出GCSF的总体结构，但仅是大体水平推测(Bazan, Immunology Today 11: 350-354(1990) Parrv 等.R Molecular Recognition 8 :107N 110(1988))。近年来临床研究业已测试了许多生长因子诸如bFGF、血小板粘连阻滞剂样抗-GP Ilb/IIa等药学上所期望物质以及Abcizimab的神经保护功效。不幸的是，它们都无法成功 地提供神经保护功效。具体而言，NMDA拮抗剂、自由基清除剂和谷氨酸盐拮抗剂无法提供 神经保护功效或表现出严重副作用。诸如抗ICAM或谷氨酸盐介导的NO-合成酶抑制剂的 一组物质不具备神经生长能力(De Keyser 等.(1999)，TrendsNeurosci，22，535-40)。大多数关于脑缺血的研究和体内的药用物质测试仅集中于所述药物或正在研究 中的模系的瞬即效应(即在诱发中风24小时后的梗塞面积)。然而，特定物质更有效的真 正有效参数是对机能恢复的长期效应，其在人中风研究中也得到反映，在此临床分级(如， 斯堪的纳维亚人中风分级、NIH分级、巴塞尔(Barthel)指数)也反映了进行日常活动的能 力。在局部性病变后开始几天内的恢复可能是因为缺血半影区水肿或再灌注消退之故。在 急性期后大部分机能恢复有可能是因为脑可塑性之故，利用邻近皮层区接管所述受损区以 前所行使的功能(Chen R,Cohen LG,Hallett Μ. Neuroscience 2002 ；111(4) :761_73)。提 议用于解释组织再生的两种主要机制早已公开，但不包括功能上失活的连接以及诸如侧索 生芽的新连接的生长(Chen R, Cohen LG, Hallett Μ. 2002 Neuroscience 2002 ；111 (4) 761-73)。去除对兴奋性突触的抑制介导了短期塑性变化，其有可能是因为GABA能的抑制 缓解之故(Kaas JH. Annu Rev Neurosci. 1991 ；14 137-67 [Tones EG. CerebCortex. 1993 Sep-Oct ；3 (5) :361-72)。在一段较长时间后，所发生的可塑性变化涉及除诸如长程增强效 应(LTP)的隐藏突触暴露之外的机制，其需要NMDA受体激活并增加胞内钙浓度(Hess和 DonoRhue,.! Neurophysiol. 199471(6) :2543_7)。长期变化也涉及轴突再生和突触形状、数 量、大小以及类型具有改变的生芽(Kaas JH. Annu RevNeurosci. 1991 ；14 :137_67. 3 )。中风是位列第三的死因，在西方世界中还是导致残疾的主因。其带来了巨大的社 会经济负担。其病因可能是局部缺血(在大多数情况下)或出血。局部缺血中风的诱因通 常是栓塞或血栓形成。迄今为止，对于大多数中风病人而言尚无有效疗法。目前为止，临床上有效的药物仅有组织纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)和阿斯匹林。由于缺乏葡萄糖和氧， 在接近梗塞核心的大量细胞坏死后，因诸如谷氨酸盐兴奋性中毒、细胞凋亡机制和自由基 产生等次要机制，梗塞面积在一段时间内不断扩大。肌萎缩性侧索硬化(ALS ；Lou-Gehrig氏病；Charcot氏病)是一种神经变性障碍， 年发病率为 0. 4-1. 76/10 万人(Adams 等 ，Principlesof Neurology,第 6 版 ，New York, PP 1090-1095)。其是运动神经元病变的最常见类型，典型表现为全身性肌束震颤、进行 性萎缩和骨骼肌无力、痉挛状态和锥体束征、发音困难、吞咽困难和呼吸困难。其病理主要 包括脊髓前角和下脑干运动核中神经细胞的损失，但也可包括所述皮层中一级运动神经元 的损失。该破坏性疾病的发病机理基本上还不清楚，虽然在家族病例中业已十分彻底地研 究出超氧化物歧化酶(S0D1)突变体的作用，其援引了氧化应激假说。迄今为止，在S0D1蛋 白中已经描述了超过90种可导致ALS的变体(Cleveland和Rothstein (2001)，Nat Rev Neurosci，2，806-19)。并且，显示了神经丝在该疾病中所起的作用。通过过量谷氨酸盐刺激 诱发兴奋性中毒的机制也是一个重要因素，其为利鲁唑在人类患者中的有益作用所例证。 在S0D1突变体中的表现最具说服力，在ALS中凋亡蛋白酶和细胞凋亡激活似乎是常见的最 终途径(Ishigaki.等.(2002)，J Neurochem, 82, 576-84.，Li,等.(2000)，Science, 288, 335-9)。因此，似乎ALS也属于相同的普遍致病类型，即在其他神经变性疾病和中风中也发 挥作用，如谷氨酸盐介入、氧化应激和程序性细胞死亡。帕金森氏症是最常见的运动障碍，在北美洲大约有1百万病人；在超过65岁年 龄的人群中大约有感染此病。该疾病核心症状是僵直、震颤和运动不能(Adams等 , Principles of Neurology，第 6 版 ，NewYork，pp 1090-1095)。帕金森氏症病因未知。然 而，来自人脑尸体解剖研究的重要尸体生化数据和动物模型指出在黑质中氧化应激的进行 过程，其可能启动多巴胺能神经变性。为神经毒素6-羟基多巴胺和MPTP(N-甲基4-苯 基-1，2，3，6-四氢吡啶)所诱导的氧化应激业已被用于动物模型来研究神经变性过程。 虽然存在继发性疗法(如，L-D0PA加脱羧酶抑制剂；溴麦角环肽，甲基多巴激动剂培高利 特(pergolide)；以及诸如三己芬迪(安坦)的抗胆碱能药)，但很清楚需要针对病因的 疗法，如神经保护疗法，其真正地阻止了该病症的发展。这些动物模型业已用于测试自由 基清除剂、铁螯合剂、多巴胺激动剂、一氧化氮合酶抑制剂以及某些钙离子通道拮抗剂的 有效性。在动物模型以及患者中清楚可见细胞凋亡机制起作用(Mochizuki，等.(2001)， Proc. Natl. Acad. Sci. USA,98，10918-23，Xu 等.(2002)，Nat. Med.，8，600-6，Viswanath, 等.(2001)，J Neurosci.，21，9519-28，Hartmann，等.(2002)，Neurology，58，308-10)。这 些病理生理学涉及氧化应激和细胞凋亡，也将帕金森氏症置于另一种神经变性病症和中风 之间。脑缺血可由多种原因引起，其减少脑血流量(CBF)并导致氧和葡萄糖丧失。另一 方面，外伤性脑损伤(TBI)涉及一种原发性机械撞击，其通常导致颅骨骨折和脑软组织突 然破裂，即血管和脑组织切断并撕裂。这样，依次触发以分子和细胞反应激活作用为特征的 级联事件，导致继发性损伤。上述继发性损伤的进展是一种活动进程，其中涉及许多生物化 学途径(Leker和Shohami (2002), Brain Res. Rev.，39，55-73)。业已发现在该导致半影局 部缺血区继发性细胞死亡的有害途径和在该区暴露于继发性外伤后的损伤之间具有许多 相似点(如，过量谷氨酸盐释放所导致的兴奋性中毒、一氧化氮、活性氧簇、炎症以及细胞凋亡(Leker 和 Shohami (2002) ,Brain Res. Rev.，39，55-73))。此外，报道了在外伤性脑损 伤后早期局部缺血发作的偶发事件，对于原发性机械损伤而言增加了局部缺血症状。心血管疾病在西方工业化国家是主要的致死原因。在美国，每年大约有1百万 人死亡，其中约50%是在医院外发生的突发性事件(Zheng.等(2001)，Circulation, 104, 2158-63) ο每年，在每100，000个居住者中进行了 40-90例心肺复苏(CPR)，这些患 者中25-50%实现了自发循环恢复(R0SC)。然而，进行成功的ROSC后出院率仅有2-10% (Bottiger,等.(1999)，Heart，82，674-9)。因此，每年在美国绝大多数心脏停搏患者无法 得到成功治疗。在成功进行CPR后，低生存率(即住院病人心脏停搏后的死亡率)的主要 原因是持续性脑损伤。在心循环停止后，脑损伤与缺氧负荷的短期耐受性以及特异性再灌 注病症相关(Safar (1986), Circulation, 74, IV138-53, Hossmann (1993), Resuscitation, 26，225-35)。最初，更多患者在心循环停止后在血流动力学上可能是稳定的；然而，他们 中很多人由于中枢神经系统损伤而死亡。在心脏停搏后脑损伤的个人、社会以及经济后 果是具有破坏性的。因此，在心脏停搏以及复苏(“全身缺血和再灌注”)研究中一个最 重要结果是大脑复苏和心脏停搏后大脑损害(Safar (1986), Circulation，74，IV138-53， Safari (2002), Crit Care Med，30，p. 140-4)。目前，无法减少对神经元的原发性损伤， 即使用任何心脏停搏后的治疗方法在心脏停搏期间由缺氧所引起的原发性损伤。主要的 病理生理学结果包括缺氧和继发性坏死、具有自由基形成的再灌注损伤和细胞钙流入、兴 奋性氨基酸释放、脑微循环再灌注病症以及程序性神经元死亡或细胞凋亡(Safar (1986)， Circulation, 74, IV138-53, Safar 等.(2002)，Crit Care Med，30，140-4)。一些临床试验试图改善心脏停搏后神经系统结果，但不成功。测试了巴比妥 酸盐(增强神经保护作用)或钙通道阻滞剂(减少局部缺血再灌注损伤)的治疗用途 (Group (1986)，Am. J. Emerg. Med.，4，72-86，Group (1986)，N. Engl. J. Med.，314，397-403， Group (1991)，ControlClin.Trials,12,525-45, Group (1991)，N. Engl. J.Med.，324， 1225-31)。迄今为止，在临床条件下尚未有可用于改善心循环停止后神经系统结果的特效 心脏停搏后治疗方案(可能的例外是轻度低温以及溶栓，渴望期待其大量的、以及受控的 临床试验结果(Safar等(2002)，Crit. Care Med.，30，140—4)。因此，关键在于要有一种用 于改善心脏停搏后神经系统结果的创新疗法。多发性硬化症是中枢神经系统炎症性自身免疫性疾病原型，具有1/400的风险 率，在年轻的成年人中可能是神经失能的最常见原因。在世界范围内，约有2-5百万患者患 此病(Compston和Coles (2002), Lancet，359，1221-31)。如同所有的复杂疾病一样，该病 症起因于至今尚未鉴定的环境因素与易感基因之间的相互作用。这些因素共同触发了级联 事件，包括启动免疫系统、轴突和神经胶质的急性炎症性损伤、功能恢复和结构修复、炎症 后神经胶质过多症以及神经变性。这些过程的相继涉及构成临床过程的基础，具有发作机 能性恢复、保留持续性缺陷发作以及继发性进展的特征。治疗目的是要降低发生频度和限 制复发的持续效果、减轻症状、预防起疾病发展为残疾并促进组织修复作用。抑郁症是一种 常见的精神错乱，具有忧愁、丧失活动兴趣和精力减少的特点。抑郁症区别于正常情绪的改 变是在于其严重程度、症状和病症持续时间。自杀属于抑郁症一种常见的和常常不可避免 的结果。如果抑郁发作交替着夸张的情绪高涨或兴奋增盛，则称为双相性精神障碍。在所 有自杀者中60%是由抑郁症和精神分裂症所引起。抑郁症的原因众多。社会心理因素，例如不利的生活条件，可能影响其发病和抑郁发作的持久性。遗传和生物因素也起作用。估计当前有1. 21亿人患抑郁症。抑郁症是残疾的主要诱因，可通过YLDs (劳力 丧失的寿命年)得到测定，并是2000年全球排名第四的疾病负担(DALYs =残疾修正寿命 年；由于早产儿死亡导致的可能的寿命损失和由于残疾导致的生产寿命年限损失的总和年 限)。估计5. 8%的男子和9. 5%的妇女在一生中会经历抑郁发作。到2020年，估计抑郁症 排到对所有年龄男女所计算的DALYs的第二位。在发展中国家，抑郁症将是造成疾病负担 的最主要原因。当今对于大多数抑郁症患者而言，最主要的疗法包括抗抑郁药物疗法、心理疗法 或两者相结合的方法。兴奋剂对于大部分的严重抑郁发作是有效的。当前，有效的抗抑郁 疗法与5-羟色胺能神经传递的调节或细调密切相关。增加脑中5-羟色胺水平的药物是已 知的最有效抗抑郁药(例如氟苯氧丙胺、Prozac 或Fhictin )。此外，在患者中具有 抗抑郁效果的疗法也包括诸如锂的药理学上抗抑郁药、电惊厥治疗和体育锻炼。其他的干 预包括对于脆弱个体、家族和群组建立支援性的网络系统。关于抑郁症预防的数据资料无 法让人确信，只有少数独立的研究表明所建议的干预对于预防抑郁症是有效的。重要的是 要考虑药物存在的目的是在于减轻该疾病症状，而非针对最初所提出的引起该疾病的基本 病理生理学机制。因此，一种新疗法必须能具体针对新发现的抑郁症病因。精神分裂症是一种最常见的精神疾病。每100人中约有1人(1%的人口)患精神 分裂症。该病症在全世界都有发现，并存在于所有种族和文化中。患精神分裂症的男性和女 性数量相等，虽然平均起来，男性看来似乎较女性更早产生精神分裂症。一般来说，男性在 25、6岁时就显示精神分裂症的最初症状，而女性则在28、9岁时才显示该最初症状。对于社 会而言精神分裂症代价巨大，估计美国每年损失325亿美元。精神分裂症具有部分如下症 状错觉、幻觉、思维及言语紊乱、阴性症状(回避社交、缺少感情和表情、精力衰退、动力和 活力降低)、紧张症。对于精神分裂症而言，其主要疗法是基于神经安定(neuropl印tics) 的疗法，例如氯丙嗪、氟哌丁苯、奥氮平、氯氮平、甲硫哒嗪等等。然而，神经安定疗法常常 无法缓解所有精神分裂症症状。而且，神经安定疗法可能具有严重副作用，例如迟发性运 动障碍。精神分裂症的病因学尚不清楚，虽然好像是一种强遗传作用。近来，其已明朗化， 即精神分裂症至少具有神经变性疾病的某些特征。具体而言，代谢率(MR)研究已显示在 精神分裂症患者中快皮层灰质损失(Thompson，等.(2001)，Proc Natl Acad Sci USA，98， 11650-5 ； Cannon，等.(2002)，Proc Natl Acad Sci USA.，99，3228-33)。因此，批准了使 用诸如GCSF或GMCSF或其他造血因子的神经保护药物疗法来医治精神分裂症。在人类中存在着对增加认知能力和提高智力方法的需要。相信在现代社会中“智 力”不局限于纯粹的逻辑或语义能力。例如，HowardGardner的复杂智力理论从发展和人类 学的观点来评价智力，给出了一种更广泛的观点，即包括运动、音乐、艺术和感情移入能力 以及语言/逻辑能力，也就是说更通常地与智力相关，并通过智商(IQ)测试得到测定。广 义的智力也扩展到创造力智力领域。此外，已知在人类中存在着非病理病症，如ARML (与年 龄相关的记忆损失)或MCI (轻度认知缺损)或ARCD (与年龄相关的认知衰退)，通常开始 于大约40岁，不同于阿尔茨海默氏病早期症状。在整个成人期神经元存在着生理学上损失，估计一天损失多达100，000个。在整 个成人期，脑重量和体积逐渐减小。每十年下降约2%。与早先所持有的看法相反，在50岁后该下降没有加快，但是从成年早期起就延续着大约相同的速度。其累积效应通常直到老 年期才受注意。虽然脑大小在收缩，但并非均勻收缩。某些结构更易收缩。举例来说，海马和额叶， 这两种涉及记忆的结构常常变得更小。部分是因为神经元损失，还有部分是因为某些神经 元萎缩。许多其他脑结构在大小上并没有受损。精神过程的减慢可能是由神经元退化所引 起，不是它们损失、收缩就是失去联系。其完全耗尽了神经元功能，使得需要补充额外的神 经元网状构造以应付脑力工作，否则将简单化或无意识化。因此，该过程减慢了。额叶的一部分，称为前额皮层，涉及思维和行动的监测和控制。在该脑区域出现的 萎缩可用于解释许多老年人所经历的言语困难。也可用于解释忘记汽车钥匙放在哪里或常 有的心不在焉。额叶和海马的收缩被认为是造成记忆困难的原因。因此，尚需改善或增强 个体的认知能力。鉴于以上所述，需要对神经系统疾病和/或精神疾病进行治疗，例如涉及可塑性 和机能恢复增强的神经系统疾病，或神经系统细胞死亡。具体而言，需要通过对所涉及的神 经细胞提供神经保护作用来治疗神经系统疾病。

发明内容
因此，本发明一个目的是提供一种治疗哺乳动物神经系统疾病和/或精神病的方 法，该方法通过给予哺乳动物造血因子，例如GMCSF、GMCSF衍生物、GCSF, GCSF衍生物及它 们组合物，或分泌GCSF或GMCSF或衍生物的细胞以治疗所述疾病。本发明另一个目的是提供一种治疗哺乳动物神经系统疾病的方法，该方法通过使 用诸如GMCSF、GMCSF衍生物、GCSF, GCSF衍生物及它们组合物的造血因子处理神经干细胞 组合物，随后将所述神经干细胞给予哺乳动物用于治疗所述疾病。本发明另一个目的是提供一种方法，用于鉴定能结合神经元细胞上粒细胞集落刺 激因子受体(GCSFR)的化合物及，通过将神经元细胞与所述化合物接触激活神经元细胞中 的STAT;并相对于没有与所述化合物接触的神经元细胞中STAT激活作用，测量增加的STAT 激活作用，以及相对于例如GCSF介导的STAT激活作用，测定其激活作用。此外，通过该方 法获得的化合物和使用所述化合物来治疗神经系统疾病的方法也是本发明的额外目的。本发明另一个目的是提供一种方法，用于鉴定能结合神经元细胞上粒细胞巨噬细 胞集落刺激因子受体(GMCSFR)的化合物和/或，将通过将神经元细胞与所述化合物接触激 活神经元细胞中STAT基因表达；并相对于没有与所述化合物接触的神经元细胞中的STAT 基因激活作用，测量增加的STAT激活作用。此外，通过该方法获得的化合物和使用所述化 合物来治疗神经系统疾病的方法也是本发明的额外目的。本发明另一个目的是提供一种方法，用于鉴定具有改良的神经保护活性的GCSF 受体激动剂，该方法通过将所述化合物与具有GCSF受体的神经细胞接触，测量所述化合物 对神经细胞的神经保护效果，并将所述化合物的效果与GCSF的效果进行比较。此外，通过 该方法获得的化合物和使用所述化合物来治疗神经系统疾病的方法也是本发明的额外目 的。本发明另一个目的是提供一种方法，用于鉴定具有改良的神经保护活性的GMCSF 受体激动剂，通过将所述化合物与具有GMCSF受体的神经细胞接触，测量所述化合物对神
8经细胞的神经保护效果，并将所述化合物的效果与GMCSF的效果进行比较。此外，通过该方 法获得的化合物和使用所述化合物来治疗神经系统疾病的方法也是本发明的额外目的。本发明另一个目的是提供一种方法，用于鉴定具有改良的GCSF受体激动剂活性 的化合物，通过将所述化合物与具有GCSF受体的神经细胞接触，比较所述神经细胞和另一 种与GCSF接触的神经细胞中STAT基因表达水平。此外，通过该方法获得的化合物和使用 所述化合物来治疗神经系统疾病的方法也是本发明的额外目的。本发明另一个目的是提供一种方法，用于鉴定具有改良的GMCSF受体激动剂活性 的化合物，通过将所述化合物与具有GMCSF受体的神经细胞接触，比较所述神经细胞和另 一种与GMCSF接触的神经细胞中STAT基因表达水平。此外，通过该方法获得的化合物和使 用所述化合物来治疗神经系统疾病的方法也是本发明的额外目的。本发明另一个目的是提供一种通过激动在细胞上存在的GCSF或GMCSF受体刺激 GCSF或GMCSF表达和/或在内源性神经细胞中释放的方法。在另一个实施方案中，所述细 胞与能增加GCSF或GMCSF表达和/或释放的物质接触。上述方法可使用用于如在神经细 胞培养物中检测神经细胞中GCSF和/或GMCSF释放或表达增加的测定法(如，PCR和/或 ELISA测定法)。本发明另一个目的是提供一种治疗哺乳动物神经系统疾病的方法，该方法通过激 动GMCSF受体、GCSF受体或两者以治疗神经系统疾病。本发明的另一个目的是提供一种提高移植入哺乳动物体内的细胞的生存率的方 法，该方法在将该细胞移植入哺乳动物体内之前，将一种或多种编码GMCSF、GMCSF衍生物、 GCSF、GCSF衍生物和/或它们组合的多核苷酸导入细胞，与导入所述多核苷酸前细胞生存 率相比，该细胞表达了足够数量的造血因子从而提高了该细胞的生存率。本发明另一个目的是提供一种增强神经细胞培养物生存力的方法，相对于在提供 所述造血因子之前的培养物，该方法通过提供GMCSF、GMCSF衍生物、GCSF、GCSF衍生物和/ 或它们的组合增强了神经细胞培养物生存力。在该方法中，所述造血因子可用于接触所述 培养物细胞或可通过使用编码并表达所述造血因子的多核苷酸来提供之。


图1显示了在体内和体外GCSF有效的神经保护作用。A，在局部脑缺血后GCSF 的神经保护程度(肌原纤维细丝模型；大脑中动脉闭塞，MCA0)，通过TTC染色测定。Y轴 值系所有大脑半球梗塞形成的百分数(数据为均值士SD) ；T-检验；p<0.05)。B，在通过 H202 (0 u M、400 u M、750 u M)提高氧化应激下，在NGF处理的PC12细胞中进行的细胞生存试 验。GCSF处理导致细胞生存率突出增加。比较起来，用一种已知的神经保护物质——促红 细胞生成素(EP0)处理所述细胞后的细胞生存率是给定的。Y轴相对的(Rel.)细胞生存 (荧光素酶活力光单位)。图2A显示了特异于小鼠GCSFR的RT-PCR。在脑组织中检测出的GCSF-R RNA具有 期望的567bp大小。通过对PCR产物测序验证该鉴定。图2B显示了 GCSF受体存在于PC12 细胞上。图3具有代表性的GCSF-R免疫印迹。使用GCSF-R抗血清，在大鼠皮层中约130kDa 处检测到条带(泳道1)。另外的低分子量条带最有可能反映了产物的断裂。在抗血清与各自肽预吸收后，没有条带能被检测到(泳道2)。图4免疫组化显示了 GSCF受体在小鼠不同脑区域(石蜡切片，2i!m)中的分布。 a-d 海马中GCSF-R的定位。注意抗体主要染色了 CA3区域中的神经元(a. b)，在CA3和CA2 区域具有光滑边界(c，箭头)。GCSF-R分布在体细胞和神经元突起上(b，箭头)。注意在齿 状回的门和基底细胞层中存在受体(d，箭头)。也在皮层区域检测到GCSF-受体，如实施例 所述的梨状皮层(e)和鼻周皮层(f)。在小脑中，标记了浦肯野细胞(g，箭头)。同样，嗅 球中一些大僧帽细胞是GCSF-R阳性的(h，箭头)。在脊髓前索中展示了强染色(i，j)，通 过高倍放大鉴定了大运动神经元为GCSF-R阳性(k，1)。注意到神经元突起被强标记。在 中脑中，黑质神经元显示了 GCSF-R阳性(m)。特别是，黑质密部(SNC)所有神经元都被标 记(m和n中箭头)。也同样，在网质部中，一些神经元表达GCSF-R(o)。除神经元外，白质 束少突胶质细胞也被染色，例如，在前连合(P，箭头)中。令人惊奇的是，GCSF配体(抗体 scl3102, Santa Cruz)的染色与其受体(抗体sc694，Santa Cruz)的表达共区域化的(图 4q-u)。证明了神经元自身内分泌机制作为一种保护性手段对抗伤害性刺激。在海马中，观 察到针对GCSF配体的相同子区域特异性(q :GCSFR, r :GCSF，箭头指向子区域CA 2-3间边 界，ca3和ca2标记指出了该子区域)。该特异性与已知的这些区域抗局部缺血损伤的易感 性差异一致，并再次证明了 GCSF系统神经保护作用。同样，在齿状回的门和颗粒下层中，观 察到了同样感兴趣的表达谱(图4s，GCSF受体；图4t，GCSF;箭头指向颗粒下层中一个神 经元，标记s 齿状回的颗粒下层，h 齿状回的门)，其强调了 GCSF系统对神经发生的重要 性，漂亮地类似于神经球上受体和配体的表达(参见图13)。感兴趣的是，GCSF也在脊髓的 大运动神经元中表达(图4u)，其受体也在那里表达(图4i-l)。图5显示了对皮层(a，b)及海马培养的神经元(c，d)上GCSFR的染色。在体细胞 和神经元突起上都存在该受体。并不是所有载玻片上的神经元都被标记。抗体与各自肽预 温育，或省略一级抗体时，将无法产生特异性染色(未显示)。图6和7显示了使用抗STAT3抗体所获得的免疫组化结果。图6 :STAT3免疫组化。 注意，相比较安慰剂处理的动物皮层梗塞周围区域(a，箭头；左梗塞；右半影；最初放大 倍率x 200)，GCSF处理的大鼠皮层半影中许多神经元细胞核是阳性染色(b，箭头)。图7: 在GCSF处理的动物和对照动物中，对梗塞形成(IL)附近未受影响的对侧(CL)和同侧皮层 神经元定量。通过计数具有STAT3核易位的神经元定量，在GCSF处理组中梗塞形成附近神 经元中存在STAT3明显激活(p < 0. 05，t检验)。图8显示了在脑缺血的光诱导血栓形成孟加拉玫瑰红模型中GCSF处理的效果。A， 旋转行为；B，神经学得分，包括beam平衡；C，D 胶带移除测试，在同侧(C)和对侧⑶上 测定。图例局部缺血大鼠局部缺血组，未处理；局部缺血+GCSF 用GCSF处理的大鼠局 部缺血组；模拟手术(sham)+GCSF 模拟手术动物，用GCSF处理；sham 模拟手术动物，未处 理。L:对左爪的胶带移除测试；R:对右爪的胶带移除测试。注意在胶带移除测试(C，D)中 两侧都有影响，当胶带位于工作侧时，可能是显性运动缺陷所致，以及当胶带位于对侧时， 为显性传感缺陷所致。图9显示了在孟加拉玫瑰红模型中，在光诱导血栓形成诱导了对侧局部缺血48小 时后，GCSF-受体的上调。A，大鼠脑冠状缝切面图解，相较于来自模拟手术大鼠相同的组织 样本，在组织样本3和4中定量GCSF受体mRNA。B，在皮层半影样本(来自A的样本3和
104)中定量GCSF受体mRNA。在局部缺血诱导6小时后，工作侧出现了上调；接着在梗塞48 小时后，对侧出现上调。该对侧上调也见于GMCSF受体(见下)。图10显示了来自不同物种的GCSF的序列比对，使用了 ClustalW算法(SEQ ID NOS 28-33) (MEGALIGN , Lasergene, Wisconsin)。图11显示了小鼠和人GCSF受体及大鼠GCSF受体片段的序列比对，使用了 ClustalW 算法(SEQ ID NOS :34_36) (MEGALIGN , Lasergene, Wisconsin)。图12通过RT_PCR(逆转录PCR)证实了在成体神经元干细胞(nsc)上存在GCSF 受体。所显示的是琼脂糖凝胶。泳道1:分子量标记；泳道2:来自神经元干细胞(nsc)的 PCR产物，可见大鼠GCSFR特异性条带(279bp)；泳道3:阴性对照。图13证实了在神经干细胞上存在GCSF受体和GCSF。A.神经球的DAPI染色，在 所有细胞中均可见，B.用抗GCSF受体的抗体进行相同的神经球染色，C.D.用DAPI (C)和 GCSF抗体(D)的神经球染色。图14证实了在向小鼠腹膜内注射后，生物素化GCSF快速吸收。A.来自在注射 7. 5yg GCSF/小鼠后1、2、4、6、20、28小时处死的小鼠血清的蛋白质印迹。B.在腹腔注射 GCSF后，血清的ELISA。GCSF从腹膜快速吸收，在2小时处具有血清峰值水平，证实了其给 药途径的适用性。图15显示了在局部缺血的同侧和对侧上，在光诱导血栓形成(孟加拉玫瑰红模 型)后，证实GMCSF受体的上调mRNA。A显示了示意性的小鼠脑冠状缝切面，感兴趣区域用 灰色标记；B显示了 RMDD凝胶切片，鉴定了 GMCSF受体转录物正受调节。泳道代表小鼠脑 RNA样品上的RT-PCR产物。样品取自在中风后不同时间点的皮层半影(分别为A中的3和 4)。图16显示了通过应用LightCycler系统的RT-PCR验证GMCSF受体在孟加拉玫瑰 红模型中48小时处的上调。样品取自光诱导血栓形成后6小时、48小时和21天，并与模拟 手术动物诱导水平进行比较。在同侧半球上，在皮层局部缺血初期GMCSF受体上调最大并 稳定下降直至第21天。在相应的对侧皮层样品上，在梗塞2天后很明显上调最多，其仍然 适度地下调直至第21天。该对侧调节图使人联想到GCSF受体(见前)。图17显示了人、小鼠GMCSF受体和鉴定为上调转录物的大鼠序列的序列比对(SEQ ID NOS :22、23 禾口 24) (ClustalW 算法，MEGALIGN , Lasergene, Wisconsin。从该同源性结 果推断出所鉴定的序列是大鼠GMCSF受体。图18显示了人、小鼠和大鼠GMCSF的序列比对(SEQ ID NOS :25、26和27) (ClustalW 算法，MEGALIGN , Lasergene, Wisconsin)。图19免疫组化显示了 GMCSF受体α (a-d)和GMCSF (e_g)在小鼠不同脑区域(石 蜡切片，2μπι)中分布，a:在小脑中，标记了浦肯野细胞(箭头)。b-d:海马中GMCSF受体 α定位。注意在齿状回的门中存在该受体(b，箭头)。抗体主要地染色了 CA3区(c)中 的神经元，在CA3和CA2区之间具有的光滑边界(c，箭头)。GMCSF受体α分布在体细胞 (CA3)和神经元(CA2)突起上。也在内嗅区皮层(d)中检测到GMCSF受体。GMCSF显示与 GMCSF受体α相似的分布。注意GMCSF抗体也染色浦肯野细胞(e，箭头)，CA3区中神经元 (f)，在CA3和CA2区之间具有的光滑边界(f，箭头)和内嗅区皮层神经元(g)。图19h-m 显示了于此令人惊奇的神经元中GMCSF受体及其配体的共区域化。h. GMCSF受体(抗体
11sc690, SantaCruz)在海马子区CA3神经元中的定位，箭头指向邻接CA2区的光滑表达边界。 i.GMCSF配体(抗体SC13101)显示了相同的子区表达特异性，箭头指向CA3区中的神经 元。j.齿状回的门和颗粒下层中GMCSF受体的表达。箭头指向颗粒下层神经元。k.在该 区域中GMCSF配体的表达。在这里，配体显示了与其受体略有不同的表达。在CA3区中具 有明显的表达(箭头)，但在齿状回区中很少表达。l，m:GMCSF受体⑴和配体(m)在脊髓 大运动神经元中表达。该令人惊奇的表达清楚地指出GMCSF系统用于运动神经元疾病的治 疗适用性，特别是对于肌萎缩性侧索硬化(ALS)。图20显示了对神经元皮层培养物上GMCSF受体a的染色。该受体在体细胞和神 经元突起上都存在(通过用抗核表位NeuN的抗体和抗突触素抗体双标记进行验证，其不包 括在该图中)。将抗体与各自肽预温育，或省略一级抗体不会产生特异性染色(未显示)。图21通过RT-PCR证实了在成体神经元干细胞(nsc)和PC12细胞(PC12)上存在 GMCSF受体a。所示的是琼脂糖凝胶。泳道1 分子量标记(M)；泳道2 对神经元干细胞 (nsc)PCR ；泳道3 对PC12细胞(PC12)PCR ；泳道4 阴性对照(neg)。在泳道2和3可见大 鼠GM-CSF受体a特异性条带(176bp)。图22通过免疫细胞化学证实了在成体神经元干细胞(nsc)上存在GMCSF受体a。 所显示的是一种用DAPI染色的神经球(A.染色所有细胞核)，及特异于GMCSF受体的抗体 ⑶(放大倍率10x)。图23证实了体外GMCSF有效的神经保护作用。在H202 (0 u M、400 u M、750 u M)诱导 增加的氧化应激条件下，在NGF处理的PC12细胞中进行细胞生存测定。GMCSF处理后细胞 生存产生惊人增加。相比较，给出了用一种特定的已知神经保护物质促红细胞生成素(EP0 ； 0. 5U/ml)处理后细胞生存情况Y-轴相对细胞生存(荧光素酶活性光单位)。图24显示了与未给予G-CSF相比(对照)当在局部缺血发作后120分钟，由静脉 内给予G-CSF对大鼠MAC0模型梗塞体积的效果。图25显示了在海马和皮层中对G-CSF受体和G-CSF进行TTC-染色。数据显示在 海马(a_c齿状回，d-f门)和皮层(g-i)中，GCSF受体(a，d，g)显示了与其配体(b，e, h) 的共区域化。图26显示了在海马的齿状回(a-c)、门(d_f)以及皮层(g_i)中，G-CSF和GM-CSF 受体共表达于神经元上。在海马和皮层(c，f，i)中GCSF受体(a，d，g)和GMCSF受体(b， e,h)在相同的神经元上表达。图27显示了神经元中G-CSF通过激活stat3具有抗细胞凋亡活性。图28 (部分I和部分II) A在同侧和对侧局灶性缺血2和6小时后，GCSF显示了 十分强的上调，而6小时后受体则适度调节(B)，诱导的GCSF表达并不特异于MCA0模型，但 在全脑缺血中可见，尽管程度较小(C)。图29显示了梗塞半影中的G-CSF及其受体(孟加拉玫瑰红)。图30显示了 GCSF受体(a，d，g)和双皮质激素(b，e, h)在海马齿状回(a_f)和 门(g-i)的神经元上表达。图31显示了在GCSF处理4天后，神经元标记物NSE和0 III-微管蛋白强烈和浓 度依赖性的上调。依赖于GCSF-浓度，PLP和GFAP适度调节。误差条显示了标准差，计算 了 3倍连续稀释的cDNA样品，反映了测量的可靠性。
