专利名称：重组人g-csf的改进的加工的制作方法
重组人G-CSF的改进的加工
背景技术：
G-CSF是一个20kDa的糖蛋白，该糖蛋白由两个链内的二硫键稳定，含有单个氧-连接的碳水化合物部分(carbohydrate moiety)。成熟的G-CSF有174个氨基酸。G-CSF 是由骨髓细胞、巨噬细胞和成纤维细胞合成的。它的主要功能是作为中性粒细胞及其前体细胞的生长和分化因子。现有技术中还已知G-CSF活化成熟的中性粒细胞。此外，它刺激其它多种造血祖细胞的生长/分化(与另外的造血生长因子协同作用)并促进内皮细胞的增殖和迁移。在临床上，G-CSF被用于治疗中性粒细胞水平上的缺陷(例如，由癌症/化疗、 AIDS或骨髓移植导致的中性粒细胞减少症)。
发明内容
为了使用与人相同的G-CSF治疗中性粒细胞减少症患者，用编码人野生型G-CSF 的质粒转染人细胞。从所选克隆的细胞培养上清液中纯化G-CSF后，观察到大量的分泌的 G-CSF的N端被截短了 3个氨基酸。所述截短并不是克隆特异的，也不能通过改变细胞培养条件而消除。在上述观察的基础上，推断出细胞中，特别是HEK293F细胞中的G-CSF前体蛋白的加工(processing)并不精确。具体地，可推断出，为了在生理上去除所述信号肽，信号肽酶复合物并不只在预期的位点切割，该信号肽酶复合物还在另外一个位点进行切割，导致N 端的截短。令人惊讶地发现，如果使用了修饰的信号肽及相应的G-CSF前体，可以减少N端的截短。因此，在一个实施方式中，本发明提供包括信号肽和G-CSF肽的G-CSF前体，其中， 所述信号肽具有人G-CSF/b分子中的人野生型信号肽的序列(SEQ ID NO :4)，且该序列具有至少以下突变之一-Glu29 的删除，-Glu26 的插入，-LysllLeu 的取代，-His2IPhe 的取代，以及-Glu28Leu 的取代。在一个优选的实施方式中，所述G-CSF前体具有至少2个、或至少3个、或至少4 个、或所有5个上述突变。在本发明另一个实施方式中，所述G-CSF前体至多可以具有另外3个突变，所述突变选自插入、删除及取代。本发明另一个实施方式是编码本发明的G-CSF前体的多核苷酸，以及与上述多核苷酸互补的多核苷酸。本发明另一个实施方式是包括本发明的多核苷酸的载体，以及含有本发明的多核苷酸或本发明的载体的经转染的细胞。
在一个优选的实施方式中，所述经转染的细胞是真核细胞，优选是人细胞，更优选是HEK293细胞，更进一步优选是HEK293F细胞或HEK293F衍生细胞(HEK293F derived cell)0在一个实施方式中，所述转染是瞬时的，在另一个实施方式中，所述转染是稳定的。本发明另一个实施方式是表达G-CSF的方法，该方法包括以下步骤-在合适的培养基中，培养本发明的经转染的细胞；-从所述培养基中分离G-CSF。在一个优选的实施方式中，在pH为6. 8-7. 5、优选为7. 1-7. 3、更优选为7. 2左右的条件下进行所述培养。优选在培养过程中控制所述PH。在另一个实施方式中，在胰岛素浓度为5-25mg/ml、优选为15_25mg/ml、更优选为 15-20mg/ml的条件下进行所述培养。令人惊讶地，采用本发明的修饰的信号肽，所产生的G-CSF的截短比率极小，优选低于分子的5%，更优选低于总G-CSF的1%。被认为是检测限。优选地，所述培养基不含血清。大部分G-CSF的糖基化类型没有改变，且活性与野生型G-CSF的活性相同。因此，本发明的方法产生了高度适于制药应用的G-CSF。
图1显示了用TargetP程序对具有野生型信号肽的人野生型G-CSF的分析。图2显示了用TargetP程序对具有SP9信号肽的人野生型G-CSF的分析。图3显示了用TargetP程序对具有SPlO信号肽的人野生型G-CSF的分析。图4显示了采用构建体的HEK293F细胞中成熟G-CSF蛋白的表达，所述构建体分别编码具有野生型信号肽(表达水平是100% )、SP9信号肽或SPlO信号肽的前体蛋白。图5显示了具有SP9信号肽的人野生型G-CSF的氨基末端氨基酸测序(Edman降解法)的色谱图。图如-如对应于残基1-5。下面的表格中给出了所述氨基酸序列分析的总结ο图6显示了具有SPlO信号肽的人野生型G-CSF的氨基末端氨基酸测序(Edman降解法)的色谱图。对应于残基1-5。下面的表格中给出了所述氨基酸序列分析的