图32显示了在脑中GMCSF及其受体的共区域化。GMCSF受体(a，d，g)和GMCSF(b， e,h)在齿状回(a-c)、门(d-f)和皮层(g-i)的神经元上共区域化。图33显示了通过脑缺血上调GMCSF及其受体。图34显示了 GMCSF受体(a，d，g)和双皮质激素(b，e, h)在海马的齿状回(a_c) 和门(d-i)的神经元上表达。图35显示了神经干细胞分化潜能和分化细胞的特异性标记物表达，以及用10mg/ ml GMCSF处理神经干细胞引起0 III-微管蛋白显著的诱导表达(n = 3 ;p < 0. 05，双侧t 检验)并导致更低程度的NSE，一种用于成熟神经元的标记物(B)。图36显示了 G-CSF通过血脑屏障(BBB)。图37显示了 GM-CSF通过血脑屏障(BBB)。图38显示了 G-CSF用于治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)的功效。图39显示了在啮齿动物帕金森氏症(PD)模型中GSR；的功效。图40显示了在神经元中GMCSF通过激活stat3途径产生抗细胞凋亡活性，部分I 显示了 GMCSF抑制PARP裂解，该裂解是细胞凋亡中特异性发生的。通过使用NO-供体N0R-3 在初级神经元中诱导了细胞死亡。部分II显示了 GMCSF并不导致增加的STAT1 (“pSTATl”) 或STAT5(“pSTAT5”)磷酸化，尽管该蛋白自身在神经元中有表达。部分III A显示了 GMCSF 导致STAT3时间依赖性激活，在GMCSF刺激后5分钟达到最大。B,三个独立试验的量化。C， 通过磷酸化激活的STAT3可为JAK2抑制剂AG490所抑制。部分IV显示了 GMCSF强烈诱导 stat3靶基因Bcl2和Bel XI表达。已知这些基因是抗细胞凋亡的。图41证实了在GMCSF处理的动物中，既在窗口早期(部分I)，也在3小时的窗口 晚期(部分II)，梗塞体积明显减小。
具体实施例方式GCSF众所周知粒细胞集落刺激因子(GCSF)是一种生长因子。可用于本文描述的发明 方法的GCSF是那些已知并可获得的全长编码序列、蛋白质序列和多种功能变体、突变蛋白 及模拟物。在如下讨论中，这些称为GCSF衍生物。编码DNA和蛋白质的结构以及用于重组生产哺乳动物多能性粒细胞集落刺激因 子的方法业已清楚(TO 87/01132 ；美国专利4，810，643)。例如，一些相应于G-CSF的氨基 酸序列示于图10和序列表中，即SEQID N0S :28、29、30、31、32和33。在一个实施方案中，与此处描述的全长人GCSF氨基酸序列具有至少70%，优选至 少80%，更优选至少90%的同一性的蛋白质可用于本发明，如SEQ ID N0:28。在另一个实 施方案中，所述可被使用的GCSF由是那些与野生型全长人GCSF编码序列具有至少70 %， 优选80%，更优选至少90%、95%和97%的同一性的多核苷酸序列，如编码SEQ ID NO 28 的多核苷酸所编码的，这些多核苷酸可在严格条件下与编码野生型全长人GCSF的多核苷 酸序列杂交。术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括在多核苷酸与其靶序列杂交下所 涉及的条件，较与其他序列杂交具更高的可检测程度(如，至少超过背景2倍)。严格条 件可以是那些在PH 7. 0-8. 3及对于短探针(如，10-50个核苷酸)温度为至少约30°C和 对于长探针(如，多于50个核苷酸)温度为至少约60°C下，其中盐浓度低于约1. 5M钠离子，通常约0.01-1. OM钠离子浓度(或其他盐)的条件。例如，高严格条件包括于37°C在 50%甲酰胺、IM NaCl、l% SDS中杂交，并于60-65°C在0. IX SSC中洗涤(参见Tijssen， Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology__Hybridization with nucleic Probes, Part I, Chapter 2 “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicprobe assays，，，Elsevier, New York(1993)；禾口 Current Protocols inMolecular Biology,Chapter 2, Ausubel,等·，编·，Greene Publishingand ffiley-Interscience, New York(1995))。氨基酸和多核苷酸同一性、同源性和/或相似性 的测定可使用 ClustalW 算法(MEGALIGN ，Lasergene, Wisconsin)。多种GCSF功能变体、突变蛋白和模拟物的实例包括功能片段和变体(如， 结构和生物学上类似于野生型蛋白质的和具有至少一个生物学上等价结构域的)、 GCSF的化学衍生物(如，包含额外化学部分的，例如聚乙二醇和其聚乙二醇衍生物， 和/或诸如Lenogastrim 的糖基化形式)和GCSF的肽模拟物(如，在结构和/或 功能上模拟肽的低分子量化合物(参见，如，Abell, Advances in Amino Mimetics andPeptidomimetics, London JAI Press (1997) ；Gante, Peptidrraimetica-massgesch neiderte Enzyminhibitoren Angew. Chem. 106 1780-1802(1994)和 Olson 等.,Τ. Med. Chem. 36 :3039_3049(1993))。GCSF衍生物的额外实例包括白蛋白和GCSF的融合蛋白(Albugranin )，或诸如 那些描述于美国专利6261250号的融合修饰物；PEG-GCSF缀合物和其他的聚乙二醇化形 式那胜描述于 W000/44785 和 Viens 等.，J :of Clin. Oncology, VI.，Nr. 1,2002 24-36 的；GCSF的正亮氨酸类似物，那些描述于美国专利5，599，690号的；GCSF模拟物，诸如那 些描述于 WO 99/61445、WO 99/61446 和 Tian 等·，Science, Vol. 281，1998 :257_259 的； GCSF突变蛋白，其中一个或多个氨基酸已被修饰、缺失或插入，如美国专利5，214，132号和 5，218，092号所描述；那些描述于美国专利6，261，550号和4，810，643号的GCSF衍生物；以 及嵌合分子，其包含全长或部分GCSF和其他序列片段，如来可司亭(Leridistim)-参见， 例如，Streeter,等.(2001)Exp. Hemato. ,29,41-50, Monahan.等.(2001)Exp. Hematol.， 29,416-24.，Hood,等.(2001)Biochemistry,40,13598-606, Farese 等.(2001)Stem Cells, 19,514-21, Farese.等.(2001) Stem Cells, 19, 522-33, MacVittie,等.(2000) Blood, 95，837-45。此外，GCSF衍生物包括那些在第17、36、42、64和74位具有半胱氨酸 的具有174个氨基酸的种类(SEQ ID NO :37)或具有175个氨基酸的那些，额外的氨基酸 是N-末端甲硫氨酸(SEQ IDNO 38)为其他氨基酸所取代的，(诸如丝氨酸)，如美国专 利6，004，548所描述的，在第1位(N-末端)具有丙氨酸的GCSF ；如EP 0 335 423所述 具有GCSF活性的但在多肽中至少一个氨基基团被修饰的；如EPO 272 703所述的在蛋白 的N-末端具有氨基酸取代或缺失的GCSF衍生物；如EP 0 459 630所述的具有天然存在 GCSF的至少一种生物学特性的天然存在的GCSF衍生物，其在5mg/ml下溶液稳定度至少为 35%，所述衍生物中，至少天然序列的Cys17为Ser17残基所取代，天然序列的Asp27为Ser27 残基所取代；如EP 0 459 630所述一种修饰的编码GCSF的DNA序列，其中N-末端被修饰 用于增强蛋白在重组宿主细胞中的表达，而不改变蛋白的氨基酸序列；如EP 0 243 153所 述一种通过对至少一个酵母KEX2蛋白酶加工位点失活而修饰的GCSF用于增加使用酵母的 重组产物的产率；如美国专利号4，904，584所述赖氨酸改变的蛋白质；如TO/9012874 (US5，166，322)所述半胱氨酸改变的蛋白质变体；如AU-A-10948/92所述向GCSF分子任一末 端添加氨基酸用于帮助分子在原核表达后折叠；如AU-A-76380/91所述在GCSF的第50-56 位 Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile(SEQ ID NO 11)序列用 174 个氨基酸取代(SEQ ID NO: 37)，在GCSF的第53-59位用177个氨基酸取代(SEQ ID NO :39)，或/和在成熟GCSF的四 个组氨酸残基位置43、79、156和170至少之一用174个氨基酸取代(SEQID N0:37)，或在 成熟 GCSF 的位置 46、82、159 或 173 用 177 个氨基酸(SEQ ID NO 39)；如 GB 2 213 821 所 述以及将合成的GCSF-编码核酸序列掺入限制性酶切位点以促进所选择区域的盒式诱变， 掺入侧面限制性酶切位点以促进将该基因整合入期望的表达系统。G-CSF类似物的更多实 例包括SEQ ID N0S:64和65，以及其他描述于美国专利号6，632，426中的。上述内容在此 并入作为参考。所述各种GCSF的功能衍生物、变体、突变蛋白和/或模拟物优选保留野生型哺乳 动物GCSF活性的至少20 %，优选50 %，更优选至少75 %和/或最优选至少90 %的生物活 性——生物活性的量包括 25%、30%、35%、40%、45%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%, 95% ；以及所有它们之间的所有值和子区间。此外，相对于野生型哺乳动物GCSF活 性，所述功能衍生物、变体、突变蛋白和/或GCSF模拟物也可具有100%或更高的生物活 性——生物活性的量包括至少105%、至少110%、至少125%、至少150%和至少200%。一些已知测定法可单独或结合用于测定GCSF生物活性。一个测定GCSF功能的 实例阐述于实施例1中。其他用于测定GCSF功能的方法也是已知的，包括使用鼠骨髓 细胞的集落形成测定法；通过G-CSF诱导的骨髓细胞的增殖刺激；基于G-CSF生长或依 赖于 GCSF 的细胞系(如 AML-193、32D、BaF3、GNFS-60、HL-60、MI、NFS-60、OCI/AMLla 和 WEHI-3B)的特异性生物测定法。这些及其他测定法描述于Braman等.Am. J Hematology 39:194-201 (1992) ;CloRston CL 等 Anal Biochem 202:375-83(1992) ;Hattori K 等 Blood 75 1228-33 (1990) ;Kuwabara T^.Journal of Pharmacobiodyn 15:121—9(1992)； Motoiima H 等 Journal of Immunological Methods 118:187-92(1989); Sallerfors B 禾口 Olofsson European Journal of Haematology 49 199-207(1992) :Shorter SC 等 Immunology 75 468-74 (1992) ；Tanaka H 禾口 Kaneko Journal of Pharmacobiodyn. 15 359-66(1992) ;Tie F 等 Journal of Immunological Methods 149 115-20(1992)； ffatanabe M 等 Anal. Biochem. 195 :38_44(1991)中。在一个实施方案中，所述GCSF被修饰或设计，或作为GCSF模拟物，以增加其通过 血脑屏障的能力，或改变其在脑组织中的分配系数。上述修饰的一个实例是添加PTD或 TAT 序列(Cao 等.(2002) J. Neurosci. 22 :5423_5431 ；Mi 等 (2000)Mol. Ther. 2 :339_347 ； Morris 等.(2001)Nat Biotechnol 19 1173-1176 ；Park 等,(2002)J Gen Virol83 1173-1181)。也可使用这些序列的突变形式，并在蛋白质氨基或羧基末端添加额外的氨基 酸。除此之外，将缓激肽或类似物添加到任何静脉内施用的GCSF制备物中将有助于其递 送至脑或脊髓(Emerich 等.(2001)Clin Pharmacokinet 40 105-123 ;SieRal 等(2002) CIinPharmacokinet 41:171—186)。GM-CSF众所周知，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)是一种生长因子(参见，如图 18、SEQ ID N0S :25、26和27)。此处描述的可用于本发明方法中的GMCSF是那些全长编码序列、蛋白质序列和各种功能变体、嵌合蛋白、突变蛋白及已知并可获得的模拟物，例如聚 乙二醇化形式或白蛋白偶联形式。编码DNA和蛋白质的结构和用于重组生产哺乳动物多能 性粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的方法是已知的(美国专利5，641，663)。所述GMCSF受体 也已知并描述于，例如，美国专利5，629，283中。在一个实施方案中，所述蛋白质与可应用于本发明中的全长人GMCSF氨基酸序列 具有至少70 %，优选至少80 %，更优选至少90 %同一性。在另一个实施方案中，所述可使 用的GMCSF是由那些与野生型全长人GMCSF编码序列具有至少70 %、优选80 %、更优选至 少90%、95%、97%和98%同一性的多核苷酸序列，如编码SEQ ID NO :25的多核苷酸所 编码的，这些多核苷酸可在严格条件下与野生型全长人GMCSF编码多核苷酸序列杂交。术 语“严格条件”或“严格杂交条件”涉及包括多核苷酸与其靶序列杂交的可检测程度远大 于其他序列(如，至少超过背景2倍)的条件。严格条件可以是那些在pH 7. 0-8. 3及对 于短探针(如，10-50个核苷酸)温度为至少约30°C，和对于长探针(如，多于50个核苷 酸)温度为至少约60°C下，其中盐浓度低于约1. 5M钠离子，通常约0. 01-1. OM钠离子浓 度(或其他盐)的条件。例如，高严格条件包括于37°C在50%甲酰胺、IM NaClU % SDS 中杂交，并于 60-65 °C 在 0. IX SSC 中洗涤(参见，Tiissen, Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with nucleticProbes, Part I, Chapter 2" Overview of principles of hybridization andthe strategy of nucleic probe assays " , Elsevier, New York(1993)；禾口 Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel,等.，编·，Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York (1995))。氨基酸和多核苷酸同一性、同源性和/或相似性的测定可使用ClustalW 算法(MEGALIGN ，Lasergene，Wisconsin)。多种GMCSF功能衍生物、变体、突变蛋白和/或模拟物优选保留至少20%、优选 50%、更优选至少75%，和/或最优选至少90%的野生型哺乳动物GMCSF生物活性，所述生 物活性的数量包括 25%,30%,35%,40%,45%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%, 95%和它们之间所有的值和子区间。此外，相对于野生型哺乳动物GMCSF活性，所述GMCSF 功能衍生物、变体、突变蛋白和/或模拟物也可具有100%或更高的生物活性，所述生物活 性的数量包括至少105%、至少110%、至少125%、至少150%和至少200%。GMCSF衍生物、更优选GMCSF-模拟物用于实施本发明，优选保留其神经元保护潜 力并也减少对白细胞的作用，因此减少了潜在的不利效应。GMCSF衍生物，优选GMCSF-模拟 物，可在体外神经保护测定法中受测试，如实施例17所描述。在该测定法中证明具有阳性 神经保护效果的物质可进一步测试其免疫调节活性。一些已知的测定法可单独或结合用于测定GMCSF的生物活性。那些GMCSF功能包 括其已知的免疫调节功能和与其在神经保护中所起作用相关的一种或多种功能。其他用于 测定GMCSF功能的方法包括，例如通过开发包含巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞和巨 核细胞的集落测定法；在使用细胞系的特异性生物测定法中，细胞系取决于它们在GM-CSF 存在下的生长能力或对该因子的应答(如，细胞系AML-193、B6SUt-A、BACl. 2F5、BCLl、Da、 FDCP1、GF-D8、GM/S0、IC_2、M07E、NFS-60、PT-18、TALL-103、TF-1、UT-7)。这些和其他测定 法描述于 Cebon J 等 Blood 72 1340-7 (1988) ;KatzenNA 等 European Cytokine Network 3:365-72(1992) Lewis CE 等 Journal of Immunological Methods 127:51-9(1990);
16Mortensen BT 等 Experimental Hematology 21 1366-70(1993) :0ez S 等 Experimental Hematology 18 :1108-11 (1990) :Roncaroli F 等 Tournal of Immunological Methods 158:191-6(1993) ;Sallerfors B 禾口 OlofssonEuropean Journal of Haematology 49: 199-207(1992) :Zenke G 等 Tournal of Immunoassay 12 185-206 (1991)中。也优选的是GMCSF的修饰或制剂，或能增加其通过血脑屏障能力的模拟物，或改 变其在脑组织中分配系数的模拟物。上述修饰物的一个实例是添加蛋白转导结构域(PTD) 或 TAT 序列(Cao G,等(2002)T Neurosci. 22 :5423_5431 ；Mi Z 等(2000)Mol. Ther. 2 339-347 ； Morris 等(2001)Nat Biotechnol 19 1173-1176 Park 等(2002)JGen Virol 83 :1173-1181)。这些序列也可在突变型中使用，将附加的氨基酸添加至蛋白的氨基或羧 基末端处。除此之外，向任何静脉内应用的GMCSF制备物中添加缓激肽或类似物质会有助 于将其递送至脑或脊髓(Emerich 等(2001)Clin Pharmacokinet 40:105-123 :Siegal 等 (2002)Clin Pharmacokinet 41:171-186)。不同适合形式和衍生物的实例是沙格司亭( Leukine ; Prokine w), Leucotropin 或莫拉司亭(Leucomax ).业已在分离的小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元中检测到 GMCSFR mRNA(Sawada,等.(1993), Neurosci Lett，160，131-4) :Baldwin,等 (1993)， Blood，82，3279-82)。业已显示GMCSF刺激星形胶质细胞增殖(Guillemin,等.(1996)， Glia，16，71-80)。GMCSF也诱导来自小胶质细胞的白介素6的释放(Suzumura,等.(1996)， Brain Res，713，192-8)。近来，有出版物显示了白介素1能增加神经元细胞系NT2中GMCSF 蛋白产量(Dame，等.(2002)，Eur Cytokine Netw，13，128-33)。在来自人胎儿的材料中， 对胎儿中GMCSF受体表达进行的全面搜索显示了 GMCSFR在脑中存在(Dame!. (1999)， Pediatr Res，46，358-66)。Dame等从他们的发现中推断，GMCSF在胎儿神经发育中可起作 用，并在成人脑中起免疫监视作用。重要的是，他们并没有提及任何可能相关的疾病，特别 是没有涉及神经保护作用。GMCSF在体外增加胆碱乙酰基转移酶活性(SN6. 10. 2. 2细胞系 和培养的小鼠中隔神经元)以及在体内增加伞-穹隆切断后大鼠胆碱能中隔神经元损害的 生存率(Kamegai，等.(1990), Brain Res，532，323-5.) (Konishi.等.(1993), Brain Res, 609，29-35)。重要的是，该发现仅适合某一亚型的神经元，根据作者描述并不能推广用于其 他类型神经元或神经细胞。从这些数据中，他们并没有推出GMCSF的普遍神经保护特性，也 没有提及任何可能的治疗适用性。在星形胶质细胞中添加高级糖基化终末产物(AGEs)后， GMCSF上调(Li，等.(1998)，Mol Med，4，46-60)。业已显示了 GMCSF能促进小胶质细胞体 外增殖(Lee，等.(1994)，Glia，12，309-18)。近来，业已发现在患阿尔茨海默氏病的患者脑 脊液(csf)中 GMCSF 水平提高(Tarkowski，等.(2001)，Acta Neurol Scand, 103，166-74)。 也已在中风患者的 GSF 中研究了 GMCSF(Tarkowski，等.(1999)，Stroke，30，321-7.)。在稍 后的研究中，FAS配体和细胞凋亡前蛋白水平与在21-26天和迟至3个月的中风患者脑脊 液中GMCSF水平正相关。但是，没有结论给出在中风患者中所发现的上述结果的任何治疗 用途，且也没有提及GMCSF任何可能的神经饱和作用。在中风后自身所释放的GMCSF可能 有许多原因，无法允许进行任何功能性的预测。GMCSF能通过血脑屏障(McLay，等.(1997)， Brain, 120，2083-91.)。该研究并没有以显示任何GMCSF对神经系统疾病的治疗适用性的 目的来进行，且其在上下文中亦没有提及GMCSF在神经变性疾病或中风中的可能作用。总而言之，上述提及的参考文献所提供了 GMCSF受体和配体在神经系统中存在的
17证据，但没有显示GMCSF任何常规的神经保护特性。这些研究当然不能暗示GMCSF在治疗 神经变性和诸如中风的局部缺血病症中的应用。其他造血生长因子在本发明另一个实施方案中，可使用支持其治疗作用，优选其神经保护作用的 GMCF和/或GMCSF制备物的组合物。由这些组合物所产生的效力可累加、超累加/协同。 在一个实施方案中，各种GCSF和/或GMCSF衍生物彼此结合使用。同样地，GCSF和/或 GMCSF可与一种或多种诸如促红细胞生成素及其衍生物的额外造血生长因子结合使用，近 来业已显示了上沭结合能介导强的神经保护特件(如，Brines等(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97 10526-10531 Cerami 等(2002) Nephrol Dial Transplant 17 8~12 :Siren AL,Ehrenreich H(2001)EurArch Psychiatry Clin Neurosci 251 :179-184.)。此外，GMCSF 和/或GCSF可与下列物质结合使用，例如，各种集落刺激因子(如M-CSF)、SCF(干细胞 因子)、SCPF(干细胞增殖因子)、各种白介素(IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、ILlU IL12)、LIF、 TGF-β、MIP-I-α、TNF-α以及许多其他低分子量因子。在另一个实施方案中，除了促红细胞生成素外的多种造血生长因子可在缺少 GMCSF和/或GCSF条件下单独使用。在另一个实施方案中，例如，在上下文的中风中，GCSF 和/或GMCSF可与具有溶栓活性的物质结合使用，如组织纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)、链 激酶、尿激酶和/或蝮蛇抗栓酶(Ancrod)。GCSF和/或GMCSF也可与乙酰水杨酸(阿司匹 林)或肝素、褪黑激素和/或干扰细胞凋亡信号的物质(如半胱天冬酶抑制剂)结合使用。 除此之外，特别是，但不限于，在治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)中，GCSF和/或GMCSF也可 与科鲁唑(Riluzole) (Rilutek ),诸如维生素Ε、QlO的维生素或抗氧化物质结合使 用。对于治疗帕金森氏症而言，GCSF和/或GMCSF可与已知用于治疗帕金森氏症的药物结 合使用，所述药物例如苯海索(Trihexyphenidyl)、司来吉兰(Selegiline)、L-D0PA、培高 利特(Pergolide)及其他可用药物。其他可与诸如G-CSF和/或GM-CSF的造血生长因子 结合使用的物质，包括bFGF、抗-GPIIb/lia、抗-ICAM、氧化氮抑制剂、溶栓剂、旋转异构酶 抑制剂、神经钙蛋白抑制剂和环孢菌素。此外，当治疗神经变性障碍时，也包括给予一种或 多种影响神经递质水平的试剂。此外，当治疗认知病症时，也可给予一种或多种胆碱能剂、 儿茶酚胺再摄取抑制剂等。与现有的抗抑郁药结合使用可有利于，如治疗个体抑郁症。抗抑郁药的非限制性 实例包括SSRI ‘ s (选择性5-羟色胺再摄取抑制剂、Paxil (帕罗西汀)>Prozac (氟西汀)、 Zoloft (舍曲林)、Celexa (西酞普兰)、Lexapro (依他普仑草酸盐)、Luvox (氟伏沙明)、 MOAI ‘ s (单胺氧化酶抑制剂)、Nardil (苯乙胼)、Parnate (强内心百乐明)、TCA' s (三环 抗抑郁药)、Adapin (多虑平),Anafranil (氯米帕明)、Elavil (阿米替林)>Endep (阿米替 林),Ludiomil (马普替林),Norpramin (地昔帕明),Pamelor (去甲替林),Pertofrane (地 昔帕明)、Sinequan (多虑平)、Surmontil (曲米帕明)、Tofranil (丙米嗪)、Vivactil (普 罗替林)或其他类型药物=EfTexor (文拉法辛)、Cymbalta(度洛西汀)、DesyreK曲唑 酮)、Buspar ( 丁螺环酮)、Edronax (瑞波西汀)、Vestra (瑞波西汀)、Remeron (米氮平)、 Serzone (奈法唑酮)、Wellbutrin ( 丁氨苯丙酮)。神经系统疾病根据本发明要被治疗的神经系统疾病可通常分为三类具有局部缺血或缺氧机制的那些疾病、神经变性疾病(参见Adams等，Principlesof Neurology, 1997，第6版 ，New York，pp 1048ff)以及与神经细胞死亡相关的神经系统疾病和精神病。根据本发明可被治 疗的其他神经系统疾病也包括增强认知能力和治疗脑肿瘤，例如成胶质细胞瘤、星形细胞 瘤、脑膜瘤及神经细胞瘤。具有局部缺血或缺氧机制的疾病可进一步分为金身病和脑缺血。上述涉及局部缺 血或缺氧机制的全身病的实例包括心肌梗塞、心机能不全、心肌衰竭、充血性心力衰竭、心 肌炎、心包炎、心包心肌炎、冠心病(冠状动脉狭窄)、心绞痛、先天性心脏病、休克、末端局 部缺血、肾动脉狭窄、糖尿病性视网膜病、与疟疾相关的血栓症、人工心脏瓣膜、贫血症、脾 功能亢进、肺气肿、肺纤维化及肺水肿。脑缺血疾病的实例包括中风(及出血性中风)、大脑 微血管病(小血管病)、产时脑缺血、心脏停搏或复苏期间/后的脑缺血、由于手术中问题的 脑缺血、在颈动脉外科手术过程中的脑缺血、用由于脑部供血动脉狭窄、静脉窦血栓形成或 脑静脉血栓形成的慢性脑缺血、大脑血管畸形及糖尿病性视网膜病。神经变性疾病的实例包括肌萎缩性侧索硬化(ALS)、帕金森氏症、亨延顿 (氏)舞蹈病、威尔逊(氏)病、多系统萎缩、阿尔茨海默氏病、皮克(氏)病、路易士 体病、哈勒沃登-施帕茨病、变形性肌张力不全、遗传性感觉运动神经病变(HMSN)、 Gerstmann-Strauss 1 er-Schanker病、克-雅氏病、马-约病、弗里德赖希共济失调、非弗里 德赖希共济失调、日勒德拉图雷特综合征、家族性震颤、橄榄体脑桥小脑变性、类肿瘤性大 脑综合征、遗传性痉挛性截瘫、遗传性视神经病(Leber)、视网膜色素变性、眼底黄色斑点 症，及卡恩斯-塞尔综合征。与神经细胞死亡相关的神经系统疾病和精神病的实例包括感染性休克、大脑内出 血、蛛网膜下出血、多梗塞痴呆、炎性疾病(诸如血管炎、多发性硬化症和格-巴二氏综合 征)、神经外伤(诸如脊髓外伤和脑外伤)、周围神经病变、多发性神经病、癫痫、精神分裂 症、抑郁症、代谢性脑病及中枢神经系统感染(病毒、细菌、真菌)。“治疗”指减缓、中断、抑制或停止疾病或病症的进展，并不需要完全消除所有 疾病症状和征兆。“预防(Preventing)”意在包括神经系统疾病的预防，其中“预防 (prophylaxis)，，理解为在疾病或病症发作或具严重征兆或症状时所要被抑制的任何程度， 包括，但不限于，完全预防疾病或病症。因为在脊髓中大运动神经元上发现GCSF受体和GMCSF受体强表达(参见图 4i_l)，以及GCSF对局灶性脑缺血有效(参见图1)，其中及ALS和其他神经变性疾病中相 同的基本发病机制在起作用，例如谷氨酸盐受累、氧化应激和程序性细胞死亡，所以GCSF 特别适合于诸如ALS的慢性病症的长期治疗，因为当长期给药时，其在人体中耐受良好 (Ozer等.(2000)，J :Clin. Oncol.，18，3558-85)。因此，在本发明的一个实施方案中，诸如 GCSF和GMCSF的造血生长因子可单独使用或彼此结合使用，和/或与一种或多种可用于治 疗ALS的附加因子结合使用。与帕金森氏症相关的病理生理学，诸如氧化应激和细胞凋亡，也将帕金森氏症置 于其他神经变性障碍和中风之间。在H202引起的PC12细胞系细胞死亡过程中，GCSF其强有 力的神经保护作用(图lb)。PC12细胞具有多巴胺能细胞特征，例如存在功能性多巴胺转 运蛋白(Maruyama.等.(2001)，Arch Toxicol，75，209-13)，并作为体外模型用于研究帕金 森氏症的一些重要现象，例如MPTP代谢物MPP+的毒性(Bai等.(2002),Nezlrosci Lett,
19321，81-4)。H2O2是作用于PC12细胞的有害刺激物，其能明确地在PC12细胞中模拟帕金森 氏症的一些现象。例如，H2O2是MPTP-诱发细胞事件媒介物之一 (Fabre等1999.TPhySiol Biochem 55(4) :325_31))。值得注意的是细胞事件级联中的交迭和涉及MPTP-及H2O2介导 的多巴胺能神经元中细胞死亡的信号机制(Chun, HS,等·，JNeurochem 2001 Feb ；76 (4) 1010-21 Lai 等·，Biochem Pharmacol 1993Feb 24 ；45(4) :927_33)。H2O2 通过产生活性氧 簇(ROS)起作用，导致氧化应激和细胞凋亡。氧自由基的损害是帕金森氏症主要的病理生 理学事件之一 (Bonnet 和 Houeto (1999), Biomed Pharmacother, 53,117-21. ,Beal (2001), Nat Rev Neurosci, 2, 325-34),以及抗氧化疗法在患者中有效(Beal (2002), Free Radic Res, 36,455-60.，Shults，等.(2002) ,Arch Neurol, 59,1541-50)。因此，在H2O2 引发的PC12 细胞死亡，即一种用于预测在帕金森氏症(PD)中有效性的重要氧化应激和细胞凋亡病理 生理机制模型中，GCSF能起效。令人惊奇的是，证实了 GCSF受体在受帕金森氏症影响的区 域，即黑质(SN)表达，具体而言是黑质密部(SNC)(参见图4m-o)。在细胞模型中的功效、 受体体内定域化以及病理生理机制与脑缺血(氧自由基/细胞凋亡)的交迭提供了令人注 目的证据，表明GCSF和/或诸如GMCSF的其他生长因子可用于治疗帕金森氏症。可在啮齿 动物模型中进行功效测试，如实施例5所例证。因此，在本发明的另一个实施方案中，诸如 GCSF和GMCSF的造血生长因子可单独使用，彼此结合使用，和/或与一种或多种可用于治 疗帕金森氏症的附加因子结合使用。通过于此所包含的讨论，本发明人已经证明GCSF和GMCSF具有增强神经发生的能 力和改善局部缺血损伤后行为结果的能力。神经发生是一种能导致神经网络可塑性增加的 机制，并能逐渐取代神经元的损失。因此，本发明的一个实施方案是按照于此所讨论的给药 方案，通过给予个体一种或多种如本文所描述的组合物，以提供给患有、显示和/或据信在 某种程度上认知损失的个体，使之认知能力得到增强、改善或增加。在一个可选的实施方案 中，认知增强也可有助于那些个体，甚至在非病理条件下也有用处，如那些并没有表现处认 知缺损的个体。测定认知能力及因此增强为本领域技术人员所公知。在此测量增加或增强 的认知能力，并在给予本发明的组合物前及给予后(以及在某些实施方案中也可在给予过 程中进行测量)使用同样的测试方法以比较结果，如使用一些标准参数等。此外，根据本发明内容，组合物在认知增强中的用途不限于精神能量的非病理减 退，也可用提高正常认精神能量的生理学所有组成成分，例如记忆增强、精细运动协调的增 强和/或逻辑能力的增强。抑郁症具有悲伤、丧失活动兴趣和精力减少的特点。其他症状包括丧失信心和自 尊、不当内疚、死亡想法和自杀、注意力减少及睡眠和食欲紊乱。也出现了许多躯体症状。虽 然，抑郁情绪常见，特别是在生活经历挫折后，当症状达到阈值并持续至少两周后抑郁症才 被诊断。抑郁症严重程度可从中度到十分严重。虽然在中年时死亡率是最高的，但抑郁症可影响个体生命期内任何阶段。然而，在 青春期和青年期增加了对抑郁症的识别(Lewinsohn，等。(1993)，J Abnonn Psychol, 102, 110-20)。抑郁症本质上是一种插曲式的复发病症，每次发作通常持续几个月至几年，正常 的持续时间介于二者之间。但是，在约20%的病例中，抑郁症跟随着长期的病程，而无缓解 (Thornicroft 和 Sartorius (1993)，Psychol Med, 23,1023-32)，特别是当无法获得适当的 治疗时。对于那些从第一次发作痊愈过来的而言，2年内复发率在35%左右，在第12年复发率为约60%。在那些超过45岁的中间，复发率更高。抑郁症独特的悲剧性结果之一是自 杀。约15-20%的抑郁患者通过自杀结束自己的生命。自杀成为抑郁症常见和不可避免的 结果之一。总的来说，抑郁症是一种常见的精神障碍，导致非常高水平的疾病负担，预期在 就要来到的20年间具有上升趋势。抑郁症可不断地伤害患者(单级)或具有双相性(狂躁或双相性抑郁症)。双相 性抑郁症特征在于极端的心境不稳，从格外精神和情绪高涨的“高潮”到完全绝望和昏睡无 力的“低潮”。通常使用锂来治疗狂躁性抑郁症，其能使心境不稳恢复平静。所述抑郁症可以是一种季节性情感障碍(SAD)。其是抑郁症的一种类型，通常在快 到冬天、带来更长白天和更多日照的开始于9月持续到春天的时段发生。所述抑郁症可以是一种出生后抑郁症，其出现开始于出生后约2周，至多到2岁 时。业已尝试进行抑郁症严重程度的分类，如(Abdel-Khalek(2003), Psychol Rep, 93，544-60)确定了如下8种基础要素，即悲观、注意力差、睡眠不好、快感缺乏、疲劳、孤独、 自尊心低和身体疾病，来定义儿童和青春期抑郁症的类型。抑郁症可作为一种特发性疾病发生(没有与其相关的身体疾病)，或可以是一种 身体失调的精神症状，特别是许多的神经变性障碍。抑郁症(DDs)是时常发生的神经障碍 的精神并存病，所述神经障碍如同多发性硬化症、中风、痴呆、偏头痛、帕金森氏症和癫痫。 在这些神经障碍中DDs的临床表现与特发性心境障碍类似。神经变性障碍在最初显露该疾 病时，通常具有“典型的”精神症状。在上下文神经变性障碍中抑郁症的症状学可不同于抑 郁症自身。在某些神经变性障碍中，所具有的抑郁症状如下所列1.多发性硬化症2.外伤性脑损伤抑郁症也影响外伤性脑损伤(TBI)患者；30% -38%的TBI患者 可归类为抑郁的(Seel和Kreuzer 03)3.中风约30%的中风患者临床上表现为抑郁(Williams 86)4.痴呆和阿尔茨海默病5.偏头痛6.帕金森病约在一半的PD患者中出现抑郁症状，对于PD患者而言，是功能障碍 的主要诱因。有许多证据提出PD中抑郁症是继发的潜在神经解剖学恶化，更胜于对心理社 会应激和残疾的简单反应。抑郁症的发病率与中枢5-羟色胺能功能改变及特定皮层和亚 皮层通路的神经变性相关。对PD中同病性抑郁症的了解可进一步增加对抑郁症神经解剖 学基础的了解。7.癫痫癫痫是一种慢性病症，对社会、职业和心理功能具有复杂影响。业已显 示相对于普通人，在癫痫患者中一些精神障碍具有增加的患病率。抑郁症看来是最常见的 精神并存病，而焦虑症及其他诊断尚未广泛调查。然而，在癫痫中，抑郁症所出现的临床 特性常常与特发性抑郁症的那些特性不尽相同，且并不符合Diagnostic andStatistical Manual of Psychiatric Disorders第4版所包括的标准。一些研究已发现抑郁症或心理 苦恼可以是健康相关的生活质量、甚至包括是癫痫发作频率和严重程度、就业或驾驶体质 的最佳预报器(Gilliam，等.(2003)，Epil印sy Behav，4 Suppl 4，26-30)。据报道，临床上 抑郁的人士较没有抑郁的人士在类似的癫痫发作时，具有更高水平的认知严重性并为癫痫
21发作所烦恼，以及总体癫痫发作康复更为困难。据报道，抑郁症状的普遍影响是癫痫发作频 繁，暗示患癫痫人士应筛查抑郁症。这些数据突出了在患癫痫人士中间检测和治疗抑郁症 的重要性(Gilliam，Hecimovic 和 Sheline (2003)，Epikpsy Behav, 4 Suppl4，26-30)8.亨延顿(氏)舞蹈病亨延顿(氏)舞蹈病(HD)是一种神经变性过程，其征候 是人运动控制、认知和情绪稳定性的恶化。情绪不稳定通过多种症状得到反应，所述症状例 如人格改变、焦虑和兴奋增盛。在亨延顿(氏)舞蹈病(HD)中认知减退可处于运动症状出 现之前。抑郁症在HD中常见，也已经与认知缺损联系起来。情感低落及通过使用DNA突变 距离所评估的疾病发作时间，两者皆为重要的工作记忆能力的预测器。HD个体继发前的检 查结果与现有研究相一致，并有助于现有研究，确定对于认知减退(即情感低落)潜在的可 治疗方法(Nehl，等.(2001)，J Neuropsychiatry Clin Neurosci，13，342-6)。抑郁症状也 可出现相关的未列于此的其他身体疾病。最近，对抑郁症的发病机理研究业已得到新的令人激动的进展，暗示抑郁症与脑 结构中神经变性事件相关，并有可能缺乏海马结构中正确的成体神经发生。因此，于此所述 的造血生长因子，如G-CSF和/或GM-CSF，使用两者的抗细胞凋亡作用和促进再生作用(包 括刺激内源性成体神经干细胞)进行处理可用于治疗抑郁症。下列描述了与抑郁症的神经变性概念相关的研究(Kempermarm和 Kronenberg(2003)，Biol Psychiatry,54,499-503 的 平)。对抑郁症患者形态学改变的研究已经揭示了在海马中产生结构改变，包括灰质改 变(Sheline (2000)，Biol Psychiatry，48，791-800)。对早发性再发性抑郁症、伴随神经 系统障碍的晚期抑郁症及双相性疾病的研究已经揭示了在神经解剖学回路中结构性脑改 变。该回路已被命名为缘_皮层-纹状体_苍白球_丘脑束，由广泛互连的结构组成。在 情感疾病的三维磁共振成像研究中，业已发现许多包含该束的结构具有体积损失或结构异 常。建议用于解释抑郁症中体积损失的机制包括神经毒性导致的神经元损失、减少的神经 发生以及可塑性损失。可通过激活GCSF或GMCSF来治疗这些症状。一个可能的假说是在 成体海马神经发生过程中发生失调(Kempermann和Kronenberg (2003)，BiolPsychiatry, 54,499-503, Jacobs，·。 (2000)，Mol Psychiatry, 5, 262-9, Jacobs (2002), Brain Behav Immun，16，602-9)。因此，抑郁和其他心境障碍是‘干细胞障碍’。近来有研究对成体海 马神经发生如何进行调节提出了新观点。其中能有力抑制成体神经发生的因素之一是压 力，或许是由于增加的糖皮层激素释放(Jacobs，Praag和Gage (2000)，MolPsychiatry, 5, 262-9)。成体海马神经发生最初在1965年为Altman和Das所描述，并经历了一些重新发 现。更令人备感兴趣的现象首先是起于80年代早期的对金丝雀成体脑中活性相关的神经 发生的报告。用溴脱氧尿苷(BrdU)与共聚焦激光扫描显微镜法结合制备增殖的脑细胞，代 替了更麻烦的使用氚化胸腺嘧啶和放射自显影技术的方法，使得成体神经发生定量方法愈 加简单明了。该新细胞亚型存活，迁移入颗粒细胞层并分化进入神经元。与所有其他颗粒 细胞层中颗粒细胞一样，它们沿着苔状纤维束将轴突发射至CA3区，并事实上与周围衰老 细胞无法分辨。发现慢性抗抑郁药治疗能减缓成体神经发生的减少，因此强化了上述假说 (Benninghoff，等.(2002)， J Neural Transm，109，947-62， Dremencov,等.(2003)，Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,27,729-39, D ' Sa 禾口 Duman(2002)， Bipolar Disord，4，183-94，Duman，等.(2001)，J Pharmacol Exp Ther，299，401-7，Duman， 等.(1999)，Biol Psychiatry，46，1181-91)。因此，在本发明的另一个实施方案中，例如。通过给予被诱发抑郁或预期发展为抑 郁症的患者所述造血生长因子，如G-CSF和GM-CSF，可单独给予或与联合给予，或与本文所 描述的附加因子联合给予，可用于治疗抑郁和/或提供抑郁的预防性疗法。在一个实施方案中，抑郁可用具有更长血浆半衰期的GCSF和/或GMCSF配 方来治疗，如上文所描述的，例如聚乙二醇化形式(PEGfilgrastim)，白蛋白偶联形式 (albugranin)。治疗不限于特发性抑郁症，亦可用于继发性抑郁症和伴发性抑郁症。在另一 个实施方案中，所述治疗可提供每周一次的皮下注射，可与脑中GCSF或GMCSF受体的口服 激动剂联合施用。治疗剂量如上文所述，在一个优选的实施方案中，可为每日0. 1-1000 u g/ 公斤体重的GCSF或GMCSF。局部缺血中心周围类似的神经化学物质环境、损伤位置及改变 的基因转录提示采用类似的神经保护策略，针对有害机制进行干预，应当对脑缺血和外伤 性脑损伤有效。在两种类型损伤中该疗法的目的是在于将激活的毒性途径减到最小、增强 内源性神经保护机制的活性及在这些途径之间保持平衡，最终确定了处于危险的组织的命 运。实际上，发现更多的神经保护剂在中风实验模型中有效，其在外伤性脑损伤(TBI)实验 模型中也有效。根据常见的病理及现行的脑缺血和外伤性脑损伤的保护方法，以及通常响应的神 经保护策略，指出GCSF治疗对外伤性脑损伤将有效。在外伤性脑损伤情况下，已有研究在 分析 GCSF (Heard 等.(1998)，Crit. Care Med.，26，748-54)。但该研究并不针对 GCSF (非 格司亭)的任何神经保护效应，而仅减少了感染参数(该研究主要结果增加嗜中性细胞绝 对计数、非格司亭的安全性和，医院感染(肺炎、菌血症和尿路感染)的频度)。该研究并没 有使死亡率降低。在上下文的临床安全性中，该研究证明对于TBI给予GCSF是安全的，确 定了根据本发明具有神经保护作用的GCSF疗法的安全实用性。因此，在另一个本发明的实 施方案中，所述造血生长因子，例如GCSF和GMCSF，可单独或互相结合，和/或与一种或多种 其他附加因子结合可用于治疗脑缺血和外伤性脑损伤，例如，通过提供一种保护那些具有 损伤的患者中神经元细胞的预防性方法。因为在基于心肌衰竭和复苏的脑缺血中起作用的基本病理生理机制与那些在基 于血管闭塞的脑缺血下所发生的事件(参见实施例1)具有可比性，所以GCSF疗法也可在 心脏有问题的情况下起有效的神经保护作用。因此，在本发明的另一个实施方案中，所述造 血生长因子，例如GCSF和GMCSF可单独、彼此结合和/或与一种或多种可用于治疗局部缺 血的附加因子结合使用解决心脏问题/疾病，和/或提供预防性神经保护治疗。应急复苏 一开始就可进行治疗。或者，在属于心脏问题(在前的心肌梗塞、高血胆固醇水平、高血压、 糖尿病、吸烟)已知的危险组患者中，可使用诸如GCSF的造血生长因子进行预防性持续治 疗，如使用该因子的缓释剂型。同样地，将这些上述需要考虑的事项应用于经历了并发脑缺血的手术的大组患者 中。具体而言，心脏手术(HoRue等.(1999)，Circulation, 100,642-7)和对供给脑的大血 管手术(如，颈动脉内膜剥离术)具有与之相关的神经系统并发症的高风险。回顾性调查 了多伦多大学神经外科教学单位在1982年进行的358例颈动脉内膜剥离术的客观事实，
23证明了在手术期间中风率为3.9%，死亡率为1.5%。大多数(82% )神经外科手术并发症 在术后期(24小时)马上发生。该延迟的中风的高发病率暗示大多数手术期间的中风是 血栓性而非血液动力性。应当预计在颈动脉内膜剥离术中具有5-6%的发病率和死亡率 (Group (1986), Stroke，17，848-52)。这些和其他数据证明了在这些操作中确实需要预防 性神经保护疗法。因此，在本发明的另一个实施方案中，所述造血生长因子，例如GCSF和 GMCSF，可单独，彼此结合，和/或与一种或多种附加因子结合使用，可用于治疗外科手术诱 发的脑缺血所产生的局部缺血和/或提供预防性神经保护疗法。在一个实施方案中，在处 于危险的患者中，所述治疗在主要手术操作前就开始。在本发明的另一个实施方案中，所述造血生长因子，例如GCSF和GMCSF，可单独， 彼此结合，和/或与一种或多种附加因子结合使用，可用于治疗多发性硬化症(MS)和/或 在多发性硬化症患者中提供预防性神经保护疗法。该方法是基于少突胶质细胞上GCSF 受体的存在，支持了 GCSF对MS的初级靶细胞的直接效力。此外，神经细胞及其突起上 存在的GCSF受体，在疾病后期可危及安全，可能与持久的残疾相关(Cid.等.(2002)， J Neurol Sci，193，103-9)。事实上，最近对于多发性硬化症在治疗观念上产生了变化， 即从免疫调节变为神经保护作用，看来对于多发性硬化症的残疾结果而言，神经变性机 制是最重要的(Bo,等· (2003)，Mult Scler,9,323-31, Bjartmar,等· (2003)，JNeurol Sci，206，165-71，ffujek,等.(2002)，J Neuropathol Exp Neurol，61，23-32，Bjartmar, 等.(2001)， Neurology,57,1248-52, Peterson,等.(2001)， Ann Neurol,50,389-400, Bjartmar 禾口 Trapp(2001)， Curr OpinNeurol，14，271—8， Bjartmar,等.(2000)， Ann Neurol，48，893-901，Bjartmar，等·(1999)，J Neurocytol，28，383-95，Trapp，等·(1999)， CurrOpin Neurol，12，295-302，Trapp，等·(1998)，N Engl J Med，338，278-85，Neuhaus, 等· (2003)，Trends Pharmacol Sci，24，131-8，Pryce，等· (2003)，Brain, 126，2191-202， Waubant (2003), Expert Opin EmergDrugs,8,145-61, Graumann, 等.(2003), Brain Pathol，13，554-73，Golde，等.(2003) ,Eur J Neurosci，18，2527-37)。甚至在脑中显示正 常的区域都与显示神经变性征兆的白质改变相关。因此，在多发性硬化症中轴突病理和神 经变性是重要的治疗靶标。如本发明所示，GCSF和GMCSF在神经元中具有的抗细胞凋亡活 性和原再生(pro-regenerative)潜能(通过增加神经发生及可塑性)支持了将于此描述 的组合物用于治疗多发性硬化症的新疗法。此外，多发性硬化症中病理生理机制与脑缺血中重要机制交迭，如氧化亚氮 受累(Smith,等.(2001)，Ann Neurol,49,470-6)和谷氨酸盐兴奋性中毒受累(Pitt,
(2000), Nat Med, 6,67-70) 0根据该信息，对于多发性硬化症和炎性脑功能障碍而言， 诸如GCSF和GMCSF的造血生长因子是一种新的治疗选择。本发明的另一个实施方案涉及精神分裂症的神经保护治疗。近年来已有令人惊奇 的证据表明在精神分裂症患者中具有进行性的灰质损失。通过新的磁共振成像技术业已初 步提供了该证据。虽然精神分裂症中神经变性过程的分子水平尚不清楚，但在精神分裂症 中使用GCSF和/或GMCSF的神经保护治疗对于该疾病而言却是一种新的治疗方法。为测试诸如GCSF的造血生长因子保护初级神经元的效力，神经元可制备如下。 10-12只大鼠皮层可制备自El期的胚胎(胚胎第18日)。在HBSS(Hank氏平衡盐溶液， Bioffithakker)中使用胰蛋白酶[10 mg/ml]/EDTA/DNase[5mg/ml] (Roche diagnostics,
24Mannheim, Germany)解离组织。使用4组份培养液(神经细胞基础培养液+lml50x B-27 添加物(InvitrogerO+O. 5mM L-谷氨酰胺+25 y M谷氨酸盐)来停止消化，并在室温下 以800g离心5分钟。将沉淀溶于5ml培养基中，通过计数(Neubauer载玻片)测定细胞 数量。将细胞置于24孔培养板中，每孔密度为250 000个细胞，覆盖上涂覆有聚-L-赖 氨酸的盖玻片。然后，用保护性刺激物(GCSF)和伤害性刺激物(谷氨酸盐，100yM)的 组合物处理这些神经元。在用谷氨酸盐处理培养物前30分钟应用GCSF。对照组既不用 GCSF(仅用盐水)也不用谷氨酸盐处理。24小时后，按照制造商推荐，使用LDH测定法 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)测定神经元细胞死亡。或者，其他已知用于诱 发细胞死亡的伤害性刺激亦可使用，如NMDA和甘氨酸、3-硝基丙酸(3-NPA)、H202、十字孢 碱、缺氧/葡萄糖丧失、钾停药(potassiumwithdrawal)、MPP+、白介素_1 3、TNF a、FAS 配体或其他已知对细胞和神经元的伤害。不同的测定法亦可用于评估硝死亡或相对的细 胞生存，如细胞死亡ELISA(Roche Diagnostics)、膜联蛋白/碘化丙锭染色后的激光扫描 iffllfiiffi^ (Kamentsky(2001), Methods Cell Biol, 63, 51-87), Compucyte, Cambridge, Massachusetts)、DAPI或H0ECHST33342染色后对具有细胞凋亡特征(凝聚、断裂)的细胞 核计数、在用裂解特异性抗体(如，Promega半胱天冬酶3抗体)免疫染色后对活化的半胱 天冬酶3阳性的细胞计数、或在细胞溶胞产物中对半胱天冬酶3活性进行测定(如ApoOne 测定法，Promega ；蛋白质印迹、Elisas)、或任何其他适用于测定细胞生存或细胞凋亡特征 的测定法。或者，可适用其他细胞，例如分化的PC12细胞、HN33细胞、SHSY5细胞、初级海 马神经元、初级运动神经元、初级感觉神经节细胞、初级中脑培养物、神经元干细胞、分化的 ES细胞或其他本领域已知的神经元样细胞、或具有一种或多种神经元表型的细胞。在此 例证的时间和浓度也可改变，例如，GCSF可与一种刺激物协同应用，或在刺激物前或后应 用。也可使用不同的GCSF浓度，如0. 1-100 ug/ml.原则上，该测定法也可适用于脑切片培 养物。为测试诸如GCSF的造血生长因子在脑外伤模型(受控的皮层撞击)中的效力，进 行下列实验。实验方案应得到当地伦理委员会的批准。将20只重量为280-320g的雄性 Wistar大鼠(Charles River, Germany)随机分组如下A(对照组，n = 10，外伤性脑损伤 (TBI)，TBI开始30分钟后用2ml 0. 9%盐水处理90分钟)；B(GCSF组，n = 10，局部缺血 持续90分钟，TBI开始30分钟后用60 u g/公斤体重的溶于2ml 0. 9%盐水的重组G_CSF( NeilpOgen 、Amgen，Europe B. V.，Netherlands)处理 90 分钟)；C (模拟手术 GCSF 处理 的对照组，n = 10，假手术，TBI开始30分钟，用60 u g/公斤体重的溶解于2ml 0. 9%盐水 重组 G-CSF( Neupogen 、Amgen, Europe B. V.，Netherlands)处理 90 分钟)。可通过向腹膜内注射100mg/公斤体重的盐酸氯胺酮(WDT，Garbsen, Germany)麻 醉动物。如必要的话，麻醉可维持在50mg/公斤体重。可将PE-50聚乙烯导管插入右股动 脉用于平均动脉压、血气、血细胞比容和血糖水平的连续监测。可将PE-50导管插入右股静 脉用于处理注入物。在实验过程中，监测直肠温度并通过恒温控制加热垫(Fohr Medical Instruments, Germany)维持在 37°C。对于TBI而言，接着除去探头周围的皮肤并将颅骨暴露并清洗。可使用具有间接 撞击的重物坠击(weight-drop)装置造成TBI，改良了与微量透析的相容性(150g重物从 40cm高度坠击在具有2. 0mm直径的Telfon接触点的PVC圆筒上)。模拟手术的对照物可用相同方法制备经历TBI，但无损伤的大鼠。在所有动物中，结果可通过死亡率和神经损害程度度量表(NSS)进行测定，在外 伤性脑损伤后研究人员通过仪器对实验组进行测定，该测定每日进行，持续一周。神经系统 功能分为0-16级(正常得分，0 ；最大缺陷得分，16)。NSS是一种运动、感觉及反射试验并 包括游梁平衡(beam balance)试验之复合体。在损伤的严重程度评分中，无法进行测试或 缺乏测试反射就奖励1分，因此损伤越严重，得分越高。TBI—周后，用150mg/公斤体重的氯胺酮麻醉大鼠并斩首。移除大脑并在0. Imol/ 1磷酸缓冲液中用4%低聚甲醛固定24小时。在石蜡包埋后，切下1 μ m厚的切片进行H&E 染色、Nissl染色和免疫组化分析。可用抗髓过氧化物酶(DAKO，USA)和G_CSFR(Santa CruzBiotechnology Inc.， USA)的抗血清进行免疫组化研究。抗血清可产生自用分离的人蛋白质(抗-髓过氧化物 酶)或在小鼠G-CSFR羧基末端的合成肽分别免疫的兔。对于抗原回收而言，所提供的用 于G-CSFR免疫组化的切片可在IOmM柠檬酸盐缓冲液中于99°C加热20分钟。然后将切片 在常规的猪血清(溶于10%磷酸盐缓冲液)中温育30分钟，接着于4°C在初级抗血清中过 夜。一级抗体可稀释至1 150 (髓过氧化物酶)或1 400 (G-CSFR)。免疫反应性通过抗 生物素蛋白生物素复合物方法(Vectastain，Vector Laboratories, USA)显影。切片可在 含有0.02%过氧化氢的0.02%二氨基联苯(DAB)中显影。可通过添加0. 02%氯化钴和硫 酸镍铵以强化反应产物。可通过在显微镜(放大倍率x40)下，对G-CSF处理的动物活对照 动物海马中神经元进行定量，从而测量TBI后神经元生存率。中性粒细胞(NG))侵入可用 四点量表(0 = MPO阴性，1 = MPO低表达，2 = MPO中等表达，3 = MPO强表达)半定量测 量。统计学分析数值表示为均值士SD。在获取所有数据后，打乱随机编码。ANOVA法和在此之后 的Fisher保护的最小显著差数检验可用于测定诸如生理参数的连续变量的统计学差异显 著性。t检验可用于比较神经元损伤和免疫组化数据。可对诸如死亡率和MPO免疫组化的 非参数数据进行Marm-Whitney U检验。ρ值< 0. 05被认为统计学显著。基于诸如GMCSF和GCSF的造血因子的效应，以及使人极度痛苦的神经元细胞上同 类受体的效应，本发明的另一个实施方案是通过拮抗癌细胞上GMCSF和/或GCSF受体来治 疗脑肿瘤或其他神经系统癌症。神经元干细胞近来，业已认识到形成新的神经细胞(神经发生)对于治疗)神经系统疾病的重 要性。和许多其他组织不同，成熟的脑具有受限的再生力，及其独特的细胞专化程度限制了 残存的健康组织承担受损脑功能的程度。然而，脑神经元所衍生自的前体细胞在成体脑中 仍存在，因此在成体脑中刺激内源性神经前体可具有治疗潜能。神经发生出现在成体脑的不同区域，包括侧脑室的喙部脑室下区(SVZ)和齿状回 (DG)的颗粒下层(SGZ)。神经发生在成体动物中出现，特别是在特定的神经学上范例后出 现(如脑缺血(Jin,等· (2001)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98，4710-5，Jiang 等· (2001)， Stroke, 32，1201—7， Kee，等.(2001), Exp.Brain. Res. ,136, 313-20, Perfilieva, 等.(2001)，J Cereb. Blood Flow Metab.，21，211-7)).也已经在人中证实了神经发生(Eriksson，等.(1998)，Nat Med，4，1313-7.)，并实际上产生功能性神经元(van Praag， 等.(2002)，Nature，415，1030-4)。具体而言，在成年期中齿状回的颗粒下层及门具有产生 新神经元的潜能(Gage,等 (1998)，JNeurobiol，36，249-66)。令人震惊的是GCSF受体在 该区域表达(图4a，d)。总结这些令人震惊的数据，证实了在GCSF治疗后功能性结果得到 改善(图8)，事实在于GCSF在另一系统(造血)中是一种干细胞因子，通过其至少是在齿 状回中对成体干细胞的刺激作用，可预计到GCSF可发挥其部分作用，特别是所观察到的长 期效应(图8)。这就证实了在目前应用中GCSF受体存在于成体神经元干细胞上，该干细胞分离 自大鼠齿状回周围的海马区(图12和13)。神经发生的重要性提供了用GCSF治疗所有神经 变性疾病和所有的神经元死亡的病症的适用性与有效性的另一理由。与在脑中作用于内源 性干细胞用于治疗神经系统疾病对比，GCSF可用于体外处理干细胞，例如分化和增殖。目前 正在研究用人干细胞疗法治疗许多疾病，具体来说是帕金森氏症和中风。最好是培养中的 干细胞能分化为特定类型的神经细胞，如用于治疗帕金森氏症多巴胺能细胞。接着，将分化 的或相反的适应新环境的细胞通过不同的途径给予生物体。例如，在帕金森氏症中，干细胞 业已直接注射入脑中以弥补黑质中多巴胺能神经元的损失(“补充疗法”)(Arenas (2002), Brain. Res.Bull，57，795-808，Barker(2002)，Mov.Disord,17，233-41)。因此，本发明的一个实施方案是在植入哺乳动物前，使用造血生长因子及其衍生 物刺激神经元干细胞的生长和分化或对神经元干细胞预处理。该方法进一步的实施方案是 在于此所述的治疗神经系统疾病的方法中利用这些神经元干细胞，当将神经元干细胞给予 个体时，优选在提供神经保护效力的方法中。在一个实施方案中，所述干细胞能由静脉内或动脉内给予。业已显示，例如， 在脑缺血或外伤性脑损伤中，发现了注射的骨髓基质细胞在脑中迁移至靶区域的途 径(Mahmood,等 (2001)，Neurosurgery, 49,1196-203 ；讨论 1203-4，Lu,等 (2001)，J Neurotrauma，18，813-9， Lu,等 (2002)， Cell Transplant，11，275—81， Li 等 (2002)， Neurology, 59，514-23)。因此，干细胞可用GCSF、GMCSF或其他造血因子体外处理，接着通 过不同途径注射患于此所述的任何疾病的患者。在本发明的一个实施方案中，移植的干细胞被遗传学改造以表达分泌因子，并增 强附近细胞的生存力，或导致成体内源性干细胞增殖和/或分化的增加。例如，干细胞可改 造以稳定表达GCSF、GMCSF和/或一种或多种另外的造血因子，并接着递送至中枢神经系统 以持续分泌GCSF、GMCSF或其他造血因子至局部环境中。可用GCSF、GMCSF和/或其他造血因子的受体激动剂处理干细胞。可使用的干细 胞包括无限增殖干细胞(如，癌基因无限增殖)、神经球(神经球)和胚胎干细胞(ES)衍 生的神经细胞(Gottlieb (2002)，Annu Rev Neurosci，25，381-407)，但也可包括类似于骨 髓基质细胞的细胞或脐带细胞(Lu等(2002)，Cell Transplant，11，275-81，Li等(2002)， Neurology, 59, 514-23)。移植不同类型的干细胞可能治疗不同的神经系统疾病，包括帕金 森病(Isacson(2002)，Brain Res Bull，57，839-46)和中风(Kondziolka，等.(2002)，J Clin Neurosci,9,225-30)。所述干细胞，如人神经元干细胞，可在移植前使用因子处理进行调节。那些调 节因子的一个实例是生长因子。一个调节的实例是将其定向分化为所需细胞，如神经元
27(Svendsen，等.(1999)，Brain Pathol，9，499-513)。干细胞上存在 GCSF 受体表明了作用 于该受体以调节这些细胞的激动剂的重要性。成体神经元干细胞可用不同浓度的GCSF或 其他的GCSF受体激动剂处理，并通过定量PCR方法分析增加的分化潜能，如通过定量神经 元干细胞(nestin)的神经元标记物(Map2、NSE (神经元特异性烯醇酶)、神经丝、NeuN)对 标记物的比率。在处理后增加的比率表明对所述神经元谱系干细胞分化增加了。在对神经 系统疾病进行移植术之前，可使用适合的浓度和时间窗口来处理干细胞。在本发明的另一个实施方案中，GCSF、GMCSF、它们的衍生物以及GCSF和GMCSF受 体激动剂有助于神经细胞的培养，例如神经干细胞的培养。在该方法中，GCSF、GMCSF、它们 的衍生物以及GCSF和GMCSF受体激动剂可添加至培养基中，并在添加至细胞前预混合，或 可添加至其中细胞正在培养的培养基中。在该方法的另一个实施方案中，用编码GCSF、 GMCSF和它们衍生物的多核苷酸转染所述神经细胞，当转染后在细胞中表达相应因子。给药/配伍/剂量G-CSF、GM_CSF和其他因子、衍生物、基因以及它们的组合可以多种剂型给药，包括 但不限于，液体溶液或混悬液、片剂、丸剂、粉剂、栓剂、多聚微胶囊或微泡、脂质体以及可注 射的或适合注入的溶液。优选的剂型取决于给药方式和治疗用法。所述组合物可以是液体、膏剂或无菌固体剂型，其在使用前可溶于无菌可注射介 质中。肠胃外给药优选经静脉注射给予。该注射可使用注射器或同等的手段。可包含药学 上可接受的载体。或者，所述组合物，如包含G-CSF的，可以合适的剂量以液体剂型经粘膜 途径给予。对于口服给药而言，所述组合物，如包含G-CSF的，可以具有合适载体的液体或 固体剂型给予。所述要被治疗的哺乳动物可以是，例如豚鼠、狗、猫、大鼠、小鼠、马、奶牛、绵羊、猴 或猩猩。在一个实施方案中，所述哺乳动物是人。同样地，在一个实施方案中，所述造血因 子，例如用于治疗或预防用途的GCSF和GMCSF是一种人因子或人源性因子。当造血因子单独或联合给药时，在治疗神经系统疾病方法中所使用的造血因子的 治疗有效量应当是能产生神经保护效力的量。上述量可在每种因子或组合约lOOng至约 10mg/公斤体重的范围内变化，并取决于年龄、种族、性别和基于患者个体的其他因素。例 如，用于本发明方法的GCSF的量应在约5至约60 u g/公斤体重，而GMCSF的量则在约5至 约750 u g/公斤体重。当这些因子联合给药时，在给予、同时给予或逐一连续给予前可对它 们进行预混合。在某些于此所述的治疗神经系统疾病的实施方案中，更高剂量的G-CSF和GM-CSF 是特别有用的，例如，可使用至少lmg、至少2mg或至少3mg，优选约l_3mg。使用目前可用的 包装单位，这些更高剂量是无法方便地给予成年患者。因此，在一个实施方案中，本发明提 供了包装，特别适用于20-250 y g/公斤体重范围的剂量，其可被给予，如由静脉内或皮下， 用于依照于此所述的神经保护作用的目的。所述用于递送高剂量组合物的包装单位的实例 包括，例如，含有0. 75-25mgG-CSF和/或GM-CSF，填充体积为1. 0ml或2. 0ml的单次使用的 管形瓶和预充满的注射器。在一个优选的实施方案中，所述包装单位也应在标签或单独印 刷的材料上包含用法说明，用于于此包含的组合物的递送。也优选用于G-CSF和/或GM-CSF给药的预充满的注射器，用kg/bdy重量标度校 准，允许根据患者体重精确且快速地确定每一患者的用药量。在紧急情况下，这些包装单
28位十分有用，例如在中风情况下，在损伤后必须对患者进行十分快速的治疗。因此，本发明 的另一个实施方案提供了一种神经保护作用，例如，在患中风或其他神经外伤事件的患者 中，在损伤后短时间内给予一种或多种于此所述的组合物。在一个可选的实施方案中，于此 所述的组合物，例如预充满的注射器也可在损伤后任何时间，而不限于损伤短时间内给予/ 使用。当该实施方案用于上下文中时，“损伤后短时间”指在损伤或导致损伤事件发生后 约10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟或甚至多达约1小时内的时间。所述组合物 可通过专业医师给予，或在某些情况下通过有权使用包含适当使用量的因子包装单位的非 专业医师给予。在专业医师，例如救护技师、护士、医生等情况下，可在患者患诸如中风的神 经外伤之区域进行给药，当正运输到医院(或其他医疗设施)时在救护车或其他运输工具 中，或在医院，例如急救室中进行给药。无意于为理论所限，在损伤后短时间内给予包含一 种或多种造血因子，例如G-CSG和/或GM-CSG的组合物，可获得最大的神经保护效力。在另一个实施方案中，本发明也提供了 一种特别适用于缓释和长期稳定应用的装 置，其可以是植入的微泵，优选是植入皮下(例如，EdithMathiowitz ；(编)Encyclopedia of Controlled Drug Delivery, Johnffiley & Sons vol. 2，pp. 896-920，1999 中所述的)。已 知该泵可用于胰岛素治疗。该泵的实例包括那些为Animas，Dana Diabecare,DeltecCozm, Disetronic Switzerland, Medtronic和Nipro Ami go制造/销售的，以及描述于例如美国 专利号5474552 ；6558345 ；6122536 ；5492534和6551276中的那些，其相关内容在此并入作 为参考。本发明也提供了一种测量G-CSF或GM-CSF内源性血清水平的装置，基于 此，考虑到年龄和体重，计算并注射入适当量的药物(例如，Renard E.，Curr Op in Pharmacol. 2002Dec ；2 (6) 708-16中所述的)。可长期进行，例如通过使用上述微泵或 短期进行。上述装置的一个实例是由Medtronic minimet (Medtronic MiniMed, 18000 DevonshireStreet, Northridge, CA 91325-1219)公司所生产的用于胰岛素治疗的装置。 一种测量GCSF或GMCSF血清水平的方法可使用蛋白质芯片或阵列来实现，例如，美国专利 6，630，358 ；6, 537，749和6，475，809中所描述的，其相关内容在此并入作为参考。在慢性神经变性疾病，例如，帕金森氏症、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、痴呆等的治疗 中，上述使用泵的药物递送和/或GSCF和/或GCCSF血清水平检测的实施方案可特别有 用。给药途径可包括常规途径，包括，例如，经口，皮下，经皮、皮内、经直肠、经阴道、肌 内、静脉内，动脉内、通过直接注射至脑以及肠胃外。此外，在某些环境中，经肺给药可能有 用，如肺喷雾剂和其他可呼吸剂型。除了肺喷雾剂外，鼻内(IN)递送(例如通过鼻喷雾剂)是一种优选的给予递送本 发明用于神经系统疾病/精神病的组合物的施用模式。鼻内递送特别适合蛋白质或肽的施 用模式，是十分方便使用的，特别适用于长期治疗。使用鼻内递送(鼻喷雾剂)肽或蛋白质 至脑的实例可见(Lyritis 和 Trovas(2002)，Bone，30，71S-74S，Dhillo 和 Bloom(2001)， Curr Opin Pharmacol,1,651-5, Thorne and Frey(2001), Clin Pharmacokinet,40, 907-46，Tirucherai，等.(2001)，Expert OpinBiol Ther, 1,49-66, Jin，等.(2003)，Ann Neurol, 53,405-9, Lemere,^ . (2002)，Neurobiol Aging, 23,991-1000, Lawrence (2002)，Lancet，359，1674，Liu，等· (2001), Neurosci Lett，308，91-4)。对于鼻内施用而言，GCSF/ GMCSF和其他于此所述的组合物可与溶剂、去污剂及能增加鼻上皮渗透性或递送至血管的 物质结合使用，所述物质例如能扩大鼻血管、增加灌注等的药物。基于给药模式，以及考虑到所涉及的相关药物代谢动力学，所述剂量可进一步改 变，如直接注射入脑的剂量应当较低，且应指明为绝对剂量，是基于GCSF、GMCSF或它们的 衍生物的局部有效性(如，5 μ g总剂量)。优选地，GCSF、GMCSF和其他造血因子及它们的 衍生物经静脉内、皮下给予，或通过大脑内直接注射给予，可用渗透泵进行给药。在另一个实施方案中，GCSF、GMCSF和其他造血因子及它们的衍生物可通过给予一 种或多种编码这些因子的核酸而提供给个体。所述编码序列核酸优选以重组载体形式给 予，例如以病毒载体形式。合适载体、表达控制序列的选择及载体构建方法是公知的。病毒 载体的实例包括腺病毒(Acsadi 等.，Hum. Gene Ther. 7 (2) 129-140 (1996) ；Quantin 等·， PNAS USA 89(7) :2581_2584(1992)；和 Ragot 等.，Nature 361(6413) :647_650(1993))、 腺伴随病毒载体(Rabinowitz 等.，Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5) 470-475 (1998))、逆转录 病毒载体(Federico, Curr. Opin. Biotechnol. 10(5) :448_453 (1999))、单纯疱疹病毒载体 (Latchman,基因264 (1) 1-9 (2001))、慢病毒载体、辛德比斯病毒载体或Semliki森林病毒 载体。合适的载体也可以是包含蛋白质的脂质体，其可结合神经细胞，如病毒表位，并含有 编码GSCF或GMCSF的核酸、或蛋白质、或寡核苷酸。上述输送系统的一个实例是HVJ-脂质 体(Kaneda，等· (2002),Mol Ther,6,219-26. Kaneda(1999),Mol Membr Biol,16，119—22)。 优选地，所述分离的和纯化的编码并表达蛋白质或多肽的核酸是可操作地连接于启动子， 所述启动子适用于在神经细胞中表达。这些和其他合适的载体述评于Kay等.，Nature Medicine 7:33—40(2001) ；Somia 等· ，Nature Reviews 1:91—99(2000)；禾口 van Deutekom 等.，Neuromuscular Disorders 8 135-148(1998)中。适用于可操作连接至所述分离的和纯化的核酸的启动子是本领域已知的。优 选地，所述分离的和纯化的编码多肽核酸是可操作地连接于启动子，所述启动子选自 肌肉肌酸激酶(MCK)启动子(Jaynes 等.，Mol. Cell Biol. 6 =2855-2864(1986)),巨 细胞病毒(CMV)启动子、四环素/多西环素调节型启动子(Gossen等.，PNAS USA 89: 5547-5551(1992))。一般来说，为确保本发明载体的有效转化，对每个要接触的细胞使用约1至约 5，000拷贝的载体，基于要接触的细胞的大概数量并考虑到特定的给药途径，其更优选为每 一细胞转化约3至约300pfu。这些病毒的量可根据需要和是否在体外或体内使用而有所变 化。实际剂量和用药方案也可取决于所述组合物是否与诸如药物组合物的其他组合物联合 给药，或取决于药物代谢动力学、药物分布和代谢的个体差异而有所变化。同样地，体外施 用的数量可取决于细胞的特定类型或载体转化手段而有所变化。上述蛋白质或其衍生物、物质或核酸可根据本领域可用到的标准程序配制用于医 学目的，如可添加药学上可接受载体(或赋形剂)。载体或赋形剂可以是固体、半固体或 液体物质，其可作为活性成分的载体或介质。基于所选择产物的特性、所要治疗的疾病或 病症、疾病或病症的阶段及其他相关情况，可选择合适的给药形式和模式(Remington' s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co. (1990))。药学上可接受载体或赋形剂的 比例和性质决定自所选择物质的溶解性和化学性质、所选择的给药途径以及标准的配药
30实践。所述药物制备物可适合于经口、肠胃外或局部使用，并可以片剂、胶囊、栓剂、溶液、混 悬液等剂型给予患者。本发明的生长因子、其衍生物、其核酸编码序列，当其有效时，为了稳 定性、便于结晶、增加溶解性等目的，可配制为并以药学上可接受的盐给予，例如酸式盐或 碱式盐。对于某些神经系统疾病，特别是在局部缺血疾病中，治疗的关键在于有效治疗而 非延迟发作。在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种方法，其中GCSF、GMCSF、它们的衍 生物、激活STAT蛋白的物质、或GCSF或GMCSF受体的激动剂可在血管闭塞、神经系统症状 发作、或其他可检测的局部缺血事件发作后24小时内、优选10小时内，最优选3-6小时内 给予。GCSF和GMCSF对长期功能改善也具有益效应，因此可在局部缺血损伤相当一段时间 后开始治疗(如损伤后1-7天)。局部缺血事件发生后，治疗可持续几天、几周，作为一种手 段来改善患者的功能恢复，类似于在我们的长期皮层梗塞模型中所见到的功能改善(参见 图8)。治疗可以是每天几个剂量(如短暂的静脉注射输注)，以使GCSF、GMCSF或相关因子 达到稳定的最低水平。治疗亦可包括持续缓慢输注所述物质(如，通过注样器设备)予患 者以达到稳定的血清水平。在诸如帕金森氏症或肌萎缩性侧索硬化的慢性神经变性过程的情况下，治疗更有 可能是GCSF或相关因子的日剂量，或优选使用缓释剂型，或GCSF或相关因子更稳定的衍生 物。筛选与神经细胞上GCSF或GMCSF受体结合的神经保护物质为了实施本发明，优选GCSF、GMCSF衍生物(如GCSF或GMCSF模拟物)和/或其 他造血因子，所述其他造血因子保留了其保护神经元潜能并还具有对白细胞减少的作用， 因此减少了潜在的不利效应。因此，本发明的一个实施方案是筛选结合神经细胞上GCSF或 GM-CSF受体的化合物，所述化合物能刺激如本申请中所述的GM-CSF或GCSF所观察到的神 经保护效力。GCSF衍生物，如GCSF模拟物，可在如实施例10所例证的体外神经保护分析中得 到测试。该神经保护分析可有所变化，而不改变该测试的基本原理，是通过改变，例如(i) 其他的损刺激物如白介素-1、缺氧、A4肽、FAS配体或(ii)其他细胞，如神经元样细胞如 SH-SY5Y细胞，或PC12细胞，或(iii)用于细胞生存能力或细胞死亡的其他示值读数，例如 DNA-断裂，核凝聚，共转染的0 -半乳糖苷酶活性、检测半胱天冬酶的荧光生成底物等的示 值读数。所有这些众多的改变是公知的并也可用于高通量系统。高通量筛选技术一般用于 定义大规模地细胞快速处理。在该分析中证实具有确定神经保护效力的物质可进一步测试 其粒细胞生成活性，如Tian等.，Science 281，257-259中所描述的。GCSF衍生物的选择 优选基于将测试物质得到的这两种特异效应与由已知类型GCSF所得到的那些效应进行比 较。同样地，GMCSF衍生物，如GMCSF模拟物也可在所述用于GCSF的体外神经保护分析中 受测试。通过测定活性转录因子的存在可获得更多的神经保护物质，所述活性转录因子例 如STAT蛋白，包括将这些细胞暴露于测试物质后，在神经元或神经元样细胞(例如，PC12、 SH-SY5Y、hNT、NT2、hn33)中的STAT-3和STAT-5。因此，在本发明的另一个实施方案中， 在于此所述的神经元样细胞中并使用常规的基因表达测定法，例如使用了 LightCycler 或Taqman 分析的定量PCR，特定物质或化合物作为GCSF或GMCSF受体激动剂的能力通过STAT蛋白的激活可得到评估，所述STAT蛋白如STAT3和/或STAT5。活化的STAT蛋白是磷酸化形式(pSTAT)并能在蛋白质印迹或免疫组化研究或 ELISA中通过使用可商购的pSTAT特异性抗体(SantaCruz Biotechnology)而得到检测。或者，可使用报道基因构建体测定STAT活性，该构建体包括STAT-应答启动子元 件(例如，多聚化STAT-结合元件，例如多聚化STAT-3或STAT-5结合元件)，其连接至报道 基因，例如荧光素酶、SEAP(分泌型碱性磷酸酶)、氯霉素转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP) 或其他常见的报道基因。在用报道基因构建体转染细胞后，将细胞与测试物质接触并确定 报道基因表达量。该测定STAT活性的方法适用于高通量形式。可使用典型的报道基因测定法，例如，使用商业化的鉴定系统(Clontech的 Mercury Pathway Profiling System ;Stratagene 白勺 PathDetect—System)。实§1方胃白勺一 个实例可按如下操作。在多孔培养板中培养细胞，如在96孔板中，密度20，000细胞/孔。细胞 接种两天后，将培养基换为无血清培养基(40 μ 1/孔)并在对于每一细胞类型而言 最佳的条件下(例如PC-12细胞可通过脂质转染法进行转染，该方法使用了推荐的 LIP0FECTAMINE2000 , Invitrogen)，用报道基因质粒转染细胞，该质粒编码STAT-结合元 件和报道蛋白(STAT-3虫荧光素酶质粒；50ng/孔)，亦转染对照质粒(renilla-荧光素酶 表达质粒；10-20ng/孔)。转染48-72小时后就可运行该测定法。用多种浓度的测试物质 刺激细胞，其浓度范围覆盖应宽。在刺激开始的5分钟内应当选择多次测定的时间点。当 使用荧光素酶测定法时，读数可确定自光度计，平板形式(Berthold，Germany)，分阶段测 量renilla和虫荧光素酶活性。可通过使用商购的检测试剂盒(双荧光素酶报道基因检测 试剂盒，Promega ；荧光素酶报道基因检测试剂盒，Clonetech)进行两种荧光素酶活性的检 测。然后，将虫荧光素酶值对renilla荧光素酶值归一化，并计算报道基因的相对诱导值 (relativeinduction)。在一个可选的筛选方法实例中，可利用并测定作用于神经元细胞上GCSF或 GMCSF受体的激动剂的活性。例如，可通过使用荧光共振转移能量测定法(FRET，或 BRET (生物发光共振能量转移法)(Siegel RM 等 Sci STKE (2000) 2000 (38) =Ll ；Xu Y 等 Proc NatlAcad Sci USA(1999) 96 (1) :151_6)，用于二聚化事件的报道基因系统，如双转 换系统(DE 10211063. 8), β -半乳糖报道基因系统(Rossi F等Proc Natl Acad Sci USA(1997)94(16) :8405_10)或分裂-泛肽(split-ubiquitin)系统(W0 954/29195，US 5，585，245，或 Johnson，N.和 Varshavs，Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91 (22) 10340-4) 来分析配体结合上同二聚化作用。在本发明中提供了另外可选的方法，用于筛选结合神经元细胞上GCSF和GMSCF的 神经保护物质，该物质对GCSF和/或GMCSF脑内源性水平产生诱导作用。于此所述及如下 实施例所证明，令人惊奇地发现GCSF和GMCSF作为脑内源性配体。这些配体为一些脑局部 缺血病症所诱导。因此，它们作为脑内源性神经保护系统的一部分。在相同意义上，作为外 源性添加的GCSF或GMCSF，其通过血脑屏障对于许多病症是有益的，在这里神经保护作用 是一种有效的治疗原则，增加GCSF/GMCSF脑内源性水平的药物可有益于这些病症。可以在培养基中添加物质(例如来自大量小分子文库)到细胞，所述细胞如神经 元细胞、初级细胞或神经元样无限增殖细胞，例如PC12细胞、SHSY5细胞等，并测定GCSF和
32GMCSF水平的基本方式，以建立用于鉴定上述物质的筛选系统。可通过测定其蛋白质(通过蛋白质印迹、ELISA、RIA和其他本领域技术人员公知 技术)、测定编码这些蛋白质的mRNA (例如定量PCR、RNA印迹、RNAse保护分析、RNA斑点印 迹和其他本领域技术人员公知技术)或通过测定该基因调控元件对GCSF/GMCSF活性，从而 测定了 GCSF/GMCSF的水平。优选地，调控元件的活性可通过报道基因构建体得到确定，该 构建体由来自启动子、增强子和/或与编码报道分子的cDNAs连接的基因内元件(例如荧 光素酶，半乳糖苷酶，绿色荧光蛋白或其他能容易测定的报道基因)的DNA片断组成。 这些报道基因构建体可转染入细胞，可以是稳定转染或瞬时转染。所述细胞可在生理条件下培养，或额外暴露于伤害性刺激(例如缺氧/葡萄糖丧 失、NO供体、谷氨酸盐过量等)，以观察添加各种要测试物质的伴随效应。通过将所鉴定的物质给予动物，并测定脑中GCSF/GMCSF含量(如，通过定量PCR) 可对该物质进行进一步的验证。在另一个实施方案中，增加GCSF和GMCSF受体的表达水平可用于增加细胞对配体 的应答性。因此，以上概述的筛选方法也可适用于筛选受体表达的增加。业已概述了本发明，可通过所涉及的某些特定实施例以得到进一步的理解，所述 于此提供的实施例目的仅在于例证，而无意于限制，除非另有指定。实施例本发明下列实验阐明了 GCSF的体外神经保护作用，在瞬时局灶性脑缺血后，GCSF 显示了明显的梗塞减轻效应。除了对侧上的神经元外，梗塞形成周围的神经元显示了与抗 GCSFR-抗体特异性的结合，表示具有GCSF受体。神经元上GCSFR的存在是新发现，可通过对 脑进行蛋白质印迹、RT-PCR和详细的免疫组化以及对培养的初级神经元进行PCR和免疫细 胞化学而得到验证。此外，相较于对照组，为STAT3核易位所鉴定的STAT3激活作用在GCSF 治疗的动物半影神经元中显著增加，暗示该作用的GCSFR/STAT介导机制。在体内局部缺血 实验中(大脑中动脉闭塞，MAC0)，当通过激光多普勒血流仪(ldf)测定比较这两组时，对脑 血流量没有影响。在MAC0实验过程中，在这两组间生理参数和体重下降没有显著差异。在 MCA0实验中，相较于对照组，在GCSF处理的动物中死亡率得到显著改善。相较于对照组， 在GCSF处理动物24小时后嗜中性血细胞计数(NGC)显著增加。髓过氧化物酶(MP0)-染 色用于测定中性粒细胞(NGs)侵入局部缺血半球，在GCSF处理的动物和对照动物之间没有 显著差异。在该实验中使用的静脉注射递送的GCSF剂量(60P g/kg/体重)与用于其他实验 条件的剂量相当。在初期试验计划前就业已测试了安全性，因此没有观察到明显的副作用。 该剂量(eoyg/kg/体重)高于用于治疗人脊髓发育不良和其他疾病的批准剂量6倍，且在 大鼠模型中没有显示可评估的副作用。使用GCSF所达到的50%梗塞减小结果与其他诸如bTOF或IGF的生长因子全身给 药后的结果相当(Fisher M 等 ，J :Cereb. BloodFlow Metab.，1995 ；15 :953_9 ；Schabitz WR，等.，Stroke 2001 ；32 1226-33)。似乎葡萄糖丧失、兴奋性中毒、伴发的细胞Ca2+过载 及细胞凋亡、活性氧簇、以及面对增加的需要量而减少的能量储备(如来自扩散性抑制)是 局部缺血后神经元细胞死亡的主要原因(Lee JM.等.，Nature 1999 ；399(Suppl) :A7_14)。 如实施例所证实，GCSF在体外保护神经元样细胞(NGF-分化的PC12细胞)抗H202诱导的细胞死亡。H2O2通过产生活性氧簇(ROS)而引起氧化应激，其引起细胞死亡。依据细胞表 型、剂量、时程和所涉及的信号途径，H2O2介导的细胞应激在哺乳动物细胞中可得到充分鉴 定。在许多研究中H2O2大量使用支持了细胞凋亡机制是细胞中H2O2效应的结论(参见，例如 FASEB J. 2002Jan ； 16(1) :111_3 J Cell Biochem 2001 ；82 (3) :437_44)。例如，在H2O2介导 的细胞死亡中业已令人信服地证实了激酶ASKl和Fas配体在细胞凋亡前的作用(Tobiume K, EMBO Rep 200IMar ；2 (3) 222~8 ； Kwon, D.，J Neuroimmunol. 2001 Feb 1 ；113(1) :1_9 ； Facchinetti，F.，JNeurosci Res. 2002Jul 15 ；69 (2) 178-88.) 因此，有可能 GCSF 干扰 了引起脑缺血的细胞凋亡机制。GCSF作用可能是通过结合高亲和力受体GCSFR而得到介 导。与其受体相互作用激活了 Janus家族激酶(JAKs)和STATs (Darnell JE Jr. ,Science 1997 ；277 :1630-5)。JAK是非受体型酪氨酸蛋白激酶，在配体诱导的受体二聚化中得到激 活。在保守的酪氨酸残基上，GCSF诱导JAKs激活磷酸化STATs，其引起STAT 二聚化(Quelle FW，等.，Mol. Cell Biol. 1994 ；14 :4335_41)。此外，STATs易位至细胞核并随后调节基因 表达(Shuai K，等.，Nature 1993 ；366 :580_3 ；Shuai K.，Oncogene 2000 ；19 :2638_44)。 STAT3 是为 GCSFR 所激活的主要 STAT 蛋白(Shuai K.，Oncogene 2000 ； 19 2638-44)。 STAT3通过激活bcl-2介导抗细胞凋亡功能，并通过上调原癌(c-myc)基因诱导粒细胞增 殖和分化(Fukada T, Immunity 1996 ；5 449-60 ；Shimozaki K, J :Biol. Chem 1997 ；272 25184-9)。于此所示，通过使用免疫组化、RT-PCR和蛋白质印迹，GCSFR并不仅仅存在于造 血细胞，也存在于神经元、神经胶质细胞、神经元样细胞和神经元干细胞。此外，GCSF在半 影神经元中诱导的STAT3上调可介导抗细胞凋亡作用，如所示作用于BDNF或bFGF的bcl_2 上调(Schabitz WR，等.，Stroke 2001 ;32 :1226_33)，并提供了神经元生存的营养支持。 梗塞形成的半影中稠密的STAT3核标记能反映膜受体-介导的STAT3从细胞质到细胞核 的易位，其也显示为脑缺血后激活的小胶质细胞(PlanasAM，等.，Eur. S =Neurosci. 1996 ； 8:2612-8)。已知GCSF能刺激释放、增强效应子作用并通过延迟中性粒细胞(NGCs)的细 胞凋亡性细胞死亡而延寿、增强身体对所有类型感染的第一道防线(Hartimg Curr Opin Hematol 1998;5:221-5)。嗜中性粒细胞可闭塞微脉管，随后侵入白细胞引起已知能增大 梗塞体积并恶化脑缺血后果的蛋白水解酶、氧自由基、白介素和TNF- α -效应的释放(Del Zoppo GJ, Stroke 1991 ；22 1276-83 Jean WC，等·，Neurosurgery 1998 ；43 1382-96 ； Matsuo Y，等.，Brain Res. 1994 ；656 :344_52)。与之相反，GCSF具有显著的抗炎作用 在外周感染模型中GCSF减少了 TNF-α、IL-I β , IL-2、IL-6和IL-8，并提高了 IL-1 β受 体拮抗剂水平(GorgenL 等·，J Immunol 1992 ； 149 :918_24 ；Heard S0，等·，Crit. Care Med. 1999；27 1019-21 ；Heard SO,等·，Crit. Care Med. 1998 ；26 :748_54 ；Hebert JC, 等·，Arch. Surg. 1990 ；125 1075-8 ；Lundblad R，等.，Crit. Care Med. 1996；24 :820_6·； Squadrito F，等.，Br Pharmacol 1997;120:333-9)。GCSF 减少了 TNF-α 在体外和健康 志愿者体内的释放，并提高TNF、IL-6、IL-8和IL-1拮抗剂水平(Hartung T. Curr Opin Hematol 1998 ；5 221~5 ；Gorgen I，等·，J. Immunol. 1992 ； 149 :918_24 ；HeardSOn等·，Crit Care Med 1999 ;27 :1019_21)。此外，在内脏局部缺血模型中观察到了肺和回肠中减少的嗜 中性粒细胞渗透，给予GCSF15分钟后的再灌注以及小肠的再灌注(Squadrito F，等.，Br J Pharmacol 1997 ；120 :333_9.)。与这些发现一致的是在局部缺血半球中并没有发现嗜中性 粒细胞渗透的增加，尽管在GCSF处理后总的中性粒细胞(NGCs)增加了。
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另一可能的生长因子作用机制，具体而言bFGF的作用机制包括对脑血流量的 影响。bFGF处理使局部缺血区周围侧突扩大，甚至在并不促进全身性低血压的情况下亦 然，因此增加 了半影区的血流量(Tanaka R，等.，Stroke 1995 ；26 2154-8 ；discussion 2158-9)。然而，如此所示，相较于对照组，通过LDF测定的GCSF处理并不减少全身血压或
改变脑血流量。在光诱导血栓形成的孟加拉玫瑰红模型中，光诱导血栓形成性中风6周后，局部 缺血后静脉内GCSF处理明显地改善了感觉运动功能的结果，进一步支持了，即在体内外伤 性脑损伤后，生长因子诱导恢复及再生。之前报道两种其他化合物，碱性成纤维细胞生长因 子(bFGF)和成骨蛋白-l(OP-l)能改善感觉运动功能并在局灶性脑缺血后能诱导神经元发 芽(Kawamata 等 Proc Natl Acad Sci USA 1997 ;94 :8179_84 ;Kawamata 等 Neuror印ort 1998 ；9 :1441-5 ；Ren 等 Neuropharmacology 2000 ；39 860-5)。在大多数这些研究中，在脑 室中给予生长因子被认为在临床上是不恰当的。R有Ramirez等.(Ramirez，等.(1999)， Neuroreport, 10，1201-4.)报道了在静脉内给予bFGF，证实了损伤诱导的海马发芽，但作 者没有研究功能结果的措施。在此出现的该结果显示了临床上相关的GCSF给予剂量方案 诱导了脑缺血后的功能恢复。很明显，用于增强可塑性的能力不限于局部缺血脑损伤，也包 括与神经变性疾病相关，例如帕金森氏症、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、三核苷酸串联重复疾 病、基于复苏或产时问题的脑缺血、可能也与诸如阿尔茨海默氏病的痴呆相关，以及与精神 分裂症的神经变性方面相关。脑缺血实验方法概述通过使用大鼠大脑中动脉缝合闭塞模型(90分钟)诱导局部缺血。局部缺血诱发 30分钟后，由静脉内持续90分钟给予动物(每组n = 12)60 yg/公斤体重的GCSF或载体。 基于局部缺血24小时后TTC(2，3，5-氯化三苯四唑)染色来计算梗塞体积。通过免疫组化 研究GCSFR表达，通过RT-PCR合免疫印迹验证。通过免疫组化研究STAT3表达。在孟加拉 玫瑰红光诱导血栓形成模型中研究GCSF在功能恢复中的功效。统计学分析在该研究中数值表示为均值士SD。在获取所有数据后，打乱随机编码。AN0VA法 和在此之后的Fisher保护的最小显著差数检验或Bonferroni校正可用于测定体外数据和 生理参数的统计学差异显著性。t检验可用于比较尸检梗塞体积、MP0和STAT3免疫组化。 可对死亡率数据进行卡方检验。p值< 0. 05被认为统计学显著。结果GCSF将梗塞体积减少至 131. 96mm3士 112. 7mm3，对照组中为 278. 9mm3士91. 56mm3(p < 0. 05)。免疫组化、蛋白质印迹和RT-PCR揭示了在神经元和神经胶质细胞中存在GCSF受 体。相较于对照组，在梗塞形成周围GCSF有效激活STAT3(p< 0.05)。GCSF能有效地改善 孟加拉玫瑰红光诱导血栓形成模型中局部缺血后的功能恢复。因此，已经证实了在细胞培养物中及在局灶性脑缺血后GCSF具有有效的神经保 护效应。该效应似乎为GCSFR与STAT3激活之间的相互作用所介导。实施例1-局灶性脑缺血诱导局灶性脑缺血(MCA0，大脑中动脉闭塞)程序实验方案为地方伦理委员会所批准。将24只重量为280_320g的雄性Wistar大鼠(Charles River, Germany)随机分组如下A (对照组，η = 12，局部缺血持续90分钟， 在血管闭塞开始30分钟后用2ml0. 9%盐水处理90分钟)；B(GCSF组，η = 12，局部缺血持 续90分钟。在血管闭塞开始30分钟后用60 μ g/公斤体重的溶解于2ml 0. 9%盐水的重组 人 GCSF，Neupogen , Amgen, Europe B. V.，Netherlands 处理 90 分钟)。或者，任何的
GCSF或衍生物或其他来源的制剂(另外的制造商(如Roche的Lenogastrim 、Chugai的 Granocyte 、HGS 的 Albugranin 或 Roche/Amgen 的 Neulasta )也可在此使用。然后通过向腹膜内注射IOOmg/公斤体重的盐酸氯胺酮(WDT，Garbsen, Germany) 麻醉动物。如必要的话，麻醉可维持在50mg/公斤体重。可将PE-50聚乙烯导管插入右股 动脉用于平均动脉压、血气、血细胞比容、白细胞计数和血糖水平的连续监测。可将PE-50 导管插入右股静脉用于处理注入物。在实验过程中，监测直肠温度并通过恒温控制加热垫 (Fohr Medical Instruments, Germany)维持在37°C。通过使用缝合闭塞模型诱导瞬时局 灶件脑缺血，该樽型详细描沭于ZeaLonga等.(Stroke 1989 ;20 :84_91)中。简言之，通 过颈中线切口暴露右颈部总动脉和右颈外动脉。在颈总动脉中通过动脉切除术将涂有硅 (Bayer, Germany)的4_0单丝尼龙缝线(Ethicon，Germany)插入，轻轻地进入颈内动脉并 定位于离颈动脉杈约17mm处。使用该技术，缝合顶端单侧闭塞了近端的大脑前动脉、MCA起 端及后交通动脉。通常，在MCA区域产生了大范围梗塞。在导管闭塞后90分钟，通过取回 闭塞细丝进行再灌注。对模拟手术动物进行上述相同实验程序，但尼龙丝没有进入颈总动 脉远端，因此不形成梗塞。在手术后，移去导管，允许动物从麻醉中恢复并随意给予食物和 水。局部脑血流量测量法在MCA闭塞前、闭塞过程中及闭塞后，使用激光多普勒血流仪(LDF) (Periflux 4001Master, Perimed AB, Sweden)监测脑血流量(CBF)。在将动物置于立体定位架后，暴露 动物颅骨并在显微镜下在右侧4mm外侧和前囟尾侧2mm处钻一个直径1. 5mm的孔。取下完 整的硬脑膜并将LDF探头(直径1. 4mm)置于头颅钻孔处。选择相应于大鼠MCA闭塞模型 缺血半影区的区域进行CBF监测。梗塞体积计算MCA闭塞24小时后，用150mg/公斤体重的氯胺酮麻醉大鼠并斩首。解剖脑并切成 5个2mm厚的冠状面切片，在2%的2，3，5-氯化三苯四唑(TTC)溶液中于37°C温育30分钟 并通过浸于10%甲醛缓冲液中进行固定。使用电荷耦合器件照相机(EDH-1000HR计算机照 相机，Electrim Corporation,Princetown,NJ,USA)对TTC-染色的切片照相。研究人员使 用计算机图象分析仪(Bio Scan Optimas,Edmonds,WA)接仪表操作测定梗塞体积。为补偿 脑水肿造成的影响，如前详述计算校正的梗塞体积校正的梗塞区相当于左半球区_(右半 球区-梗塞区)(SchabitZ WR，等.，Stroke 2001 ；32 1226-33)。梗塞体积表示为对侧半 球的百分比。局部缺血实验在局灶性脑缺血后GCSF实现了有力的神经保护效果。腹膜内GCSF处理的动物 平均梗塞体积为131. 96mm3+112. 7mm3,对照组为278. 9mm3士91. 56mm3 ；或为总的半球的 9. 96 士8. 31% (η = 12)，对照组为 22. 7 士6. 69% (ρ < 0. 05 ；图 1)。GCSF处理能明显减少死亡率在24小时再灌注期间，对照组中死亡四只动物，而
36GCSF处理组中仅死亡一只(p < 0. 05)。对于所有动物的直肠温度、pH、pC02、p02、血细胞比 容(hct)、血糖、心率、平均动脉压和体重而言，在对照组和GCSF处理组之间没有观察到统 计学差异(表1)。局部缺血24小时后，相较于对照动物，GCSF处理的动物的外周血中白细 胞计数明显增加(P < 0. 05，表1)。
LDF监测揭示了在两个处理组之间没有统计学差异(数据未显示)。实施例2-在上下文的局灶性脑缺血中的免疫组化
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38
使用的免疫组化方法为了从形态学上分析STAT3激活作用(图6)和GCSFR在梗塞的脑中分布，以及 对中性粒细胞计数，将GCSF处理的动物及对照动物的2-mm厚的脑切片浸泡固定于溶于 0. lmol/1磷酸缓冲液的4%低聚甲醛中24小时(每组η = 5)。在石蜡包埋后，切下Ιμπι 厚的切片，用Η&Ε染色、Nissl染色并免疫组化分析。使用抗髓过氧化物酶(DAKO，Carpinteria, CA, USA)的抗血清、胶质纤维酸性蛋 白(GFAP) (DAKO, Carpinteria, CA, USA)、GCSFR(Santa Cruz Biotechnology Inc. , Santa Cruz, CA, USA)禾口 STAT3 (Santa Cruz Biotechnology Inc. , Santa Cruz, CA, USA)进行免 疫组化研究。为了回收抗原，将所提供用于GCSFR和STATS免疫组化的切片在IOmM柠檬酸 盐缓冲液中于99°C加热20分钟。然后，将切片在正常猪血清(在磷酸盐缓冲液中占10%) 中温育30分钟，接着在初级抗血清中于4°C温育过夜。将一级抗体分别稀释至1 150(髓 过氧化物酶)、1 400 (GFAP)U 400 (GCSFR)及1 100(STAT3)。通过抗生物素蛋白生 物素复合物法(Vectastain，Vector Laboratories,USA)显影免疫反应。切片在含0.02% 过氧化氢的0. 02% 二氨基联苯(DAB)中显影。通过添加0. 02%氯化钴和硫酸镍铵强化反应 产物。在对照切片亚组中，GCSFR抗血清与各自肽的预吸收并不产生免疫染色(未显示)。 当省略初级抗血清时间，也没有产生免疫染色(未显示)。通过对每个梗塞半球的NG计数，从而定量测定中性粒细胞(NG)侵入。在顶骨皮层 和相应对侧梗塞形成周围的rostro-尾部两个重叠区域中对STAT3蛋白表达进行定量(放 大倍率x400)。结束时，计数核易位的神经元，给出STAT3阳性神经元在所有神经元中的百 分比。局灶性脑缺血中免疫组化实验结果在两组中，对非局部缺血半球的中性粒细胞(NGs)进行髓过氧化物酶(MPO)染色。 基于局部缺血半球中对MPO阳性细胞定量，在GCSF处理的动物和对照动物之间MPO染色无 统计学差异(14 士 17. 6 对 14. 3 士 12. 5，n. s.)。GFAP免疫反应性(IR)存在于非梗塞半球整个皮层、纹状体和白质分散的星形细 胞突起中。没有证据表明在未处理的和GCSF处理的大鼠的梗塞区周围皮层中能检测到 GFAP染色的分布和密度。具体而言，在皮层半影中GFAP IR没有增加，在安慰剂组和GCSF 组中也没有增加(未显示)。在梗塞核心中，分散的GFAP免疫反应性星形胶质细胞可得到 检测(未显示)。在未处理和GCSF处理的动物中，对GCSFR的免疫组化、染色可在分散的皮层神经 元和神经突(未显示)中得到检测。神经胶质细胞也被GCSF-R抗体(未显示)染色。在 梗塞核心中，没有观察到GCSF-R免疫反应性细胞。证据表明在两实验组中，GCSF-R IR的 分布和密度没有差异。在安慰剂和GCSF处理的大鼠中，在未梗塞半球的神经元和神经胶质细胞分散的 细胞核中观察到STAT3 IR0 一些细胞质染色也存在于少数分散的神经元中。在梗塞形成 半影中，相较于未处理对照物，在GCSF处理后STAT3蛋白表达显著增加(34. 4士7. 05对 13. 7士4. 4 ;ρ < 0. 00039)(图 6，7)。在对侧中没有差异出现(16. 2士6. 9 对 13. 3士6. 9 ； n. s.) ο实施例3-在上下文的局灶性脑缺血中的蛋白质印迹和PCR
蛋白质印迹(图3)为了免疫印迹，将脑组织(2小时的瞬时局部缺血)在4°C下溶解于在20倍体积 (w/v)的勻浆缓冲液(320mM蔗糖，0. ImM苯甲磺酰氟和2i!g/ml胃蛋白酶抑制剂)中。于 4°C在9，200G下离心勻浆15分钟。在将沉淀重悬于1/10的勻浆体积中，分离并取样用于蛋 白质检测(Bio-Rad蛋白质测定，Munich, Germany)等分试样，将其在氧化亚氮中快速冷冻 并贮存在-70°C下。在含有4M尿素的8% SDS聚丙烯酰胺凝胶的每一泳道上添加15 y g蛋 白质，并在标准条件下电泳。通过半干印迹法将电泳后的蛋白质转移至Immobilon-PTM膜 (MilliporeCorp. , Eschborn, Germany)上。在溶于 TBST (20mM pH 7. 6Tris 碱，，137mM NaCl 和0. 05% Tween-20)的3%脱脂奶粉中于室温(RT)封闭1小时后，将膜与一级GCSFR抗体 (1 500)在4°C温育过夜。在TBST洗涤后，将膜与1 2，000稀释的适当的辣根过氧化 物酶缀合的二级抗体在室温下温育1小时。在线性范围内观察到具有增强化学发光的免 疫反应条带(Amersham Intl. , Braunschweig, Germany)。在使用皮层提取物的免疫印迹实验中(图3)，GCSF_R抗血清检测到约130kD的蛋 白条带，与推断的分子量一致(Fukunaga R，等.，JBiol Chem 1990 ;265 :14008_15)。此外， 观察到一些低分子量条带，反映了产物很可能断裂。在GCSFR抗血清与各自肽预吸收后，条 带消失了(图3)。对脑中GCSF受体进行PCR (图2A)在大鼠深度麻醉并经颈动脉灌注后，快速解剖脑。根据制造商说明书，通过 RNA-clean试剂盒(AGS，Heidelberg, Germany)从脑中提取RNA。用MMLV逆转录酶盒随机 六聚物逆转录总共10 y g的RNA。对于PCR而言，使用了下列来自鼠GCSFR外显子5和7的 引物正义，5' -CCC CTC AAA CCT ATC CTG CCT C_3' (SEQ ID NO 5)；和反义，5' -TCC AGG CAG AGA TCA GCG MT G_3' (SEQ ID NO 6) (Ashihara E 等 ，J Cell Physiol 1997 ； 171 343-56)。根据下列方案进行PCR :94°C 3分钟，94°C 1分钟，58°C 1分钟和72°C 1分钟 (40个循环)。在2%琼脂糖凝胶上分析产物。使用特异于小鼠GCSFR的RT-PCR，在脑组织中检测GCSF-RmRNA (图2A)。PCR产物 具有预期567bp的大小。通过对PCR产物测序验证了同一性(图2)。实施例4-在ALS模型中GCSF功效ALS小鼠模型中生存测试前述实验已经证实了 ALS的S0D1小鼠模型是成功进行人治疗的前兆(Cleveland 和Rothstein(2001)，Nat Rev Neurosci 2，806-19)。在该分析中主要终点是运动征兆的 发作和死亡率。例如，运动征兆的发作可定义为小鼠无法在转筒中以20rpm速度保持7分 钟的第一天(Li，等(2000)，Science，288，335-9)。或在死亡日子或由于缺点严重而要被处 死的小鼠的日子(如其无感觉及不健康)来记录死亡率。通过握力测试测定运动强度、对 脊髓中运动神经元计数、神经稠度(如，坐骨神经、膈神经)和在脊髓运动神经元中所存在 细的胞凋亡染色以确定附加参数。GCSF可通过渗透泵以预确定的剂量，如60 y g/公斤体 重/天。注入脑室中。或者，GCSF可通过静脉注射或腹腔注射给予60 yg/公斤体重/天 的剂量，或更高剂量。或者，给予缓释剂型的GCSF，例如PEG剂型(见前)或白蛋白剂型 (见前)或其他缓释剂型。或者，使用任何的GCSF或衍生物或其他来源的制剂(另外的制 造商(如 Roche 的 LEN0GASTRIM 、Chugai Pharma, Co. Ltd.，的 GRAN0CYTE 、Human GenomeSciences 的 ALBUGRANIN 或 Roche/Amgen 的 NEULASTA )。在 S0D1 G93A 突变体晚期症状 发生前的60天开始治疗。在未治疗的家族ALS小鼠中，在12-14周出现运动障碍，而在20 周前没有观察到瘫痪。预期寿命未140-170天。有效治疗应能延长寿命，与对照组相比超 过 15% (Cleveland 和 Rothstein (2001)，Nat. Rev. Neurosci. , 2,806-19) 关于对照组的 处理，可用载体和zVADfmk( —种在该模型中显效的潜在的半胱天冬酶抑制剂)治疗动物。 每组包含10只动物。实施例5-GCSF在帕金森模型中功效现有多种帕金森氏症啮齿动物模型适用于GCSF的功效研究(Grunblatt， 等.(2000),JNeurol,247Suppl 2，1195-102.)。一种性能良好的模型使用了 1_ 甲基 _4_ 苯 基-1，2，3,6-四氢吡啶(MPTP)。通过腹腔注射将4剂量的MPTP-HC1 (15mg/kg每剂量)以 2小时间隔给予8周大小的雄性小鼠(n = 20)。给予模拟手术处理的动物盐水。20只动物 都进行MPTP处理并给予GCSF日剂量(静脉注射，60i!g/公斤体重)，在最终的MPTP处理 7天后处死小鼠。在处死前，分析小鼠的运动参数(旋转行为、自由运动)。对10只小鼠的 每只的脑进行免疫组化以分析黑质中对酪氨酸羟化酶或多巴胺转运蛋白阳性的神经元的 总数(使用商购抗体)，和细胞凋亡阳性神经元的数量(TUNEL染色、半胱天冬酶-3染色)。 将MPTP处理后残留的多巴胺能神经元与那些给予MPTP+GCSF的神经元、及模拟手术组的神 经元进行比较。每组剩下的10只动物可经颈动脉灌注盐水，处死，并切开纹状体。纹状体在冰上 勻浆，通过具有电化学检测的HPLC测定多巴胺含量。对三组动物的比较可提供了对由于黑 质中细胞损失而导致的多巴胺损耗的有效测量。该实验也可使用不同剂量方案的MPTP (即一次40mg/公斤体重；两次30mg/公斤 体重等)来进行。实施例6-在光诱导血栓形成脑缺血后GCSF改善感觉运动功能(图8)实验组实验方案为地方伦理委员会所批准。将重280_320g的雄性Wistar大鼠(Charles River, Germany)随机分组如下A (对照组，n = 6)，局部缺血，在局部缺血开始1小时后用 0. 5ml 0. 9%盐水处理，如通过快速静脉注射；B (GCSF组，n = 6)，局部缺血，在局部缺血开 始1小时后用溶于0. 5ml 0. 9%盐水的5ii g GCSF(Amgen)处理，如通过快速静脉注射。或 者，任何的GCSF或衍生物或其他来源的制剂(另外的制造商(如Roche的Lenogastrim 、 Chugai 的 Granocyte 、HGS 的 Albugranin 或 Roche/Amgen 的 Neulasta )也可在此使用。 在1-5天，通过尾部静脉重复快速注射。C(模拟手术组，n = 6)，假手术，无局部缺血，在局 部缺血开始1小时后用0. 5ml 0. 9%盐水处理，如通过快速静脉注射。通过光诱导血栓形成的局灶性脑缺血通过肌肉注射100mg/公斤体重的盐酸氯胺酮(WDT，Garb sen，Germany)麻醉动物。 如必要的话，麻醉可维持在50mg/公斤体重。可将PE-50聚乙烯导管插入右股动脉用于平 均动脉压和血气的连续监测。可将PE-50导管插入右股静脉用于处理注入物。在实验过程 中，监测直肠温度并通过恒温控制加热垫(Fohr Medical Instruments, Germany)维持在 37 °C。根据Watson等的方法在大鼠右顶骨皮层进行光诱导血栓形成的局部缺血的诱导(Watson BD,Dietrich WD,Busto R,ffachtel MS,Ginsberg MD. Induction of reproducible brain infarction byphotochemically initiated thrombosis. Ann Neurol.1985 ； 17 497-504.)。用盐酸氯胺酮麻醉动物并置于立体定位架中，切开头皮暴露颅骨表面。为了照 明，将具有1. 5mm孔径的光导纤维束置于颅骨前囟后部4mm和中线侧面4mm处。用冷白光束 (150W)照明颅骨20分钟。在开始的2分钟过程中，静脉注射染料孟加拉玫瑰红(0. 133mL/ 公斤体重，10mg/mL盐水)。如上所述对模拟手术动物进行相同的实验，但不注射孟加拉玫 瑰红和进行照明。在手术后，移去导管，允许动物从麻醉中恢复并随意给予食物和水。行为测试在所有动物中，在局部缺血前和在局部缺血后的基线、2、3、4、5和6周进行一组 行为测试，对研究人员隐蔽实验组。为了进行旋转测试，将大鼠置于加速的转筒中，测定动 物在转筒上停留时间(Hamm等，J Neurotrauma 1994Apr ； 11 (2) 187-96,Chen J,Li Y,ffang L,ZhangZ,Lu D,Lu M,Chopp M. Therapeutic Benefit of IntravenousAdministration of Bone Marrow Stromal Cells After Cerevral Ischemiain Rats. Stroke. 2001 ；32:1005)。 缓慢增加速度，在5分钟内从4增加到40rpm。如果动物从横档落下或抓住装置并旋转2周 而不尝试在横档上行走，则结束该试验。在训练及测试程序中，对大鼠人工设定时间限度， 即在转筒上500秒。在局部缺血前训练动物3天。在手术前，记录在装置上的平均持续时 间(以秒计)，1天测量3轮。运动测试数据表示为转筒上平均持续时间(3次试验)相对 于内在基线对照(手术前)的百分数。为了进行胶带移除(adhesive-removal)测试，在局部缺血前后测定身体感觉缺 陷(Schallert T, Kozlowski DA, Humm JL, Cocke RR. Use-dependent structural events in recovery of function. Adv Neurol. 1997 ；73 :229_238. ；Chen J, Li Y, Wang L, Zhang Z, Lu D, Lu M, Chopp M. Therapeutic Benefit of Intravenous Administration of BoneMarrow Stromal Cells After Cerebral Ischemia in Rats. Stroke.2001 ； 32:1005.).让所有大鼠熟知测试环境。在最初测试中，将2小块背面带粘性的纸点 (adhesive-backed paper dots)(具有合适的大小，113. 1mm2)用于在每一前肢腕部上末稍 桡骨区进行两侧触觉刺激。然后将大鼠放回笼中。对于每一前肢，记录每天5次试验中的 每次来自前肢刺激移除的时间。每次试验至少间隔5分钟。在手术前，训练动物3天。一 旦大鼠能在10秒内移除该点，它们就具有局部缺血。神经系统疾病严重性得分(NSS)改良自Chen J，Li Y，Wang L，Zhang Z，Lu D， Lu M, Chopp Mo Therapeutic Benefit of IntravenousAdministration of Bone Marrow Stromal Cells After Cerebral Ischemiain Rats. Stroke. 2001 ;32 :1005,禾口 Schallert T, Kozlowski DA, HummJL, Cocke RR. Use-dependent structural events in recovery of function. Adv Neurol. 1997 ；73 :229_238。将神经系统功能分级为 0_16(正常得分，0 ； 最大缺陷得分，16). NSS是运动、感觉、反射和平衡测试的复合物(Chen J, Li Y，Wang L， Zhang Z, Lu D, Lu M, Chopp M. Therapeutic Benefit of Intravenous Administration of Bone MarrowStromal Cells After Cerebral Ischemia in Rats. Stroke. 2001 ；32 1005. ,Germano AF,Dixon CE,d' Avella D,Hayes RL,Tomasello F. Behavioral deficits following experimental subarachnoid hemorrhage inthe rat. J Neurotrauma. 1994 ； 11 =345-353.)。在损伤的严重程度评分中，无法进行测试或缺乏测试反射就奖励1分，因此损伤越严重，得分越高。结果对于所有动物的直肠温度、pH、pC02、p02、血细胞比容(hct)、血糖、心率、平均动脉 压和体重和死亡率而言，在各组间没有观察到统计学差异(数据未显示)。与其他组比较，在整个过程中GCSF处理的动物功能恢复得明显更好。相较于对照 组，GCSF处理的动物具有明显更低的NSS得分，包括实验过程中得游梁平衡(p < 0. 05,图 8a)。在GCSF处理的动物中对侧前肢中，在整个过程中通过除去胶带测定的感觉运动功能 也好于对照组，在同侧前肢中同样的情况在6周时出现(参见图8c，d)。实施例7-GCSF受体在脑缺血的光诱导血栓形成模型中下调节在用Qiagen Rneasy 微型试剂盒纯化后，根据标准方法(Chomczynski and Sacchi (1987)，Anal. Biochem.，162，156-159)从大鼠皮层半影样品的同侧和对侧损伤部位 分离RNA(参见图9a，组织样品定位；此处3对4)。使用寡dT引物、Superscript II逆 转录酶(Gibco)及标准条件，从1 P g总RNA合成cDNA。使用具有SYBR绿染色的DNA双链 的 Ughtcycler 系统(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)进行定量 PCR，。循环 条件如下95°C 5分钟、95°C 5秒、66°C 7秒、72°C 30秒、84°C 9秒，进行55个循环。用如 下参数作出解链曲线95°C冷却至50°C ；以0.2°C/秒斜线上升至99°C。使用了如下引物 对“大鼠 GCSFR-片段-32s”CCATTGTCCATCTTGGGGATC(SEQ ID NO 7)和“大鼠 GCSFR-片段 -265as"CCTGGAAGCTGTTGTTCCATG (SEQ ID NO :8)。按照制造商推荐(Roche Diagnostics), 使用SYBR绿标准混合物进行Lightcycler pcR。通过熔点分析和琼脂糖凝胶电泳确 保产物特异性。将样品的cDNA含量对Cyclophilin的表达水平归一化(引物“cyc5” ACCCCACCGTGTTCTTCGAC (SEQ ID NO 9) ； “ acyc300 “ CATTTGCCATGGACAAGATG (SEQ ID NO 10))。相对调节水平源自对cyclophilin的归一化，并与模拟手术动物比较。图9b显示了 作用对侧48小时后GCSFR的上调，误差条显示了标准差，计算了 3倍连续稀释的cDNA样品， 反映了测量的可靠性。实施例8-在初级培养物的神经元细胞上存在GCSF受体免疫细胞化学制备神经元10-12个皮层制备自E18期的胚(胚胎第18天)。使用溶于HBSS (Hanks平衡盐溶 液，Bioffithakker)的胰蛋白酶[10mg/ml]/EDTA/DNase[5mg/ml] (Roche Diagnostics)解 离组织。使用4组分培养液(神经基础培养液+1 ml 50x B-27添加物(InvitrogerO+O. 5mM L_谷氨酸+25iiM谷氨酸盐)停止消化，并在室温下以800g离心5分钟。将沉淀溶解在5ml 培养液中并通过计数(Neubauer载玻片)测定细胞数量。细胞在24孔培养板中培养，每孔 密度为250 000个细胞，使用的盖玻片涂覆有聚L-赖氨酸。免疫细胞化学在制备14天后，将神经元用PBS (Gibco) (37°C )洗涤并用2%低聚甲醛在冰上固 定10分钟。然后，用PBS (4°C )洗涤细胞并储存在4°C下。在50mM甘氨酸PBS溶液中温育细 胞10分钟，接着用PBS洗涤。细胞在冰上使用0. 2% TritonX-100 (Sigma) PBS溶液进行透化 处理，并与封闭溶液(0.2% Triton-X100，4%标准羊血清(NGS) (Jacksonlmmunoresearch Laboratories)PBS溶液)在室温下温育。一级抗体(直接抗小鼠GCSFR的C-末端的兔 抗-GCSF-受体-抗体、M-20、sc-694，SantaCruz Biotechnology, Inc.)以 1 800 稀释度使用，并在4°C下温育过夜。然后用1%NGS/PBS洗涤细胞，与二级抗体(抗兔-FITC， 1 400 ；dianova)在室温下温育30分钟。接着简单地在1 % NGS/PBS中洗涤细胞，并用 Hoechst 33342染色(Molecular Probes) (1 10000在PBS中)用于计数染色的细胞核。 最后，盖玻片简单地在1 % NGS/PBS中洗涤两次，在PBS中洗涤两次，在10mM pH7. 6Tris/HCl 中洗涤一次，时间10分钟。使用Aquamount(Polyscience)包埋盖玻片。使用Olympus 1X81 显微镜和“分析”软件包(Soft Imaging Systems, Stuttgart, Germany)获得数码照片。实施例9-GCSF受体存在于神经元干细胞上PCR和免疫细胞化学(图12，13)； GCSF受体存在于PC12细胞上PCR(图2B)产生神经干细胞从具有已知自发神经发生的脑区域中分离神经干细胞，即从所述的4-6周大小的 雄性Wistar大鼠的海马、嗅球和脑室下区分离(Ray J等(1993)，Proc Natl Acad Sci USA 90:3602-6)。方案应与动物使用方针一致，为美国国家研究委员会(National Research Council of the U. S. A)所认可，并遵守德国法律。简言之，用(v/v)异氟烷、70%N20、 29%氧麻醉动物并通过斩首处死。分离脑并在50mL冰冷的Dulbecco' s磷酸盐缓冲液 (DPBS)中洗涤，该缓冲液添加有4. 5g/L葡萄糖(DPBS/Glc)。切开来自6只动物的海马、嗅 球和脑室下区，在lOmLDPBS/Glc中洗涤并在4°C以1600xg离心5分钟。在除去上清液后，用 剪刀和解剖刀对组织进行均勻加工处理。用DPBS/Glc培养液在800g洗涤组织碎片5分钟， 将三种沉淀重悬于0.01% (w/v)木瓜蛋白酶、0.1% (w/v)分散酶11(中性蛋白酶)、0.01% (w/v)DNase I和12. 4mM硫酸锰Hank氏平衡盐溶液(HBSS)中。用塑料移液管顶端研磨组织 并在室温下温育40分钟，但每10分钟对溶液进行一次充分混合。将悬浮液在4°C以800xg 离心5分钟，并在DMEM-Ham氏F-12培养液中洗涤沉淀3次，该培养液添加有2mM L-谷氨酸 盐、100单位/毫升青霉素和100单位/毫升str印otomycin。然后，将细胞沉淀重悬在lmL 神经基础培养液中，该培养液添加有B27(Invitrogen，Carlsbad, CA，USA)、2mM L_谷氨酸 盐、100 单位 / 毫升青霉素和 100 单位 / 毫升 str印otomycin、20ng/mL EGF、20ng/mL FGF-2 和2ii g/mL肝素。在无菌条件下，将细胞置于6孔培养皿中，浓度为25，000-100, 000细胞 /毫升。于5%0)2中，将培养皿在37°C下温育。一周换一次细胞培养液，其中约三分之二 的培养液被置换(s Ray J 等(1993)，Proc Natl Acad Sci U SA 90 :3602_6)。RT-PCR 方案按照制造商推荐(RNeasy kit，Qiagen)，根据标准方案从海马干细胞分离RNA(图 12)，在从冷冻的母液中融化后，将该干细胞于培养液中增殖3周。使用寡dT引物、 Superscript II逆转录酶(Gibco)及标准条件合成cDNA。聚合酶链式反应(PCR)使用下 列循环条件进行94°C 3分钟、94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 1分钟；进行32个循环，使用了 引物对“大鼠 GCSFR-片段-8s”GCGGGCAAATCAGGATCTCAC(SEQ ID NO :2)，和“大鼠 GCSFR-片 段-287as”CGAAGCTCAGCTTGATCCAGG(SEQ ID NO :3)。引物来源自从大鼠基因组数据库中通 过TBLASTX搜寻所鉴定的大鼠GCSFR片段引物(参见图11)。反应条件2mM MgCl2,200 uM dNTP、200nM每种引物、1单位Taq聚合酶(Invitrogen)/25 u 10在1. 5%琼脂糖凝胶上解 析PCR产物。特异性PCR产物长度为279bp，具有如下序列(SEQ ID NO 4)(引物序列具有下划线)
gcgggcaaatcaggatctcaccccccattgtccatcttggggatcctgtcctggcctcctgcaccatca gcccaaactgcagcaaactggaccgacagccaaagatcctatggagactgcaagatgaaccaaaccagcctggggacagacagcatca cctgcctgacgggtcccaggagtccatcatcactctgcctcatctgaactacactcaggccttcctcttctgcttggtgccatgg aacaacagcttccaggtcct^gatcaagctgagcttcg.PC12细胞的PCR(图2B)按上述方案进行。神经球免疫细胞化学神经球由移液至载玻片上的神经干细胞组成，将盖玻片盖在孔上，并将载玻片置 于-80°C至少30分钟。移去盖玻片，并立刻置于4% PFA(低聚甲醛)0. IM pH 7. 4磷酸盐 缓冲液种。固定细胞20分钟。在含FCS和0.02% NaN3 (pH 7.4)中洗涤细胞3 次，每次5分钟。然后在含0. 5% TX-100的PBS中透化处理细胞10分钟。在含FCS和 0. 02% NaN3的PBS(pH 7. 4)中封闭抗原60分钟。细胞用0. 001mg/ml细胞核染料DAPI的 PBS溶液染色12分钟。接着，用含FCS和0. 02% NaN3的PBS(pH 7. 4)洗涤细胞2次， 每次5分钟。添加在含FCS和0. 02% NaN3的PBS (pH 7. 4)中稀释的一级抗体2小时， 抗体浓度分别为抗 G-GSF 1 1000、抗 G-CSF-R 1 1000、抗 GM-CSF-R1 1000 (Santa Cruz)。用含1 % FCS和0. 02% NaN3的PBS (pH 7. 4)洗涤细胞3次，每次5分钟。接着，添加 在含FCS和0. 02%妝队的PBS (pH 7. 4)中稀释的二级抗体(羊抗兔IgG-FITC (DAKO)) 60 分钟，抗体浓度为1 30。然后，用含FCS和0.02%NaN3 (pH 7. 4)洗涤细胞3 次。每次5分钟。最后细胞用Aquamount和盖玻片包埋。实施例10-在脑缺血光诱导血栓形成模型中GMCSFRa是上调的(通过RMDD发 现)实验方案为地方伦理委员会所批准。重280_320g的雄性Wistar大鼠(Charles River,Germany)进行如下处理:a)不同时间点的局部缺血(6小时、48小时和21天)；b)假 手术，无局部缺血，不同时间点(6小时、48小时和21天)，每一时间点和每次处理η = 2。光诱导血栓形成的局灶性脑缺血通过肌肉注射IOOmg/公斤体重的盐酸氯胺酮(WDT，Garb sen，Germany)麻醉动物。 如必要的话，麻醉可维持在50mg/公斤体重。可将PE-50聚乙烯导管插入右股动脉用于平 均动脉压和血气的连续监测。可将PE-50导管插入右股静脉用于处理注入物。在实验过程 中，监测直肠温度并通过恒温控制加热垫(Fohr Medical Instruments, Germany)维持在 37 °C。U M Watson BD, Dietrich WD, Busto R, Wachtel MS, GinsbergMD. Induction of reproducible brain infraction by photochemicalIyinitiated thrombosis. Ann Neurol. 1985 ；17 497-504的方法，在大鼠右顶骨皮层进行光诱导血栓形成的局部缺血的 诱导。用盐酸氯胺酮麻醉动物并置于立体定位架中，切开头皮暴露颅骨表面。为了照明， 将具有1.5mm孔径的光导纤维束置于颅骨前囟后部4mm和中线侧面4mm处。用冷白光束 (150W)照明颅骨20分钟。在开始的2分钟过程中，静脉注射染料孟加拉玫瑰红(0. 133mL/ 公斤体重，10mg/mL盐水)。如上所述对模拟手术动物进行相同的实验，但不注射孟加拉玫
45瑰红和进行照明。在手术后，移去导管，允许动物从麻醉中恢复并随意给予食物和水。在不 同的时间点(分别在局部缺血和假手术6小时、48小时和21天后)处死动物，并根据本领 域技术人员公知的方法制备皮层半影同侧和对侧。RNA 分离和 RMDD根据标准方案从大鼠皮层半影样本的同侧和对侧损伤部位分离RNA(ChomCZynSki 和 Sacchi Anal Biochem (1987)，162，156-9)，随后使用 Qiagen RNeasy 微型试剂盒纯化) (参见图13a的组织样本定位；这里3对4)。按照如EP O 743 367 A2和US 5，876，932 中所述的RMDD (限制介导的差异显示)方案，从Iyg总RNA合成cDNA。在第一链和第二 链合成后，进行MboI消化和接头连接。用引物组合子集进行两次PCR反应。随后将PCR反 应物置于变性胶上并印迹至尼龙膜(GATC Biotech AG, Konstanz, Germany)。用常规的抗 生物素蛋白链菌素-过氧化酶反应显影生物素标记的条带。将来自皮层半影的PCR样本置 于凝胶上，以下列顺序同侧天然的(未处理的)、模拟手术(sham) 6小时、模拟手术48小 时、模拟手术21天和光诱导血栓形成6小时、48小时和21天；对侧模拟手术6小时、模拟 手术48小时、模拟手术21天和光诱导血栓形成6小时、48小时和21天。将在同侧和对侧 区具有不同的强度的条带从尼龙膜上切下，并依PCR产物进行再扩增。将扩增产物克隆入 pCR-Bluntll-TOPO 载体(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，Germany)并用 T7 和 M13rev 引物测 序(ABI 3700)。将获得序列与EMBL数据库比较。鉴定得到在皮层半影同侧和对侧48小时 后上调的序列(图14)。将鉴定的EST序列在EST数据库中用BLASTN-搜寻扩展，通过使用 筛选程序(BLAST、TBLASTN(Altschul，等.(1997)，Nucleic Acids Res, 25, .3389-402))， 在EST和基因组数据库中鉴定得到编码小鼠GM-CSFRa的小鼠同源序列(ensembl ；www. ensembl. Org)。使用Sh印ard((1997)Nucleic Acids Res 25:3183-3185)的PCR克隆方法在大鼠 cDNA文库中进行筛选以确认所获得的大鼠序列。该方法是基于源自质粒文库的cDNA分子 与生物素偶联的寡核苷酸序列的杂交。在质粒抽提物与抗生物素蛋白链菌素偶联的磁珠结 合后，通过诊断性PCR和两倍复制步骤，随后所获得的质粒再变形直至恢复单克隆从而证 实了结果。使用了如下的引物组合5'封闭-2. clb4-4-4 :CGGGATCCGGGACCGCGTATCTGATGACGAGCGTGTCAA(SEQID NO: 12)25 生物素-2. clb4-4-4 CTCGGAGACGCTGAGGAAGGACCTG (SEQ ID NO 13)3'封闭-2. clb4-4-4 :CTGCGGCCCTAGACCACGCCCACCGCTCCCCGTGACGTCG(SEQ ID NO 14)(确定了单克隆的阅读框，序列示于SEQID NO :40，相应的氨基酸序列示于SEQ ID NO 41)。实施例11-在脑缺血的光诱导血栓形成模型中GMCSF受体α是上调的(通过定 量PCR验证)根据标准方案从大鼠皮层半影样本的同侧和对侧损伤部位分离RNA(ChomcZynSki 和 Sacchi Anal Biochem (1987)，162，156-9)，随后使用 Qiagen RNeasy 微型试剂盒纯化) (参见图13a的组织样本定位；这里3对4)。使用寡dT引物、Superscript II逆转录 酶(Gibco)及标准条件，从Iiig总RNA合成cDNA。使用具有SYBR绿染色的DNA双链的
46Lightcycler 系统(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)进行定量 PCR，。循环条件如 下95°C 5分钟、95°C 5秒、62°C 7秒、72°C 30秒、80°C 9秒，进行50个循环。用如下参数作 出解链曲线95°C冷却至50°C ；以0.2°C/秒斜线上升至99°C。使用了如下引物对“大鼠 BR4-4s96” ACGTCGTTGGCTCAGTTATGTC (SEQ ID NO 15)和“大鼠 BR4_4as272” ATTTATGTCAGA GATGGAGGATGG (SEQ ID NO: 16)。按照制造商推荐(Roche Diagnostics)，使用 SYBR 绿标准 混合物进行Lightcycler PCR。通过熔点分析和琼脂糖凝胶电泳确保产物特异性。将样品 的 cDNA含量对 Cyclophilin 的表达水平归一化(引物“cyc5”ACCCCACCGTGTTCTTCGAC (SEQ ID NO 17) ；“acyc300“CATTTGCCATGGACAAGATG(SEQ ID N0:18))。相对调节水平源自对 cyclophilin的归一化，并与模拟手术动物比较。图14显示了作用对侧48小时后GMCSFR 的上调。在光诱导血栓形成的诱导21天没有检测到明显的调节(图14b)。误差条显示了 标准差，计算了 3倍连续稀释的cDNA样品，反映了测量的可靠性。实施例12-在初级皮层培养物神经元细胞上存在GMCSF-受体α 制备神经元10-12个皮层制备自Ε18期的胚(胚胎第18天)。使用溶于HBSS (Hanks平衡盐溶 液，Bioffithakker)的胰蛋白酶[10mg/ml]/EDTA/DNase[5mg/ml] (Roche Diagnostics)解 离组织。使用4组分培养液(神经基础培养液+1 ml 50x B-27添加物(InvitrogerO+O. 5mM L-谷氨酸+25 μ M谷氨酸盐)停止消化，并在室温下以800g离心5分钟。将沉淀溶解在 5ml培养液中并通过计数(Neubauer载玻片)测定细胞数量。细胞在24孔培养板中培养， 每孔密度为250 000个细胞，使用的盖玻片涂覆有聚L-赖氨酸。免疫细胞化学在制备1周后，将神经元用PBS(Gibco) (37°C )洗涤并用2%低聚甲醛在冰上固定 10分钟。然后，用PBS (4°C)洗涤细胞并接着在50mM甘氨酸PBS溶液中温育10分钟，接着 用PBS洗涤。细胞在冰上使用0. 2% TritonX-100 (Sigma)PBS溶液进行透化处理，并与封闭 溶液(0.2% Triton-X100，4%标准羊血清(NGS) (Jacksonlmmunoresearch Laboratories) PBS溶液)在室温下温育。一级抗体(直接抗小鼠GMCSFR的C-末端的兔抗-GM-CSF-受 体-抗体、M-20、sc-694，SantaCruz Biotechnology，Inc.)以 1 300 稀释度使用，并在 4°C 下温育过夜。然后用NGS/PBS洗涤细胞，与二级抗体(抗兔-FITC，1 400 ；dianova) 在室温下温育30分钟。接着简单地在NGS/PBS中洗涤细胞，并用Hoechst 33342染色 (Molecular Probes) (1 10000在PBS中)用于计数染色的细胞核。最后，盖玻片简单地 在NGS/PBS中洗涤两次，在PBS中洗涤两次，在IOmM pH 7. 6Tris/HCl中洗涤一次，时间 10分钟。使用Aquamount(Polyscience)包埋盖玻片。使用Olympus 1X81 显微镜和“分析”软件包(Soft Imaging Systems, Stuttgart, Germany)获得数码照片。实施例13-在神经干细胞上存在GMCSF受体产生神经干细胞(图13)从具有已知自发神经发生的脑区域中分离神经干细胞，即从所述的4-6周大小的 雄性Wistar大鼠的海马、嗅球和脑室下区分离(Ray J等(1993)，Proc Natl Acad Sci USA 90:3602-6)。方案应与动物使用方针一致，为美国国家研究委员会(National Research Council of the U. S. Α)所认可，并遵守德国法律。简言之，用(ν/ν)异氟烷、70%Ν20、 29%氧麻醉动物并通过斩首处死。分离脑并在50mL冰冷的Dulbecco' s磷酸盐缓冲液 (DPBS)中洗涤，该缓冲液添加有4. 5g/L葡萄糖(DPBS/Glc)。切开来自6只动物的海马、嗅球和脑室下区，在lOmLDPBS/Glc中洗涤并在4°C以1600xg离心5分钟。在除去上清液 后，用剪刀和解剖刀对组织进行均勻加工处理。用DPBS/Glc培养液在800g洗涤组织碎 片5分钟，将三种沉淀重悬于0.01% (w/v)木瓜蛋白酶、0.1% (w/v)分散酶II (中性蛋白 酶)、0.01% (w/v) DNase I和12. 4mM硫酸锰Hank氏平衡盐溶液(HBSS)中。用塑料移液 管顶端研磨组织并在室温下温育40分钟，但每10分钟对溶液进行一次充分混合。将悬浮 液在4°C以800xg离心5分钟，并在DMEM-Ham氏F-12培养液中洗涤沉淀3次，该培养液添 加有2mM L-谷氨酸盐、100单位/毫升青霉素和100单位/毫升str印otomycin。然后，将 细胞沉淀重悬在ImL神经基础培养液中，该培养液添加有B27(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)、2mM L-谷氨酸盐、100单位/毫升青霉素和100单位/毫升str印otomycin、20ng/mL EGF、20ng/mL FGF-2和2 μ g/mL肝素。在无菌条件下，将细胞置于6孔培养皿中，浓度为 25，000-100，000细胞/毫升。于5% CO2中，将培养皿在37°C下温育。一周换一次细胞培 养液，其中约三分之二的培养液被置换(s Ray J等(1993)，Proc NatlAcad Sci U SA 90 3602-6)。RT-PCR 方案按照制造商推荐(RNeasy kit, Qiagen)，根据标准方案从海马干细胞分离RNA，在 从冷冻的母液中融化后，将该干细胞于培养液中增殖3周。使用寡dT引物、Superscript II逆转录酶(Gibco)及标准条件合成cDNA。聚合酶链式反应(PCR)使用下列循环条件进 行94°C 3分钟、94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 1分钟；进行32个循环，使用了引物对“大鼠 BR4-4s96"ACGTCGTTGGCTCAGTTATGTC (SEQID NO 19)，和“大鼠 BR4_4as272”ATTTATGTCAGAG ATGGAGGATGG(SEQ ID NO :20)。反应条件2mM MgCl2、200yM dNTP、200nM 每种引物、1 单位 Taq聚合酶(Invitrogen)/25y L·在1. 5%琼脂糖凝胶上解析PCR产物。特异性PCR产物 长度为176bp，具有如下序列(引物序列具有下划线)ACGTCGTTGGCTCAGTTATGTCAGACAGGAAATCTCACCATCCCACAATGATTGAC
AGCTCTCACAGGGAATCCCGCCTCCGCTGGGACCAATTGACATCACGGACAGGAATACCCGCCCCTGTGGCCCTGATGGGCAGGTCCTGCCTGGCTCCCATCCTCCATCTCTGACATAAAT(SEQ ID NO 21)实施例14 分析测定血清半衰期和GCSF/GM-CSF传代通过血脑屏障希望了解是否GCSF和GMCSF通过血脑屏障。对GCSF/GM-CSF生物素化，以使 用高灵敏性的抗生物素蛋白-生物素相互作用来检测脑组织中化学增活素。使用生物 素-XX-SE (MolecularProbes B 1606)生物素化 G-CSF (Neupogen，Amgen)。G-CSF 在添加 有250mM山梨糖醇、0. 004% Tween-80和生物素-XX-SE的20mMpH 8碳酸钠缓冲液中稀释。 在室温下1小时后，添加50mM pH 8Tris_缓冲液以淬灭未反应的标记试剂。将样品在TLA 110转子(BeclcmanInstruments)中以45000转/分旋转30分钟以除去T聚集物。在时间零点将7. 5 μ g生物素化G-CSF注射入小鼠腹膜内(在250mM山梨糖醇和 0. 004% Tween-80的200 μ 1 20mM pH 8碳酸钠缓冲液中)。用水合氯醛在所示时间麻醉小 鼠，从右心室采集血样(约200μ 1)。添加5mM EDTA并将样品在IOOOg下离心10分钟以获得 血清。添加4x样品缓冲液至血清，通过加热至95°C持续5分钟变性蛋白质，并将20 μ 1加到 微型胶上。将蛋白质转移到硝酸纤维素，在TBST中用抗生物素蛋白链菌素-HRP(Amersham) 封闭并温育。洗涤后，使用PierceSupersignal化学发光试剂检测信号。
用于Elisa分析的血清样品在分析缓冲液中稀释到1 20，根据制造商推荐进行 该分析(IBL，Hamburg，Germany)。。该分析可适用于脑脊液(csf)或脑组织勻浆以测定GCSF通过血脑屏障的转变。实施例15 分析GCSF、GMCSF的神经保护作用(图lb)在体外检测GCSF/GMCSF对NGF处理的PC12细胞的神经保护作用。将PC12细胞 接种在96孔培养板中，覆盖上聚L-赖氨酸(0. 01 %终浓度)，密度为40，000细胞/孔。细 胞在含IOOOmg葡萄糖/升和10 % HS (马血清)、5 % FCS (胎牛血清)、1 %青霉素/链霉素 的DMEM培养液中培养。然后，用PSV40-RL(编码renilla荧光素酶基因)转染细胞，按制 造商推荐使用 了 Lipofectamine 2000 转染剂(Gibco BRL) (0. 2 μ g DNA/ 孔)。在转染 后，立即添加浓度为40ng/ml的NGF(神经生长因子)来诱导PC12细胞的分化。在处理后 24小时，PC12细胞发育为具有伸出的突起的神经元样形态。然后，用不同浓度的H2O2 (图 lb)和GCSF(l-100ng/ml)处理细胞。添加已知具有体外神经保护效力的EPO作为阳性 对照物(Cerami，等.(2002)，Nephrol DialTransplant, 17,8-12.，Kawakami，等.(2001)， J Biol Chem，276，39469-75.，Sinor 和 Greenberg(2000), Neurosci Lett，290，213—5.， Chong，等· (2002)，J Cereb Blood Flow Metab，22，503-14.)，浓度为 0. 01-lU/ml。24 小时 后，抛弃培养液上清液，用被动溶解缓冲液(Promega)裂解细胞。接着在光度计(Mithras， Berthold)中记录Renilla荧光素酶活性，读数表示为相对光单位。该分析通过可检测的荧 光素酶数量从而测定了细胞生存率。因此，越高的相对光单位，就有越多的细胞生存。在该 分析中，GCSF显示了对PC12细胞剂量依赖性神经保护作用，较促红细胞生成素更有效。实施例16-GCSF受体在对于神经系统疾病起重要作用的不同脑区域中表达(图 4) ；GMCSF在起重要作用的不同脑区域中表达(图19)为系统地评估GCSF受体在正常小鼠脑中分布，通过腹腔注射Rompun 和 Ketanest ，麻醉C57/bl6小鼠(2-3个月大)。然后经颈动脉给小鼠灌注20ml Hank 氏平衡盐溶液(HBSS)，接着灌注20ml 4%低聚甲醛(PFA) PBS (pH 7. 4)溶液。将脑切开， 在2% PFA溶液中储存过夜。对石蜡包埋的组织切片(2 μ m)，置于预处理的载玻片(DAK0， Glostrup,Denmark)上，空气干燥过夜并随后去石蜡化。在微波处理后(柠檬酸盐缓冲液； 500W，10分钟)，应用抗GCSFR抗体(1 400)并在湿室中将组织于室温下温育1小时。按 制造商推荐(DAK0，Glostrup, Denmark)，使用常规ABC技术和作为一种色原体的DAB显影 抗体标记。阴性对照包括类似处理的切片，其中一级抗体已完全省略，并对切片使用了合适 的正常血清(Dianova，Hamburg, Germany)。可见GCSF-R定位于海马中(图4a_d)，在CA3 区中具有占优势的染色神经元(图4a，b)，在CA3和CA2区之间具有光滑边界(图4c，箭 头)。GCSF-R分布在体细胞和神经元突起上(图4b，箭头)。该受体存在于齿状回，的门和 基底细胞层中(图4d，箭头)。GCSF-受体也在皮层区中检测到例如在梨状皮层(图4e) 和鼻周皮层(f)中。在小脑中，浦肯野细胞被标记(图4g，箭头)。同样，嗅球中的一些大 僧帽细胞是GCSF-R阳性(图4h，箭头)。在脊髓前索中出现强染色(图4i，j)，通过高倍 放大鉴定了大运动神经元为GCSF-R阳性(图4k，1)。注意神经元突起被强力标记。在中 脑中，黑质中神经元显示了 GCSF-R阳性(图4m，η, ο)。除神经元外，白质束中少突胶质细 胞亦被染色，例如在前连合中(图4，ρ，箭头)。将相同的方法应用于GMCSFR的定位(图19)。于此，在海马、皮层、小脑和脉络丛
49中观察到染色。就中脑和脊髓而言，还未检查。实施例17 分析GCSF、GMCSF的神经保护作用(图lb，图23)在体外检测GCSF/GMCSF对NGF处理的PC12细胞的神经保护作用。将PC12细胞 接种在96孔培养板中，覆盖上聚L-赖氨酸(0. 01 %终浓度)，密度为40，000细胞/孔。细 胞在含IOOOmg葡萄糖/升和10 % HS (马血清)、5 % FCS (胎牛血清)、1 %青霉素/链霉素 的DMEM培养液中培养。然后，用PSV40-RL(编码renilla荧光素酶基因)转染细胞，按制 造商推荐使用 7 Lipofectamine 2000 转染剂(Gibco BRL) (0. 2 μ g DNA/ 孔)。在转染 后，立即添加浓度为40ng/ml的NGF(神经生长因子)来诱导PC12细胞的分化。在处理后 24小时，PC12细胞发育为具有伸出的突起的神经元样形态。然后，用不同浓度的H2O2 (图 lb，图23)及GCSF和GMCSF(l-100ng/ml)处理细胞。添加已知具有体外神经保护效力的 EPO作为阳性对照物(Cerami，等.(2002)，^phrol Dial Transplant, 17,8-12. ,Kawakami, 等.(2001)，J Biol Chem，276，39469-75.，Sinor 和 Greenberg (2000) ,Neurosci Lett, 290, 213-5.，Chong，等.(2002)，J Cereb Blood Flow Metab，22，503-14.)，浓度为 0. 01-1U/ ml (图lb)。24小时后，抛弃培养液上清液，用被动溶解缓冲液(Promega)裂解细胞。接着 在光度计(Mithras，BerthoId)中记录Renilla荧光素酶活性，读数表示为相对光单位。该 分析通过可检测的荧光素酶数量从而测定了细胞生存率。因此，越高的相对光单位，就有越 多的细胞生存。在该分析中，GCSF和GMCSF显示了对PC12细胞剂量依赖性神经保护作用， 较促红细胞生成素更有效。实施例18 血栓栓塞性脑缺血实验方案为地方伦理委员会所批准。40只重280_320g的雄性Wi star大鼠 (Charles River,Germany)随机分组如下A)在血栓性血管闭塞1小时后，用IOmg rt-PA/ 公斤体重进行早期溶栓1小时；B在血栓性血管闭塞3小时后，用IOmg rt-PA/公斤体重 进行晚期溶栓；C)不溶栓，但在血栓性局部缺血30分钟后，用溶于2ml 0.9%盐水中的
60 μ g/ 公斤体重的重组 G-CSF ( Neupogen ，Amgen, Europe B. V.，Netherlands)处理
90分钟；D)在血栓性局部缺血30分钟后，用溶于2ml 0. 9%盐水中的60 μ g/公斤体重的
重组 G-CSF( Neupogen ，Amgen, Europe B. V.，Netherlands)处理 90 分钟以及在血栓
性血管闭塞3小时后，用IOmg rt-PA/公斤体重进行晚期溶栓。可通过向腹膜内注射IOOmg/公斤体重的盐酸氯胺酮(WDT，Garbsen, Germany)麻 醉动物。如必要的话，麻醉可维持在50mg/公斤体重。可将PE-50聚乙烯导管插入右股动 脉用于平均动脉压、血气、血细胞比容、白细胞计数和和血糖水平的连续监测。可将PE-50 导管插入右股静脉用于处理注入物。在实验过程中，监测直肠温度并通过恒温控制加热垫 (Fohr Medical Instruments, Germany)维持在 37°C。可根据Busch等(Brain Res 1997Dec 5 ；778(1) 16-24)描述的改良方法诱导血 栓栓塞性中风。简言之，通过颈部中线切口暴露右颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)和颈外 动脉(ECA)。进一步的解剖鉴定了翼腭动脉(PPA)起源。通过6-0丝线缝合将ECA和PPA 永久地结扎起来。仅在形成栓塞时，临时结扎CCA。将导管插入ECA中最接近其结扎点的地 方，并注射如12个红血块(每块直径0. 35mm,长3mm)，在右大脑中动脉(MCA)产生栓塞。通过磁共振成像监测梗塞进展，可在1、2、4和24小时处通过使用扩散-、灌注-和T2-加权成像检测。在所有动物中，在局部缺血24小时后，基于五点量表可测定死亡率和神 经学结果。在局部缺血24小时后，用150mg/公斤体重氯胺酮麻醉大鼠并斩首。分离脑并 用4%低聚甲醛0. lmol/1磷酸缓冲液固定24小时。在石蜡包埋后，切下1 μ m厚切片用于 TTC、H&E和Nissl染色及免疫组化分析。统计学分析数值表示为均值士SD。在获取所有数据后，打乱随机编码。ANOVA法和在此之后 的Fisher保护的最小显著差数检验可用于测定诸如生理参数和梗塞体积的连续变量的统 计学差异显著性。可对诸如死亡率的非参数数据进行Marm-Whitney U检验。ρ值< 0. 05 被认为统计学显著。实施例19 当在延长的时间窗口给予时，在大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠中风模型 中G-CSF是有效的图24显示了当在局部缺血发作后120分钟，由静脉内给予G-CSF对大鼠MACO模 型梗塞体积的效果。该实验如实施例1所述进行，除了麻醉是通过吸入麻醉(1%氟烷、30% O2和70% N2O)进行外。同样于此，大鼠使用了 60 μ g G-CSF ( Neupogen AMGEN) /公 斤体重的剂量。当通过TTC染色比较梗塞体积时，观察到了明显的保护作用(参见图25)。 通过另一组研究者进行手术，如实施例1中的那些，证实了在另一实验室机构中的有效性。 该实施例进一步证实了 G-CSF用于治疗中风和其他神经系统中局部缺血病症的有效性。实施例20 =GCSF及其受体在脑中的共区域化使用的免疫组化方法通过使用二甲苯处理2次，每次5分钟，100%乙醇处理2次，每次分钟，接着用从 96%-70%递减浓度的乙醇处理石蜡包埋组织切片(2μπι)以去石蜡化。最后用蒸馏水洗 涤切片并用微波处理(柠檬酸盐缓冲液，600W，15分钟)(2u.m)were deparaffinated by treating them 2x 5min with Xylol, 2x 2。然后，用蒸馏水洗涤切片并在含0. 2% BSA的 Ix TBS (pH 7.4)中封闭抗原3次，每次5分钟。将GCSF-受体抗血清(SC694 ；Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA ； 1 100)在含 0. 2% BSA 的 Ix TBS(pH 7. 4)中稀 释，在湿室中于室温下温育1小时。接着用含0. 2% BSA的Ix TBS(pH 7. 4)洗涤切片3次， 每次2分钟。然后在含0.2% BSA的Ix TBS(pH 7.4)中于4°C下应用二级抗体(羊抗兔 Fab-FITC, dianova, 1 50)过夜。在用含 0. 2% BSA 的 IxTBS(pH 7. 4)洗涤切片 3 次，每 次分钟后，在室温下应用在含0.2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)中以1 100稀释的GCSF抗血 清(SC13102 ;SantaCruz Biotechnology, Santa Cruz，CA，USA) 1 小时。如前述洗涤 3 次切 片并与在含0.2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)中以1 200稀释的生物素化羊抗兔IgG (Vector Laboratories, USA)温育30分钟。在再次洗涤切片后，在室温下应用TRITC-缀合的抗生 物素蛋白链菌素(dianova ；1 200) 1. 5小时。接着，用Ix TBS洗涤切片3次，每次2分钟 并用在Ix TBS中以1 10000稀释的细胞核染料DAPI染色10分钟。最后用IxTBS洗涤 切片3次，每次2分钟并用荧光封固剂(Vectashield，VectorLaboratories，USA)包埋。使 用 Olympus 1X81 显微镜和“分析”软件包(Soft Imaging Systems, Stuttgart, Germany) 获得数码照片。所有的双荧光(double-fluorescence)试验通过平行的单染色进行对照，以控 制第二通道中不存在任何荧光携带污染。作为第二对照，对于二级抗体而言，所有的双荧光
51染色使用了改变的生色团。结果在海马(图25a_c齿状回，d_f门)和皮层(图25g_i)中GCSF受体(图25a，d， g)显示了与其配体(图25b，e，h)共区域化。令人惊奇地发现了相同的神经元既表达受体 也表达配体，暗示了 GCSF的自分泌信号机制，证实了神经系统新的内源性神经保护系统。实施例21 =GCSF受体和GMCSF受体在脑中的共区域化免疫组化方法如实施例20所述进行免疫组化。在用GCSFR抗血清和羊抗兔Fab-FITC与切片温 育后，用含0. 2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)洗涤切片3次，每次2分钟。然后，在室温下应用 GMCSFR 抗血清(SC690 ；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz, CA, USA ； 1 100)1 小时。 以下操作包括与生物素化羊抗兔IgG (Vector Laboratories, USA)及TRITC-缀合的抗生物 素蛋白链菌素(dianova;l 200)温育，如实施例2所述进行GCSF检测。所有的双荧光(double-fluorescence)试验通过平行的单染色进行对照，以控制 第二通道中不存在任何荧光携带污染。作为第二对照，对于二级抗体而言，所有的双荧光染 色使用了改变的生色团。结果GCSF受体(图26a，d，g)和GMCSF受体(图26b，e，h)表达在海马和皮层中相同 的神经元上(图26c，f，i)。图26显示了两种受体在海马齿状回(a-c)和门(d_f)及皮层 (g-i)的神经元上共表达。该发现进一步阐明了所要求保护的GCSF和GMCSF能联合用于治 疗神经系统疾病，并通过联合给予而增强造血因子神经保护特性。实施例22 =GCSF在神经元中通过激活stat3产生抗细胞凋亡活性结果初级培养的神经元是一种用于分析作用机理的根据。因此，我们检查了在培养 21天后G-CSF受体是否能在海马或皮层神经元上表达。实际上，我们通过PCR(前述实施 例)和免疫细胞化学证实了在皮层及海马神经元上皆有表达。在中风病理生理学中一个 最重要的机制是延迟的神经元细胞死亡(Choi (1996)，Curr Opin Neurobiol，6，667-72， Schneider,等·(1999)，Nat Med, 5, 554-9, Mattson (2000), Nat Rev MolCell Biol, 1, 120-9)。因此，我们假设G-CSF能干扰神经元中细胞凋亡级联。在初级神经元培养物中，在 我们发现表达G-CSF受体、暴露于氧化亚氮的脑缺血过程相关事件，导致了在程序性细胞 死亡中剂量依赖性增加，证据如PARP-裂解(未显示)。用50ng/ml G-CSF处理能急剧减 少了 N0R3处理后的细胞凋亡性细胞死亡，如图27所例证。在造血谱系细胞中，GM-CSF受 体通过Janus激酶2 (JAK2)、信号转导蛋白及反式作用蛋白(stat)传递其抗细胞凋亡信号 (Jak-stat 途径)(如(Epling-Burnette，等· (2001) ,J Immunol, 166, 7486-95, Sakamoto, 等.(2003)，Int J Hematol，77，60-70))。虽然我们无法通过statl或stat5的磷酸化 来检测激活作用(图27，部分III)，但在其他类型细胞中，通过以JAK-stat动力学的典 型时间依赖性方式添加G-CSF(图27，部分IV)可使stat3强磷酸化(图27，部分V，改用 并修改自:Kuroki, Μ.禾口 0' Flaherty, J. Τ. Extracellular signal-regulated protein kinase (ERK)-dependent and ERK-independent pathways target STAT3 onserine-727 in human neutrophils stimulated by chemotactic factors andcytokines. Biochem 52J 341 (Pt 3) ,691-6(1999))。添加G-CSF至培养液中诱发stat3酪氨酸705磷酸化是通 过G-CSF受体/JAK2途径特异性介导的，通过抑制剂AG490可阻断JAK2/stat3途径，导 致G-CSF存在的信号急剧减少(图X)。Stat3激活诱导了 bcl家族抗细胞凋亡蛋白产生 (Yoshida，等.(2002)，J Exp Med，196，641-53，Sakai and Kraft(1997),J Biol Chem，272， 12350-8，Nielsen，等· (1999)，Leukemia 13，735-8)。向神经元培养物添加 G-CSF 导致了脑 缺血期间神经元中有效的抗细胞凋亡蛋白——Bcl-Xl和Bcl-2时间依赖性增加(图27，部 分VI)。有趣的是，近来有报道提出stat3实质上是作为一种神经损伤后运动神经元残存蛋 白(Schweizer，等.(2002)，J Cell Biol，156，287-97)。因此，G-CSF 的作用似乎与所建议的 涉及stat5和NF-kB激活的EPO抗细胞凋亡机制不同(Digicaylioglu and Lipton (2001)， Nature,412,641-7)。方法来自大鼠的初级皮层神经元制备如下从大鼠胚ElO解剖获得10-12个皮层。 使用 10mg/ml 姨蛋白酶、5mg/ml EDTA/Dnase (Roche diagnostics, Mannheim, Germany) HBSS(Bioffhitakker, Taufkirchen, Germany)溶液解离该组织。使用含 Ix B-27 添加物 (Invitrogen, Karlsruhe, Germany)的四组分神经基础培养液停止该消化反应。离心后， 将沉淀溶解在5ml培养液中，在24孔培养板中培养细胞，密度为250，000细胞/孔，盖玻 片覆盖有聚-L-赖氨酸。培养液通常含有50ml神经基础培养液(life technologies, Karlsruhe，Germany)、Iml 添力口物 B 27 (Life technologies)、5μ 1 bFGF(Sigma，19 μ g 溶 解在 100 μ t IOmM Tris/HCl pH 7 中)和 50 μ 1 青霉素 / 链霉素(Life technologies)。通过蛋白质印迹检测STAT1、pSTATl、STAT5、pSTAT5、GCSFR、PARP，裂解的 PARP、半胱天冬酶3、裂解的半胱天冬酶3、Bcl2和，Bclxl0简言之，用所示的150mM N0R-3 (Sigma-Aid rich, Seelze, Germany)禾口 50ng/ml G-CSF (Neupogen, Amgen, Thousand Oaks, CA, USA)处理神经元24小时。从培养板上刮下细胞，以800转/分旋转5分钟，接 着在冰冷的含有2. 5mg/ml胃蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich，Seelze, Germany)和抑肽酶 (1 1000，Sigma-Aldrich)的PBS中洗涤。将沉淀重悬于100 μ 1的benzonase溶液中(含 10 μ 1 IOx PBS,79. 5 μ 1 H2OUOy 1 10%SDS,0. 5μ 1 IOOmM MgCl2、0. 1 μ 1 抑肽酶、0· 1 μ 1 亮肽酶素、0. 1 μ 1 胃蛋白酶抑制剂、0. 1 μ 1 PMSF和 0. 1 μ 1 benzonase (RocheDiagnostics, Mannheim, Germany))。增溶后，添加1体积PBS并测定蛋白质浓度(BCA-测试法，Pierce, Rockford, IL, USA)。在95°C变性5分钟，将IOOMg在8% -12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上 进行电泳。然后使用半干印迹盒(Whatman Biometra, G6ttingen, Germany)将蛋白质 转移至硝酸纤维素膜(Protan BA79, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)。用溶于 PBS/0. 02% Tween20的5%奶粉封闭印迹，并在4°C与各自的一级抗体(抗裂解的PARP-抗 体，Cell Signaling,l 1000 ；抗 PARP，Cell Signaling, 1 1000;抗裂解的半胱天 冬酶 3，CellSignaling，1 200 ；抗半胱天冬酶 3，Cell Signaling, 1 200;抗 Bcl2， BDTransduction Laboratories,1 500 ；抗 Bel XI, BD TransductionLaboratories, 1 500 ；抗 pSTAT3tyr，Cell Signaling, 1 500 ；抗 STAT3，Cell Signaling, 1 500 ； 抗 GCSFR, Santa Cruz, 1 200 ；抗 pSTAT5, Cell signaling, 1 500 ；抗 stat5, Cell signaling, 1 200 ；抗 pSTATl，Cellsignaling，1 500)温育过夜。洗涤后，将印迹与各 自的二级抗体(HRP-偶联的抗兔或抗小鼠抗血清，Dianova，Hamburg，Germany 1 4000)在室温温育1小时。使用超级信号化学发光系统(Pierce，Rockford, USA)并暴露于 HyperfiIm-ECL(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ,USA)中以检测信号。使用 Windows Image J vl. 29 (http //rsb. info. nih. gov/i j/index. Html)在扫描的放射自显 影照片上定量PARP裂解物。实施例23 通过脑缺血诱导GCSF及其受体脑缺血的MCAO模型如实施例1所述进行诱导局灶性脑缺血(MCA0，大脑中动脉闭塞)的操作。全脑缺血模型对随机动物进行的局部缺血/再灌注试验操作如前所详述(Brambrin k， 等· (2000)，J Cereb Blood Flow Metab，20，1425-36)。简言之，麻醉大鼠(水合氯醛)， 经口插管并机械通气(Pae()2为35-40mmHg，在试验全程中Paro2为95-110mmHg)。暴露两 侧颈总动脉(CCA)并用聚乙烯管(PE-50)插入左侧进行血液采样和MABP的连续监测 (Sirecust 310，Siemens, Danvers, MA, USA)。在右侧用尼龙线在CCA周围套一个松散的 圈，以便稍迟引发瞬时脑缺血。将动物的头部固定在立体定位架中用于EEG和CBF测量 法(详见(Brambrink, Schneider, Noga, Astheimer, Gotz, Korner, Heimann, Welschof 禾口 Kempski (2000), J Cereb Blood Flow Metab，20，1425-36))。通过正中切口暴露颅盖并制备 两个凹陷设计用于容纳经过氯化处理的银针EEG电极(高速牙钻，定位于左侧躯体感觉皮 层和额窦，依照Praxinos andWatson (1986) brain atlas)。除去右半球上约24mm2的颅骨， 使得骨层变薄(右侧1. 3-5. 3mm和距前因1. 5-7. 5mm枕骨)。将计算机驱动的显微操纵器所 控制的激光多普勒探头(波长780 μ m, BPM403A, TSIInc.，St. Paul, MN, USA)用于测定30 个位置的局部脑血流量(rCBF)，使用了 “扫描技术”(Soehle，等.(2000)，Acta Neurochir Suppl，76，181-4))。在对侧上(左侧3. 3-5. 3mm和距前囟5. 0-7. Omm枕骨)，一块更小的 (4mm2)窗口被确定用于测量局部脑血流量(ICBF)，使用了固定的激光多普勒探头(波长 780 μ m, BPM 2，VasamedicesInc.，St. Paul，MN，USA)。如前所述(Brambrink，等· (1999)， J Neurosci Methods，92，111-22)将温度探头置于右颞肌中、于左外耳道中和直肠6cm深 处。在整个实验过程中，将体中心温度(恒温控制加热毯)和颞肌温度(接近梗塞的热辐 射器)控制在37.5士0. 1°C。将动物下身置于密闭室中。通过电子调节的真空泵以建立低 压条件，因此以可控制方式(“低血压”)降低了动物的动脉血压(静脉混合集中)。在手 术稳定期后30分钟，通过拉连接有确定重量砝码的尼龙线，在右颈动脉附近产生血管闭塞 (通过置于左颈动脉的导管测量动脉压)，从而导致瞬时全脑缺血；同时使用低血压技术将 MABP减少到35mm Hg，.通过对1CBF、rCBF和EEG连续测量证实脑局部缺血。在全脑缺血 15分钟后，切断尼龙线并停止真空以允许再灌注。在CCA恢复90分钟后，拔去导管，闭合切 口并将动物从通风机上撤下。在拔管(约110分钟再灌注)及存在稳定的生命征象下，将 大鼠放回笼中并使用加热毯防止热量损失。定量PCR根据标准方案分离RNA (Chomczynski and Sacchi (1987), AnalBiochem, 162, 156-9)，然后通过Qiagen Rneasy 微型试剂盒纯化。组织样品分别取自全脑缺血后的大 鼠全脑和局灶性脑缺血后不同时间点同侧和对侧损伤位置。使用寡dT引物、superscript II逆转录酶(Gibco)和标准条件从10 μ g总RNA合成cDNA。使用具有SYBR-绿染色的DNA双链的 Ligbtcycler 系统(Roche Diagnostics,Mannheim, Germany)进行定量 PCR。循 环条件如下GCSFR :95°C 5分钟、95°C 5秒、66°C 10秒、72°C 30秒、84°C 10秒，进行50个 循环；GCSF :95°C 5分钟、95°C 5秒、64°C 10秒、72°C 30秒、88°C 10秒，进行50个循环。用 如下参数作出解链曲线95°C冷却至50°C ；以0.2°C/秒速度斜线上升至99°C。使用下列 引物对“大鼠 GCSFR-frag-32s”CCA TTG TCC ATC TTG GGG ATC(SEQ ID N0:42)，“大鼠 GCSFR-片段-265as”CCT GGA AGC TGT TGT TCCATG (SEQ ID NO :43)，“大鼠 GCSF_345s”CAC AGC GGG CTCTTC CTC TAC CAA (SEQ ID NO 44)和“大鼠 GCSF_862as”AGCAGC GGC AGG AAT CAA TAC TCG (SEQ ID NO :45)。按制造商推荐(Roche Diagnostics)，使用 SYBR 绿标准混 合物进行Lightcyder PCR。通过熔点分析和琼脂糖凝胶电泳确保产物特异性。将样 品的 cDNA 含量对 Cyclophilin 表达水平归一化(引物“cyc5”ACC CCACCG TGT TCT TCG AC (SEQ ID NO 46) ； “acyc300 "CATTTGCCATGGACAAGATG (SEQ ID NO :47))。相对调节水平源 自对cyclophilin的归一化，并与模拟手术动物比较。误差条显示了标准差，计算了 3倍连 续稀释的cDNA样品，反映了测量的可靠性。图28 (部分I和II) A显示了在同侧和对侧局灶性缺血2小时和6小时后GCSF具 有十分强的上调，而6小时后受体仅适度调节(图28B)。GCSF诱导表达并不特异于MCAO模型，虽然在全脑缺血中程度更低，但也能观察到 (图28C)。该发现支持了 G-CSF实际上是脑内源性神经保护配体及GCSF或GMCSF治疗是 利用神经保护作用的内源性效应的假说。实施例24 在皮层梗塞半影区中GCSF及其受体是上调的方法如上述实施例所述，实施光诱导血栓形成局部缺血模型的皮层局部缺血。免疫组化石蜡包埋组织的切片(2 μ m)去石蜡化并用微波处理(柠檬酸盐缓冲 液，500W, 10分钟)。然后，在室温下将切片与GCSF或GCSF-受体抗血清(SC13102或SC694 ； Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA ； 1 500)在湿室中温育 1 小时。使用 DAB作为色原体的ABC技术显影染色(DAK0，Glostrup, Denmark)。省略一级抗血清以制备 阴性对照。结果在光诱导血栓形成局部缺血6小时后，有明显证据表明在主要局部缺血损伤区 (“半影”)周围神经元染色增强了，如图29箭头所示，受体和配体皆然。该发现强调了这 一效应——即我们所揭开的新的神经系统内源性神经保护系统。其也强调了 GCSF在半影 区中起作用的主要机制实际上最可能是抗细胞凋亡。实施例25 :GCSFR和双皮质激素(doublecortin)在海马中的共区域化所使用的免疫组化方法如实施例2所述进行该实验。代替GCSF抗血清的是在含0. 2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)中以1 200稀释的豚鼠抗双皮质激素(DCX)多克隆抗体(Chemicon International, Germany)。在用含0. 2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)洗涤切片3次，每次2分钟后，将它们与 在含0.2%BSA的Ix TBS (pH 7. 4)中以1 200稀释的生物素化羊抗豚鼠IgG(Vector Laboratories, USA)温育30分钟。再次洗涤切片后，在室温下应用TRITC-缀合的抗生物 素蛋白链菌素(dianova;l 200) 1.5小时，以下方案描述于实施例21中。
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结果图30显示了在海马齿状回(a-f)和门(g_i)神经元上表达了 GCSF受体(a，d，g) 和双皮质激素(b，e, h)。G-CSF受体和未成熟神经元标记物双皮质激素(Jin，等.(2001)， Proc Natl Acad Sci USA, 98,4710-5 (图 30c，f, i)交迭表达暗示了 G-CSF 在神经元分化 初期的功能角色。实施例26 =GCSF诱导成体神经干细胞分化为神经元制备神经干细胞(NSCs)如实施例9所述制备大鼠成体神经干细胞。分别用如下GCSF浓度10ng/ml、100ng/ml和500ng/ml刺激来自脑室下区(SVZ) 的39DIV培养的神经球一次。4天后，添加重组人GCSF( NeupOgen ，Amgen，Europe B. V.，Netherlands)，收获细胞并分离RNA。未处理细胞作为对照。定量PCR按制造商方案，使用Qiagen Rneasy微型试剂盒分离SVZ的GCSF-处理和未处理的 神经球的RNA0使用寡dT引物、superscript II逆转录酶(Gibco)和标准条件从2 μ g总 RNA合成cDNA。使用具有SYBR绿染色的DNA双链的Lightcycler系统(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)进行定量PCR。循环条件如下Nestin 和 NSE (神经元特异性烯醇酶):95°C 3 分钟、95°C 5 秒、58°C 10 秒、72°C 30 秒、81°C 10秒，进行50个循环；β III-微管蛋白95°C3分钟、95°C5秒、65°C 10秒、72°C30 秒、87°C 10 秒，进行 50 个循环；PLP :95°C 3 分钟、95°C 5 秒、62°C 10 秒、72°C 30 秒、84°C 10 秒，进行 50 个循环；GFAP :95°C 3 分钟、95°C 5 秒、60°C 10 秒、72°C 30 秒、81°C 10 秒，进行 50 个循环。用如下参数作出解链曲线95°C冷却至50°C;以0.2°C /秒速度斜线上升至99°C。 使用了如下引物对“大鼠 nestin-(+)”AGG AAG AAG CTG CAG CAG AG(SEQ ID NO 48), “大鼠 nestin-(-) ”TTC ACC TGC TTG GGCTCT AT (SEQ ID NO :49)，“大鼠 NSE_(+) ”GGC AAG GAT GCCACT AAT GT (SEQ ID NO :50)，“大鼠 NSE-(-) ”AGG GTC AGCAGG AGAC TTG A (SEQ ID NO :510，“大鼠 β 111-微管蛋白-7168”0^ CCT ACG GGG ACC TCA ACC AC (SEQ ID NO :52)， “大鼠 β III-微管蛋白 _1022as”GAC ATG CGC CCA CGG AAG ACG(SEQID NO :53)，“ rat PLP-518s" TCA TTC TTT GGA GCG GGT GTG(SEQ ID NO :54)，“大鼠PLP_927as，，TAA GGA CGG CAA AGTTGT AAG TGG(SEQ ID NO :55)，“大鼠GFAP3' _1123s，，CCT TTCTTA TGC ATG TAC GGA G (SEQ ID NO :56)，“大鼠 GFAP3' _1245as，，GTA CAC TAA TAC GAA GGC ACT C (SEQ ID NO 57)。按制造商推荐(Roche diagnostics)，使用SYBR绿标准混合物进行Lightcycler PCR。 通过熔点分析和琼脂糖凝胶电泳确保产物特异性。将样品的cDNA含量对Cyclophilin的表 达水平归一化(引物“cyc5”ACC CCA CCG TGT TCT TCG AC (SEQ ID NO :58)，“acyc300”CAT TTG CCA TGG ACA AGA TG(SEQ ID N0:59))。相对调节水平源自对 cyclophilin 的归一 化，并与未处理的细胞进行比较。图31显示了在GCSF处理4天后，神经元标记物NSE和 β III-微管蛋白的强烈的和浓度依赖性上调。PLP和GFAP是依赖于GCSF浓度的适度调节。 误差条显示了标准差，计算了 3倍连续稀释的cDNA样品，反映了测量的可靠性。实施例27 在脑中GMCSF及其受体的共区域化使用的免疫组化方法通过使用二甲苯处理2次，每次5分钟，100%乙醇处理2次，每次5分钟，接着用从96%-70%递减浓度的乙醇处理石蜡包埋组织切片(2μπι)以去石蜡化。最后用蒸馏水洗 涤切片并用微波处理(柠檬酸盐缓冲液，600W，15分钟)。然后，用蒸馏水洗涤切片并在含 0. 2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)中封闭抗原3次，每次5分钟。将GMCSF-受体抗血清(SC690 ； Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA ； 1 100)在含 0. 2% BSA 的 Ix TBS(pH 7. 4)中稀释，在湿室中于室温下温育1小时。接着用含0. 2% BSA的Ix TBS(pH 7. 4)洗涤 切片3次，每次2分钟。然后在含0. 2% BSA的Ix TBS(pH 7. 4)中于4°C下应用二级抗体 (羊抗兔 Fab-FITC, dianova，1 50)过夜。在用含 0. 2% BSA 的 Ix TBS(pH 7. 4)洗涤切 片3次，每次分钟后，在室温下应用在含0.2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)中以1 100稀释的 GMCSF 抗血清(SC13101 ；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA) 1 小时。如前述 洗涤3次切片并与在含0.2% BSA的Ix TBS(pH 7.4)中以1 200稀释的生物素化羊抗兔 IgG(Vector Laboratories,USA)温育30分钟。在再次洗涤切片后，在室温下应用TRITC-缀 合的抗生物素蛋白链菌素(dianova;l 200) 1.5小时。接着，用Ix TBS洗涤切片3次，每 次2分钟并用在Ix TBS中以1 10000稀释的细胞核染料DAPI染色10分钟。最后用Ix TBS洗涤切片3次，每次2分钟并用荧光封固剂(Vectashield，Vector Laboratories, USA) 包埋。使用 Olympus 1X81 显微镜和“分析”软件包(Soft Imaging Systems, Stuttgart, Germany)获得数码照片。所有的双荧光(double-fluorescence)试验通过平行的单染色进行对照，以控制 第二通道中不存在任何荧光携带污染。作为第二对照，对于二级抗体而言，所有的双荧光染 色使用了改变的生色团。结果在齿状回(图32a_c)和门(图32d_f)及皮层(图32g_i)中的神经元上GMCSF 受体(图32a，d，g)和GMCSF(图32b，e, h)共区域化。这些数据支持了 GMCSF是自分泌配 体的观点。实施例28 通过脑缺血上调GMCSF及其受体脑缺血的MCAO模型用于诱导局灶性脑缺血(MCA0，大脑中动脉闭塞)的方法如实施例1所述。全脑缺血模型如前所述进行外科手术制备和瞬时全脑缺血。定量PCRRNA分离和cDNA合成按如前所述方案进行。循环条件如下GMCSFR :95°C 5分钟、 95°C 5 秒、62°C 10 秒、72°C 30 秒、80°C 10 秒，进行 50 个循环；GMCSF :95°C 5 分钟、95°C 5 秒、 600C 10秒、72°C30秒、81°C 10秒，进行50个循环。用如下参数作出解链曲线95°C冷却至 50°C;以0. 2V /秒速度斜线上升至99°C。使用了如下引物对大鼠GMCSFR"BR4-4s96”ACG TCG TTG GCT CAG TTATGT C (SEQ ID NO:60)，“BR4_4as272”ATT TAT GTC AGA GATGGA GGA TGG (SEQ ID NO :61)，“大鼠 GMCSF-723s”GGA GCTCTA AGC TTC TAG ATC (SEQ ID NO 62)和 “大鼠 GMCSF-908as，，GGC TCA ATG TGA TTT CTT GGG (SEQ ID NO :63)。按制造商推荐(Roche Diagnostics)，使用SYBR绿标准混合物进行Lightcycler PCR。通过熔点分析和琼脂 糖凝胶电泳确保产物特异性。将样品的cDNA含量对Cyclophilin表达水平归一化(引物 “cyc5，，ACC CCACCG TGT TCT TCG AC (SEQ ID NO 58) ； “ acyc300 "CATTTGCCATGGACAAGATG (SEQ ID N0:59))。相对调节水平源自对cyclophilin的归一化，并与模拟手术动物比较。误 差条显示了标准差，计算了 3倍连续稀释的cDNA样品，反映了测量的可靠性。在同侧和对侧局灶性缺血2小时和6小时后，图33A中显示了 GMCSF十分强烈的 上调。GMCSF的诱导可显示于全脑缺血中，虽然程度较小(图33B)。甚至在全脑缺血6小 时后，GMCSF受体仍轻微上调(图33C)。这些数据支持了 GMCSF是内源性神经保护机制一 部分的假说。实施例29 在海马中GCSFR和双皮质激素的共区域化表达所用的免疫组化方法如前所述进行该实验。代替GMCSF抗血清的是在含0. 2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4) 中以1 200稀释的豚鼠抗双皮质激素(DCX)多克隆抗体(Chemicon International, Germany)。在用含0. 2% BSA的Ix TBS (pH 7. 4)洗涤切片3次，每次2分钟后，将它们与 在含0.2%BSA的Ix TBS (pH 7. 4)中以1 200稀释的生物素化羊抗豚鼠IgG(Vector Laboratories, USA)温育30分钟。再次洗涤切片后，在室温下应用TRITC-缀合的抗生物 素蛋白链菌素(dianova ；1 200) 1. 5小时，以下方案描述如前。结果图34显示了在海马齿状回(a-c)和门(d_i)的神经元上表达了 GMCSF受体(a，d， g)和双皮质激素(b，e, h)。G-CSF受体和未成熟神经元标记物双皮质激素(Jin，Minami, Lan, Mao, Batteur, Simon and Greenberg(2001), Proc Natl Acad Sci USA,98,4710-5) (图34c，f，i)交迭表达暗示了 GMCSF在神经元分化初期的功能角色，并强调了 GMCSF对所 有神经系统退行性疾病的适用性，这里影响神经发生的可作为治疗的靶标，如中风、帕金森 氏症、ALS等。实施例30 =GMCSF诱导成体神经干细胞分化为神经元制备神经干细胞如实施例9所述制备大鼠成体神经干细胞。细胞每2-3周传代一次，在SOOxg离心 细胞5分钟，除去上清液并用Ix PBS洗涤一次。在重悬于Iml Accutase(Sigma)和在37°C 温育15分钟后，对细胞计数并在6孔培养板中培养，密度为1. 5-2. OxlO5细胞/孔。在第4 次传代后，用 10ng/ml GMCSF ( Leukine⑧,Berlex，Schering AG Germany)刺激源自海马 的神经干细胞，3天后收获细胞进行RNA分离。未处理的细胞作为对照。定量PCR按制造商推荐，使用Qiagen Rneasy微型试剂盒分离SVZ的GMCSF-处理和未处理 的神经球的RNA。使用寡dT引物、superscriptll逆转录酶(Gibco)和标准条件从5 μ g总 RNA合成cDNA。使用具有SYBR绿染色的DNA双链的Lightcycler系统(Roche Diagnostics, Mannheim,Germany)进行定量 PCR。Lightcycler PCR 的执行、用于 β III-微管蛋白、NSE、 PLP和GFAP的循环条件和引物对如前所述。相对调节水平源自对cyclophilin的归一化， 并与未处理的细胞进行比较。在图35A中神经干细胞的分化潜能和分化细胞的特异性标记 物表达如图解所示意。用lOng/ml GMCSF处理神经干细胞产生了明显诱导了 β III-微管 蛋白的表达(η = 3 ;ρ < 0. 05，双侧t检验)，对于NSE——一种成熟神经元标记物则程度 较小(图35B)。没有观察到PLP和GFAP表达水平的变化。该实施例强调了 GMCSF调节神 经发生的适用性。可用于体外产生分化的神经元，亦可影响内源性干细胞，并可适用于许多人类疾病，特别是神经变性疾病。实施例31 =G-CSF通过血脑屏障(BBB)在文献中获得最多的数据包括关于G-CSF及相关的细胞因子的血清水平信息。一 个对有效使用G-CSF无论以何种方法治疗神经系统病症的重要因素是蛋白质通过血脑屏 障(BBB)的能力。对该问题特别感兴趣，这是因为已知许多蛋白质药物无法通过血液和神 经元之间的天然边界。另一方面，已有几种蛋白质，包括像促红细胞生成素和粒细胞巨噬 细胞集落刺激因子(GM-CSF)的造血因子可通过BBB并有效地作用于CNS神经元(McLay， 等· (1997)，Brain, 120,2083-91.，‘ Brines，等· (2000)，Proc Natl Acad Sci USA, 97, 10526-31)。为证实G-CSF能通过血脑屏障，我们在大鼠脑中检验了已注射的G-CSF的情况。 因此，我们采用了非常灵敏的碘化测定法。G-CSF和BSA作为对照，通过Iodogen方法 (Sigma，Taufkirchen，Germany)用 131I (Amersham Biosciences，Freiburg Germany)进行 放身寸标记，并在 Sephadex G-25 (Amersham Biosciences, Freiburg Germany)柱上纯化。纯 化的蛋白与未标记的标准化合物共洗脱出来，当通过大小排阻层析分析时，具有的正确分 子量单峰。将放射标记的蛋白经尾部静脉注射入雌性Sprague-Dawley大鼠(250_300g)。 为了进行竞争性摄取研究，将冷蛋白与标记的化合物混合并共同注射。在解剖前不久用 Ronipun /iCetanest 麻醉大鼠并用ioomi盐水通过下腹主动脉灌注(在注射后ι、4和 24小时)以除去血液。将全脑与血液分离、吸干并称重。离心血液以获得血清。用Y-计数 器(LB 951G，Berthold, Germany)测定放射性强度，连同可注射的样品一起计算组织的％ ID/g。结果显示G-CSF存在于脑中并与白蛋白比较，随着时间过去通过血脑屏障增加了 4-5 倍。相较于1和4小时，在放射性标记的G-CSF注射后24小时提取的样品显示了增加的水 平(图36)。这些观察资料显示G-CSF由静脉内注射入血液中能通过BBB，并可主要地激活 CNS神经元上的特异性受体。测定了血清和脑中的放射性标记的G-CSF量，将脑/血清比率对时间作图。牛血 清白蛋白作为对照物使用。为避免脑组织的血污染，在解剖前用IOOml盐水灌注大鼠。实施例32 =GM-CSF通过血脑屏障(BBB)为显示GM-CSF能通过血脑屏障，如实施例31对G-CSF所述，我们将碘处理的 GM-CSF注射大鼠。该实验给出了类似的结果，在静脉内给予后，比较GM-CSF和存在于大鼠 脑中的白蛋白显示GM-CSF水平(脑/血清比率)高于白蛋白3-4倍。该数据证实了 GM-CSF 可通过血脑屏障(图37)。图37，测定了血清和脑中放射性标记的GM-CSF量，将脑/血清比率对时间作图。 牛血清白蛋白作为对照物使用。为避免脑组织的血污染，在解剖前用IOOml盐水灌注大鼠。实施例33 =G-CSF用于治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)G-CSF和GM-CSF有益于ALS治疗的想法源于两方面首先，在脊髓前角的大运动 神经元中都表达GCSF和GMCSF的受体和配体。其次，根据在ALS中细胞凋亡起效的证据 (Li，等.(2000) ,Science，288，335-9)，因此证实了 G-CSF通过抵抗细胞凋亡级联的部分作 用是十分吸引人的。最常使用的ALS小鼠模型是携带有SODl基因突变的转基因小鼠，业已 显示该SODl基因应对家族性人ALS负责。那些最通常使用的是SODl (G93A)转基因系。通 常，这些小鼠寿命降低并显示出不好运动的进展征兆，因此能容易地通过行为测试(如握力测试、旋转试验)进行评估。在这些小鼠中业已进行了许多对于治疗功效的测试，并对于 诸如利鲁唑(Riluzole)、二甲胺四环素(Minocycline)、卡尼汀(Carnitine)等的物质显示 出延寿活性。这些小鼠被认为在临床上可预测实用性，如利鲁唑(Riluzole)，唯一被批准用 于人的药物，在这些小鼠中具有保护效果，而BDNF却无法通过人体实验，因此不被批准。因 此，我们测试了是否G-CSF能延长预期寿命，或在ALS的SODl转基因小鼠中是否具有功能 性结果。SODl和野生型小鼠在出生后60天，皮下注射10 μ g/公斤体重的G-CSF或载体并 全程监测。该结果清楚表明在G-CSF处理组中具有更长寿命的趋势(图38A)，和改善的运 动功能(握力强度测试(图38B))，全过程中在几个测量点具有显著性。此外，在处理组中 具有增加重量的趋势。图38A :S0Dl-tg小鼠在出生后60天用10 μ g/公斤体重注射。在G-CSF处理的 SODl-tg小鼠中清楚表明具有延长预期寿命的趋势(实线对虚线)。在几个点上，差异达到显著。
图38B :S0Dl-tg小鼠在出生后60天用10 μ g/公斤体重注射。握力强度测试显示 了在G-CSF处理的SODl-tg小鼠中改善的运动强度(空心方形对空心三角形)。在几个点 上，差异达到显著。实施例34 =GCSF在帕金森氏症(PD)啮齿动物模型中的功效MPTP 模型通过使用神经毒素1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)业已开发出性能最 好的帕金森氏症(PD)模型。为研究GCSF在帕金森模型中的功效，我们给予8周大的雄性小 鼠MPTP。每组小鼠(η = 15)腹腔注射重复给予MPTP-HCl或盐水(每日一次，持续5天，浓 度为30mg/kg，5ml/kg)并皮下注射重复给予(每日一次，持续22天)缓冲液、GCSF(0. 03mg/ kg/ ；5ml/kg)或二甲胺四环素(45mg/kg ;5ml/kg)。当第一次给予GCSF时，在MPTP (或组 0的盐水)给予后立即进行，而二甲胺四环素则在其后30分钟给予，因为这两种化合物可 能互相作用。每组所有的动物在22天都被处死。直至该天，都一直在分析小鼠的运动活性 (加速旋转)并每日测定体重。此外，对每个脑进行具有电化学检测的HPLC分析用于测定 纹状体和伏核中多巴胺、3，4_ 二羟苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)浓度。然而，在该模型中神经保护药物作用最重要和最直接的参数是中毒后神经元的生 存率。因此，用每只动物的中脑切片进行酪氨酸(TH)免疫组化和TH-阳性神经元的立体定 量(Triarhou，等.(1988)，JNeurocytol，17，221-32)。结果表明GCSF处理组具有体重增加趋势(数据未显示)。此外，在加速旋转测试 后观察到运动活性的改善(数据未显示)。近来在小鼠中用MPTP诱导帕金森病的研究显 示在这些动物中二甲胺四环素阻止了黑质纹状体多巴胺能神经变性(Du，等.(2001)，Proc Natl Acad SciUSA，98，14669-74)。在我们研究中，我们选择了二甲胺四环素作为神经保护 化合物参照物用于确认我们的数据。用MPTP进行超过连续5天的亚急性处理，在黑质密部 中酪氨酸水解酶(TH)阳性神经元明显减少了(图39A)。用GCSF和二甲胺四环素处理显示 了抵抗TH阳性神经元黑质水平减少的相近功效(图39B)。此外，当多巴胺的纹状体水平减 少时，GCSF和二甲胺四环素显示了相近的治疗效果(图39B)，这里考虑到了多巴胺的代谢 物。实施例35 =GMCSF在帕金森氏症模型中的功效
MPTP 模型如所述对GCSF的研究，在如下研究中确定GMCSF在帕金森模型中功效(参见前述 实施例)。每组小鼠(η = 15)腹腔注射重复给予MPTP-HC1或盐水(每日一次，持续5 天，浓度为30mg/kg，5ml/kg)并皮下注射重复给予(每日一次，持续22天)缓冲液、 GMCSF(0. 03mg/kg/ ；5ml/kg)或二甲胺四环素(45mg/kg ；5ml/kg)。当第一次给予 GCSF 时， 在MPTP (或组0的盐水)给予后立即进行，而二甲胺四环素则在其后30分钟给予，因为这 两种化合物可能互相作用。每组所有的动物在22天都被处死。业已观察到在给予GMCSF后，增加了体重并具有加速旋转的运动活性改善，类似 于GCSF得分结果(数据未显示)。因此，当考虑TH阳性神经元的黑质水平时，GMCSF的疗 效可媲美于GCSF (图39B)。相较于GCSF，在给予GMCSF后纹状体多巴胺水平及其代谢物的 减少可抵消(数据未显示)。实施例36 =GCSF和GMCSF在大鼠帕金森氏症6_羟多巴胺(60HDA)模型中的功效如上所例证，在小鼠MPTP模型中GCSF和GMCSF具有强神经保护特性。强烈证明 了对人帕金森氏症的适用性，因为MPTP是一种毒素，其被发现是由于能引起人PD。一种用于研究造血因子对帕金森氏症功效的另外的模型是6-0HDA模型。该模型 是基于直接向黑质或纹状体中注射60HDA。该药物选择性积聚在多巴胺能神经元中并导致 这些细胞凋亡。在大鼠中，60HDA是一种有效的神经毒素，业已主要用于产生单侧损伤。可通 过测定响应安非他明或阿朴吗啡的旋转行为来评估多巴胺损耗程度(Ungerstedt 1971)。 能容易并很好地定量构成该模型主要优点的运动缺陷。除了行为参数外，也能测定免疫组 化后酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元纹状体水平和多巴胺水平，以及在HPLC分析后其代谢 物水平。60HDA可用于确定GCSF和GMCSF在PD大鼠模型中的功效。在成体Sprague-Dawley 大鼠(体重250g)向黑质或纹状体中定向注射2μ1 8yg的60HDA后，造成单侧损伤。在损 伤后，可每日皮下给予不同剂量的GCSF (0.03mg/kg;0. lmg/kg或其他)，持续2周。其他处 理组动物在注射60HDA后，立即在纹状体和黑质内给予单次剂量的GCSF或GMCSF (300 μ g/ kg)。对于MPTP模型研究而言，二甲胺四环素可作为神经保护参照物(每日一次，45mg/kg， 皮下注射)。用缓冲液处理的模拟手术动物和损伤动物用作为对照组。两周后，对损伤动物 进行旋转行为测试。大鼠皮下注射阿朴吗啡，置于滚笼中，记录1小时内对侧旋转数。使 用标准统计学测试比较每组动物的旋转数。在行为测试后，处死动物并对脑进行免疫化学 处理以分析TH-阳性神经元的总数并用HPLC测定多巴胺水平。实施例37 =GMCSF在神经元中通过激活stat3途径产生抗细胞凋亡活性如上已例证(实施例22)，GCSF能有效抑制初级神经元中细胞凋亡。我们猜想 GMCSF也可具有强的抗细胞凋亡作用机制。因此，如实施例22所例证对GMCSF进行相同类 型的实验。这里，应用于神经元的浓度为50ng GMCSF(Leukine，Immunex)/毫升培养液。图40，部分I显示了 GMCSF抑制PARP裂解，即特异性存在的细胞凋亡信号。通过 使用NO-供体N0R3诱导初级神经元中细胞死亡。图40，部分II显示了 GMCSF无法产生增加的STATl ( “pSTATl”)或 STAT5( “pSTAT5”)磷酸化，尽管蛋白自身在神经元中表达。图40，部分III A.显示了 GMCSF产生时间依赖性STAT3激活，即在GMCSF刺激
615分钟后达到最大。在60分钟，PSTAT3水平下降，低于初始水平，已知为来自造血系统细 胞的反应动力学。B.三次独立实验的定量。Cquantification of three independent experiments. C.通过磷酸化激活的STAT3可为JAK2抑制剂AG490所抑制。给予GMCSF5分 钟后，pSTAT3水平与抑制剂存在情况下的水平完全不同。图40，部分IV显示了 GMCSF强烈诱导stat3靶基因Bcl2和BclXl表达。已知这 些基因能抗细胞凋亡。该实验证实了 1.)在神经元上GMCSF具有抗细胞凋亡活性，2.)是通过stat3途径 介导的。因此，也证实了在神经元中使用stat3系统作为一种筛选工具用于发现新的神经 保护药物的可能性，包括新的GCSF或GMCSF模拟物。实施例38 =GMCSF在啮齿动物中风模型中减小梗塞体积我们在大部分人公认的大鼠中风模型——大脑中动脉闭塞模型(MACO)中使用 GMCSF进行实验。原则上，该实验如实施例1和19例示来进行。简言之，使用吸入麻醉法(氟烷/ N20/02)来麻醉雄性Wistar大鼠。暴露颈动脉，并将带涂层的尼龙丝插入颈总动脉中，前进至其阻塞血流产生MCA 为止。通过激光多普勒血流仪监测细丝的正确位置。在闭塞90分钟后，取出细丝以容许 再灌注。在局部缺血发作30分钟或3小时后，通过输液泵向静脉内导管(股静脉)给予大 鼠250 μ g/公斤体重剂量的GMCSF(Leukine，Immunex)，时间大约为20分钟。使用TTC-染 色的标准方法和以计算机为基础的容量分析法在24小时后测定梗塞体积。图41证实了在GMCSF处理的动物中梗塞体积明显减少，不但在早期(图41，部分 I)，而且也在3小时的窗口晚期(图41，部分II)。一般而言，该实验例证了 GMCSF对于神 经变性病症的适用性，具体而言，针对中风治疗的适用性。所有于此引用的参考文献，包括专利、专利申请合出版物的全部内容并入作为参考。显而易见，根据上述教导本发明众多的修饰和变化是可能的。因此，应当理解在附 加的权利要求范围内，本发明可以不同于本文中所述特定方式的其他方式来实施。综上，本发明可涉及如下方面1. 一种治疗哺乳动物神经系统疾病的方法，该方法包括给予哺乳动物足够量的造 血因子来治疗神经系统疾病，所述造血因子选自GMCSF、GMCSF衍生物、GCSF, GCSF衍生物 和它们的组合物。2.方案1的方法，其中所述神经系统疾病选自具有涉及局部缺血病理生理机制 的神经系统疾病、具有涉及缺氧病理生理机制的神经系统疾病、神经变性疾病和伴随神经 细胞死亡的神经系统疾病。3.方案1的方法，其中神经系统疾病是具有涉及局部缺血或缺氧病理生理机制的 神经系统疾病。4.方案3的方法，其中具有涉及局部缺血或缺氧病理生理机制的神经系统疾病是 中风。5.方案1的方法，进一步包含给予一种或多种附加的造血因子。6.方案1的方法，其中神经系统疾病是精神病。
7.方案6的方法，其中精神病是抑郁症。
8.方案1的方法，其中神经系统疾病是痴呆或多发性硬化症。
9.方案8的方法，其中附加的造血因子选自巨噬细胞刺激因子、白介素和促红细胞生成素D
10.方案9的方法，其中将GCSF和促红细胞生成素给予哺乳动物。
11.方案1的方法，其中神经系统疾病是由手术操作过程中心脏停搏或脑缺血引起的中风、帕金森氏症、肌萎缩性侧索硬化、神经外伤、脑缺血。
12.方案的方法，其中造血因子是GCSF或GCSF衍生物。
13.方案的方法，其中造血因子是GMCSF或GMCSF衍生物。
14.方案的方法，其进一步包含给予血流动力学活性化合物。
15.方案的方法，其进一步包含给予哺乳动物组织纤维蛋白溶酶原激活剂。
16.方案的方法，其进一步包含给予帮助通过血脑屏障的药剂。
17.方案的方法，进一步包含给予抗细胞凋亡剂。
18.方案5的方法，其中神经系统疾病是中风。
19.方案0的方法，进一步包含给予哺乳动物组织纤维蛋白溶酶原激活剂。
20.方案的方法，其中造血因子是人因子或衍生自人因子。
21.方案的方法，其中哺乳动物是人。
22.方案的方法，其中造血因子通过一种或多种方式给予，所述方式选自直接
大脑内注射、由静脉内、动脉内、经口和皮下。23.方案1的方法，其中给予造血因子包含给予多核苷酸，其当在哺乳动物中给予 时，表达足够治疗神经系统疾病量的造血因子。24.方案23的方法，其中多核苷酸与病毒载体或脂质体给予。25. 一种治疗哺乳动物神经系统疾病的方法，包含将神经干细胞组合物与造血因 子接触，所述造血因子选自GMCSF、GMCSF衍生物、GCSF、GCSF衍生物和它们的组合物；随后 将神经干细胞给予有需要的哺乳动物。26.方案25的方法，其中所述神经系统疾病选自具有涉及局部缺血病理生理机 制的神经系统疾病、具有涉及缺氧病理生理机制的神经系统疾病、神经变性疾病和伴随神 经细胞死亡的神经系统疾病。27.方案26的方法，具有涉及局部缺血或缺氧病理生理机制的神经系统疾病。28.方案27的方法，其中具有涉及局部缺血或缺氧病理生理机制的神经系统疾病 是中风。29.方案25的方法，其中神经系统疾病是精神病。30.方案29的方法，其中精神病是抑郁症。31.方案25的方法，其中神经系统疾病是痴呆或多发性硬化症。32.方案25的方法，进一步包含将神经干细胞组合物与一种或多种附加的造血因 子接触。33.方案32的方法，其中附加的造血因子选自巨噬细胞刺激因子、白介素和促红 细胞生成素。34.方案33的方法，其中将神经干细胞组合物与GCSF和促红细胞生成素接触。
35.方案25的方法，其中由手术操作过程中心脏停搏或脑缺血引起的神经系统疾 病是中风、帕金森氏症、肌萎缩性侧索硬化、神经外伤、脑缺血。36.方案25的方法，其中造血因子是GCSF或GCSF衍生物。37.方案25的方法，其中造血因子是GMCSF或GMCSF衍生物。38.方案25的方法，其中造血因子是人因子或衍生自人因子。39.方案25的方法，其中哺乳动物是人。40.方案25的方法，其中神经干细胞组合物包含人神经干细胞。41. 一种用于鉴定与神经元细胞上粒细胞集落刺激因子受体结合的化合物的方 法，所述化合物激活神经元细胞中的STAT，包含将神经元细胞与化合物接触；并相对于不 与该化合物接触的神经元细胞中STAT激活作用，测定STAT激活作用的增加，其中STAT激 活作用的增加表明化合物与神经元细胞上粒细胞集落刺激因子受体结合。42.方案41的方法，其中STAT基因是STAT-3。43.方案41的方法，其中STAT基因是STAT-5。44. 一种根据方案41的方法鉴定的化合物。45. 一种治疗哺乳动物神经系统疾病的方法，该方法包括给予哺乳动物足够治疗 神经系统疾病量的方案44的化合物。46.方案45的方法，其中所述神经系统疾病选自具有涉及局部缺血病理生理机 制的神经系统疾病、具有涉及缺氧病理生理机制的神经系统疾病、神经变性疾病和伴随神 经细胞死亡的神经系统疾病。47.方案46的方法，其中所述神经系统疾病是具有涉及局部缺血病理生理机制的 神经系统疾病。48.方案47的方法，其中具有涉及局部缺血或缺氧病理生理机制的神经系统疾病 是中风。49.方案45的方法，其中神经系统疾病是精神病。50.方案49的方法，其中精神病是抑郁症。51.方案45的方法，其中神经系统疾病是痴呆或多发性硬化症。52.方案48的方法，其进一步包含给予哺乳动物组织纤维蛋白溶酶原激活剂。53.方案45的方法，进一步包含给予一种或多种附加的造血因子。54.方案53的方法，其中附加的造血因子选自巨噬细胞刺激因子、白介素和促红 细胞生成素。55.方案45的方法，其进一步包含给予血流动力学活性化合物。56.方案45的方法，其进一步包含给予帮助通过血脑屏障的药剂。57.方案45的方法，其进一步包含给予抗细胞细胞凋亡剂。58.方案45的方法，其中哺乳动物是人。59.方案45的方法，其中化合物通过一种或多种方式给予，所述方式选自直接大 脑内注射、由静脉内、动脉内、经口和皮下。60.方案45的方法，其中神经系统疾病是由手术操作过程中心脏停搏或脑缺血引 起的中风、帕金森氏症、肌萎缩性侧索硬化、神经外伤、脑缺血。61. 一种用于鉴定与神经元细胞上粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体结合和/或激活神经元细胞中STAT基因表达的化合物的方法，该方法包括将神经元细胞与化合物接 触；并相对于不与该化合物接触的神经元细胞中STAT基因激活，测定STAT激活增加，其中 STAT激活增加表明化合物与神经元细胞上粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体结合。62.方案61的方法，其中STAT基因是STAT-3。63.方案61的方法，其中STAT基因是STAT-5。64. 一种根据方案61的方法鉴定的化合物。65. 一种治疗哺乳动物神经系统疾病的方法，该方法包括给予哺乳动物足够治疗 神经系统疾病量的方案64的化合物。66.方案65的方法，其中所述神经系统疾病选自具有涉及局部缺血病理生理机 制的神经系统疾病、具有涉及缺氧病理生理机制的神经系统疾病、神经变性疾病和伴随神 经细胞死亡的神经系统疾病。67.方案66的方法，其中神经系统疾病是具有涉及局部缺血或缺氧病理生理机制 的神经系统疾病。68.方案67的方法，其中具有涉及局部缺血病理生理机制的神经系统疾病是中 风。69.方案67的方法，其中神经系统疾病是精神病。70.方案69的方法，其中精神病是抑郁症。71.方案57的方法，其中神经系统疾病是痴呆或多发性硬化症。72.方案68的方法，其进一步包含给予哺乳动物组织纤维蛋白溶酶原激活剂。73.方案65的方法，进一步包含给予一种或多种附加的造血因子。74.方案73的方法，其中附加的造血因子选自巨噬细胞刺激因子、白介素和促红 细胞生成素。75.方案65的方法，其中哺乳动物是人。76.方案65的方法，其中化合物通过一种或多种方式给予，所述方式选自直接大 脑内注射、由静脉内、动脉内、经口和皮下。77. 一种用于鉴定具有改善的GCSF受体激动剂活性的化合物的方法，该方法包括 将该化合物与具有GCSF受体的神经细胞接触，测定该化合物对神经细胞的神经保护效果， 并将该化合物与GCSF比较所述效果，其中相对于GCSF的效果，该化合物具有更高的神经保 护效果，表明了该化合物具有改善的GCSF受体激动剂活性。78. 一种根据方案77的方法鉴定的化合物。79. 一种治疗哺乳动物神经系统疾病的方法，该方法包括给予哺乳动物足够治疗 神经系统疾病量的方案78的化合物。80.方案79的方法，其中所述神经系统疾病选自具有涉及局部缺血病理生理机 制的神经系统疾病、具有涉及缺氧病理生理机制的神经系统疾病、神经变性疾病和伴随神 经细胞死亡的神经系统疾病。81.方案79的方法，其中神经系统疾病是具有涉及局部缺血病理生理机制的神经 系统疾病。82.方案81的方法，其中具有涉及局部缺血病理生理机制的神经系统疾病是中 风。
83.方案79的方法，其中神经系统疾病是精神病。84.方案83的方法，其中精神病是抑郁症。85.方案79的方法，其中神经系统疾病是痴呆或多发性硬化症。86.方案81的方法，其进一步包含给予哺乳动物组织纤维蛋白溶酶原激活剂。87.方案79的方法，进一步包含给予一种或多种附加的造血因子。88.方案87的方法，其中附加的造血因子选自巨噬细胞刺激因子、白介素和促红 细胞生成素。89.方案79的方法，其中哺乳动物是人。90.方案79的方法，其中化合物通过一种或多种方式给予，所述方式选自直接大 脑内注射、由静脉内、动脉内、经口和皮下。91.方案79的方法，其中神经系统疾病是由手术操作过程中心脏停搏或脑缺血引 起的中风、帕金森氏症、肌萎缩性侧索硬化、神经外伤、脑缺血。92. 一种用于鉴定具有改善的GCSF受体激动剂活性的化合物的方法，该方法包括 将该化合物与具有GCSF受体的神经细胞接触，比较在该神经细胞和另一与GCSF接触的神 经细胞中STAT基因表达水平，其中相对于在所述另一神经细胞中STAT激活，在与该化合物 接触的神经细胞中STAT激活增加，表明该化合物具有改善的GCSF受体激动剂活性。93.方案92的方法，其中STAT激活是STAT3和STAT5激活的任一或两者。94. 一种根据方案92的方法鉴定的化合物。95. 一种治疗哺乳动物神经系统疾病的方法，该方法包括给予哺乳动物足够治疗 神经系统疾病量的方案94的化合物。96.方案95的方法，其中所述神经系统疾病选自具有涉及局部缺血病理生理机 制的神经系统疾病、具有涉及缺氧病理生理机制的神经系统疾病、神经变性疾病和伴随神 经细胞死亡的神经系统疾病。97.方案95的方法，其中神经系统疾病是具有涉及局部缺血或缺氧病理生理机制 的神经系统疾病。98.方案97的方法，其中具有涉及局部缺血或缺氧病理生理机制的神经系统疾 病是中风。99.方案95的方法，其中神经系统疾病是精神病。100.方案99的方法，其中精神病是抑郁症。101.方案95的方法，其中神经系统疾病是痴呆或多发性硬化症。102.方案95的方法，其进一步包含给予哺乳动物组织纤维蛋白溶酶原激活剂。103.方案95的方法，进一步包含给予一种或多种附加的造血因子。104.方案103的方法，其中附加的造血因子选自巨噬细胞刺激因子、白介素和促 红细胞生成素。105.方案95的方法，其中哺乳动物是人。106.方案95的方法，其中化合物通过一种或多种方式给予，所述方式选自直接 大脑内注射、由静脉内、动脉内、经口和皮下。107.方案95的方法，其中神经系统疾病是由手术操作过程中心脏停搏或脑缺血 引起的中风、帕金森氏症、肌萎缩性侧索硬化、神经外伤、脑缺血。
108. 一种提高移植入哺乳动物细胞生存率的方法，该方法包括将一种或多种编码 造血因子的多核苷酸导入该细胞，所述造血因子选自GMCSF、GMCSF衍生物、GCSF, GCSF衍 生物和它们的组合，其中相对于在导入所述一种或多种多核苷酸前的细胞生存率，该细胞 以足以提高细胞生存率的量表达所述造血因子。109.方案108的方法，其中细胞进一步表达并分泌一种或多种附加的造血因子。110.方案109的方法，其中附加的造血因子选自巨噬细胞刺激因子、白介素和促 红细胞生成素。111.方案108的方法，其中造血因子是GCSF或GCSF衍生物。112.方案108的方法，其中造血因子是GMCSF或GMCSF衍生物。113.方案108的方法，其中哺乳动物是人。114.方案108的方法，其中细胞是神经细胞。115.方案114的方法，其中神经细胞是神经干细胞。116.方案114的方法，其中细胞是干细胞。117.方案108的方法，其中细胞进一步表达GCSF受体和GMCSF受体的一种或两 种。118.方案108的方法，其中细胞移植入哺乳动物神经组织。119. 一种提高神经细胞培养物生存力的方法，该方法包括相对于在与造血因子接 触前该培养物，将该神经细胞培养物与足以提高该神经细胞培养物生存力的量的造血因子 接触，所述造血因子选自GMCSF、GMCSF衍生物、GCSF, GCSF衍生物和它们的组合物。120.方案119的方法，其中神经细胞培养物包含神经干细胞。121. 一种提高神经细胞培养物生存力的方法，该方法包括将一种或多种多核苷酸 导入该神经细胞培养物的细胞中，其中多核苷酸表达的造血因子选自GMCSF、GMCSF衍生 物、GCSF, GCSF衍生物和它们的组合物，和其中相对于与造血因子接触前的该培养物，多核 苷酸表达足以提高该神经细胞培养物生存能力的量的造血因子。122.方案121的方法，其中多核苷酸与病毒载体或脂质体给予。123. 一种用于提高在危急中哺乳动物认知能力的方法，该方法包括相对于在给 予前的哺乳动物，给予足以提高哺乳动物认知能力的量的造血因子，所述造血因子选自 GMCSF, GMCSF衍生物、GCSF、GCSF衍生物和它们的组合物。124.方案123的方法，其中哺乳动物是人。125. 一种鉴定增加脑中粒细胞刺激因子和粒细胞巨噬细胞刺激因子至少之一的 内源性水平的化合物的方法，该方法包括将神经元细胞与该化合物接触；和相对于没有与 该化合物接触的神经元细胞中的该水平，测定粒细胞刺激因子、粒细胞巨噬细胞刺激因子 或两者增加的水平，其中在粒细胞刺激因子、粒细胞巨噬细胞刺激因子或两者中增加，表明 化合物能增加神经元细胞中粒细胞刺激因子、粒细胞巨噬细胞刺激因子或两者的内源性水 平。126. 一种根据方案125的方法鉴定的化合物。127. 一种治疗神经系统疾病的方法，该方法包括给予哺乳动物足够治疗该神经系 统疾病的量的方案126的化合物。128.方案127的方法，其中哺乳动物是人。
序列表
<110>SCHNEIDER, ARMIN
SCHAEBITZ, WOLF-RUEDIGER
KOLLMAR, RAINER
SCHWAB, STEFAN
<120>使用造血生长因子治疗神经系统疾病的方法
<130>229530US
<160>65
<170>PatentIn 3. 2 版
<210>1
<211>70
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>计算机产生的契合序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(2). . (5)
<223>Xaa是任意氨基酸
<220>
<22l>misc_feature
<222>(6). . (41)
<223>Xaa是任意氨基酸
<220>
<22l>misc_feature
<222>(33). . (41)
<223>可能存在或不存在
<220>
<22l>misc_feature
<222>(46). . (46)
<223>Xaa可以是任意氨基酸
<220>
<22l>misc_feature
<222>(47). . (49)
<223>Xaa是任意氨基酸
<220>
<22l>misc_feature
<222>(47). . (49)
<223>氨基酸可以存在或不存在
<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223> 合成 DNA<400>8cctggaagct gttgttccat g21<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223> 合成 DNA<400>9accccaccgt gttcttcgac20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223> 合成 DNA<400>10catttgccat ggacaagatg20<210>11<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽序列<400>11Leu Gly His Ser Leu Gly Ile15<210>12<211>39<212>DNA<213>人工序列
<220>
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cgggatccgg gaccgcgtat ctgatgacga
<210>13
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<212>DNA
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<223> 合成 DNA
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ctcggagacg ctgaggaagg acctg
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成 DNA
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ctgcggccct agaccacgcc caccgctccc
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成 DNA
<400>15
acgtcgttgg ctcagttatg tc
<210>16
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 合成 DNA
<400>16
atttatgtca gagatggagg atgg
<210>17
<211>20
<212>DNA
gcgtgtcaa39
25
cgtgacgtcg40
22
72
<213>人工序列<220><223> 合成 DNA<400>17accccaccgt gttcttcgac<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223> 合成 DNA<400>18cBtttgccBt ggacaagatg<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223> 合成 DNA<400>19acgtcgttgg ctcagttatg tc<210>20<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223> 合成 DNA<400>20atttatgtca gagatggagg atgg<210>21<211>177<212>DNA<213> 家鼠<400>21acgtcgttggctcacagggactgtggccct<210>22<211>400
20
20
22
24
ctcagttatg tcagacagga aatctcacca tcccacaatg attgacagct atcccgcctc cgctgggacc aattgacatc acggacagga atacccgccc gatgggcagg tcctgcctgg ctcccatcct ccatctctga cataaat
60 120 1770795]<212>PRT0796]<213>智人0797]<400>220798]MetLeuLeuLeuValThrSerLeuLeuLeuCysGluLeuProHisPro0799]1510150800]AlaPheLeuLeulieProGluLysSerAspLeuArgThrValAlaPro0801]2025300802]AlaSerSerLeuAsnValArgPheAspSerArgThrMetAsnLeuSer0803]3540450804]TrpAspCysGlnGluAsnThrThrPheSerLysCysPheLeuThrAsp0805]5055600806]LysLysAsnArgValValGluProArgLeuSerAsnAsnGluCysSer0807]657075800808]CysThrPheArgGlulieCysLeuHisGluGlyValThrPheGluVal0809]8590950810]HisValAsnThrSerGlnArgGlyPheGlnGlnLysLeuLeuTyrPro0811]1001051100812]AsnSerGlyArgGluGlyThrAlaAlaGlnAsnPheSerCysPhelie0813]1151201250814]TyrAsnAlaAspLeuMetAsnCysThrTrpAlaArgGlyProThrAla0815]1301351400816]ProArgAspValGlnTyrPheLeuTyrlieArgAsnSerLysArgArg0817]1451501551600818]ArgGlulieArgCysProTyrTyrlieGlnAspSerGlyThrHisVal0819]1651701750820]GlyCysHisLeuAspAsnLeuSerGlyLeuThrSerArgAsnTyrPhe0821]1801851900822]LeuValAsnGlyThrSerArgGlulieGlylieGlnPhePheAspSer0823]1952002050824]LeuLeuAspThrLysLyslieGluArgPheAsnProProSerAsnVal0825]2102152200826]ThrValArgCysAsnThrThrHisCysLeuValArgTrpLysGlnPro0827]2252302352400828]ArgThrTyrGlnLysLeuSerTyrLeuAspPheGlnTyrGlnLeuAsp0829]2452502550830]ValHisArgLysAsnThrGlnProGlyThrGluAsnLeuLeulieAsn0831]2602652700832]ValSerGlyAspLeuGluAsnArgTyrAsnPheProSerSerGluPro0833]275280285
ArgAlaLysHisSerValLyslieArgAlaAlaAspValArglieLeu
290295300
AsnTrpSerSerTrpSerGluAlalieGluPheGlySerAspAspGly
305310315320
AsnLeuGlySerValTyrlieTyrValLeuLeulieValGlyThrLeu
325330335
ValCysGlylieValLeuGlyPheLeuPheLysArgPheLeuArglie
340345350
GlnArgLeuPheProProValProGlnlieLysAspLysLeuAsnAsp
355360365
AsnHisGluValGluAspGlulielieTrpGluGluPheThrProGlu
370375380
GluGlyLysGlyTyrArgGluGluValLeulieValLysGlulieThr
385390395400
<210>23
<211>388
<212>PRT
<213> 小鼠
<400>23
MetThrSerSerHisAlaMetAsnlieThrProLeuAlaGlnLeuAla
151015
LeuLeuPheSerThrLeuLeuLeuProGlyThrGlnAlaLeuLeuAla
202530
ProThrThrProAspAlaGlySerAlaLeuAsnLeuThrPheAspPro
354045
TrpThrArgThrLeuThrTrpAlaCysAspThrAlaAlaGlyAsnVal
505560
ThrValThrSerCysThrValThrSerArgGluAlaGlylieHisArg
65707580
ArgValSerProPheGlyCysArgCysTrpPheArgArgMetMetAla
859095
LeuHisHisGlyValThrLeuAspValAsnGlyThrValGlyGlyAla
100105110
AlaAlaHisTrpArgLeuSerPheValAsnGluSerAlaAlaGlySer
115120125
GlyAlaGluAsnLeuThrCysGlulieArgAlaAlaArgPheLeuSer
130135140
CysAlaTrpArgGluGlyProAlaAlaProAlaAspValArgTyrSer
145150155160
75
<212>PRT
<213>家鼠
<400>25
AlaProThrArgSerProAsnProValThrArgProTrpLysHisVal
151015
AspAlalieLysGluAlaLeuSerLeuLeuAsnAspMetArgAlaLeu
202530
GluAsnGluLysAsnGluAspValAsplielieSerAsnGluPheSer
354045
IleGlnArgProThrCysValGlnThrArgLeuLysLeuTyrLysGln
505560
GlyLeuArgGlyAsnLeuThrLysLeuAsnGlyAlaLeuThrMetlie
65707580
AlaSerHisTyrGlnThrAsnCysProProThrProGluThrAspCys
859095
GlulieAspValThrThrPheGluAspPhelieLysAsnLeuLysGly
100105110
PheLeuPheAsplieProPheAspCysTrpLysProValGlnLys
115120125
<210>26
<211>141
<212>PRT
<213> 小鼠
<400>26
MetTrpLeuGlnAsnLeuArgLeuLysliePheGluGlnGlyLeuArg
151015
GlyAsnPheThrLysLeuLysGlyAlaLeuAsnMetThrAlaSerTyr
202530
TyrGlnThrTyrCysProProThrProGluThrAspCysGluThrGln
354045
ValThrThrTyrAlaAspPhelieAspSerLeuLysThrLeuPheLeu
505560
GlylieValValTyrSerLeuSerAlaProThrArgSerProliePhe
65707580
LeuThrAsplieProPheGluCysLysLysProGlyGlnLysThrVal
859095
ThrArgProTrpLysHisValGluAlalieLysGluAlaLeuAsnLeu
100105110
LeuAspAspMetProValThrLeuAsnGluGluValGluValValSer
115120125
Asn Glu PheSerPheLysLysLeuThrCysValGlnThr
130135140
<210>27
<211>144
<212>PRT
<213>智人
<400>27
Met Trp LeuGlnSerLeuLeuLeuLeuGlyThrValAlaCysSerlie
151015
Ser Ala ProAlaArgSerProSerProSerThrGlnProTrpGluHis
202530
Val Asn AlalieGlnGluAlaArgArgLeuLeuAsnLeuSerArgAsp
354045
Thr Ala AlaGluMetAsnGluThrValGluVallieSerGluMetPhe
505560
Asp Leu GlnGluProThrCysLeuGlnThrArgLeuGluLeuTyrLys
65707580
Gln Gly LeuArgGlySerLeuThrLysLeuLysGlyProLeuThrMet
859095
Met Ala SerHisTyrLysGlnHisCysProProThrProGluThrSer
100105110
Cys Ala ThrGlnlielieThrPheGluSerPheLysGluAsnLeuLys
115120125
Asp Phe LeuLeuVallieProPheAspCysTrpGluProValGlnGlu
130135140
<210>28
<211>207
<212>PRT
<213>智人
<400>28
Met Ala GlyProAlaThrGlnSerProMetLysLeuMetAlaLeuGln
151015
Leu Leu LeuTrpHisSerAlaLeuTrpThrValGlnGluAlaThrPro
202530
Leu Gly ProAlaSerSerLeuProGlnSerPheLeuLeuLysCysLeu
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权利要求
GCSF或编码GCSF的多核苷酸在制备用于治疗哺乳动物中具有涉及局部缺血或缺氧病理生理机制的神经系统疾病的药物组合物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述疾病是中风。
3.如权利要求1或2中任一项所述的用途，其中所述哺乳动物是人受试者。
4.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述GCSF是人GCSF或衍生自人GCSF。
5.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述治疗在局部缺血损伤后1-7天开始。
6.如权利要求5所述的用途，其中所述治疗在局部缺血事件后持续至少2周.
7.如权利要求1-6中任一项所述的用途，其中所述治疗至少在齿状回中刺激成体干细 胞的神经发生。
全文摘要
本发明涉及一种通过给予诸如粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)的造血生长因子治疗哺乳动物神经系统疾病的方法。本发明也提供了用于筛选与神经元细胞表面发现的GCSF或GMCSF受体结合的化合物的方法；所述化合物提供了神经保护、神经增殖和/或STAT基因激活活性。
文档编号G01N33/50GK101926981SQ20091017551
公开日2010年12月29日 申请日期2003年12月31日 优先权日2002年12月31日
发明者A·施奈德, C·克吕格尔, C·索默, D·韦伯, M·毛雷尔, N·加斯勒, R·科尔马, S·施瓦布, W·-R·谢比茨 申请人:西格尼斯生物科技有限责任两合公司