总结O图7显示了格拉诺赛特(GRAN0CYTE)的氨基末端氨基酸测序(Edman降解法)的色谱图。图6a_6e对应于残基1-5。下面的表格中给出了所述氨基酸序列分析的总结。图8显示了具有野生型信号肽的人野生型G-CSF的氨基末端氨基酸测序(Edman 降解法)的色谱图。图7a_7e对应于残基1-5。下面的表格中给出了所述氨基酸序列分析的总结。图9显示了从用G-CSF SP9稳定转染的克隆分离中得到的两个示例性的克隆中全长G-CSF的比率的比较。所述剩余的非全长片断主要包括N端被截短3个氨基酸的G-CSF。 全长G-CSF的比率为99%处的线与N端的截短彡相关，这是该分析的检测下限。图10显示了在搅拌釜反应器中，用不同培养pH培养的克隆1的实施例中全长
4G-CSF的比率的比较。克隆1从用G-CSF SP9载体稳定转染的克隆分离中得到。所述剩余的非全长片断主要包括N端被截短3个氨基酸的G-CSF。摇瓶中的克隆1的参比培养(没有控制pH)中的全长G-CSF的比率表示于第一个灰色的棒中。全长G-CSF的比率为99%处的线与N端的截短< 相关，这是该分析的检测下限。图11显示了在搅拌釜反应器中，用不同培养pH培养的克隆2的实施例中全长 G-CSF的比率的比较。克隆2从用G-CSF SP9载体稳定转染的克隆分离中得到。所述剩余的非全长片断主要包括N端被截短3个氨基酸的G-CSF。摇瓶中的克隆2的参比培养(没有控制pH)中的全长G-CSF的比率表示于第一个灰色的棒中。全长G-CSF的比率为99%处的线与N端的截短< 相关，这是该分析的检测下限。图12显示了具有不同胰岛素浓度的培养基中，克隆2的实施例中全长G-CSF的比率的比较。克隆2从用G-CSF SP9载体稳定转染的克隆分离中得到。所述剩余的非全长片断主要包括N端被截短3个氨基酸的G-CSF。全长G-CSF的比率为99%处的线与N端的截短< 相关，这是该分析的检测下限。图13显示了在大规模的高细胞密度模式下培养、并在不同时间采集的克隆2的实施例中全长G-CSF的比率的比较，其中，培养基中含15mg/L的胰岛素，没有控制pH。克隆2 从用G-CSF SP9载体稳定转染的克隆分离中得到。所述剩余的非全长片断主要包括N端被截短3个氨基酸的G-CSF。全长G-CSF的比率为99%处的线与N端的截短彡相关，这是该分析的检测下限。
实施例实施例1为了正确的蛋白加工，对所述G-CSF前体肽进行的优化所述野生型的人G-CSF的亚型b的cDNA已在GenBank数据库中公开(NM_172219)。 基本上，具有任何源自NM_172219的序列的任何G-CSF前体蛋白都可用于本发明的信号肽序列的修饰。在一个示例性的实施方式中，所述前体蛋白具有下文所示的如SEQ ID NO 1 (GenBank NP_757373)的序列MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQEATPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQ⑶GAALQEKLCATY KLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATT IWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP未加工的野生型G-CSF前体蛋白(SEQ ID NO :1)包括204个氨基酸，其中包括 30个氨基酸的信号肽。已经公开了所述加工是发生于Ala30和Thr31残基之间(GenBank NP_757373)。最近的文献记载了所述真核生物的信号肽的共有序列及信号肽酶复合物的功能 (Rapoport,2007, Nature 450(29),663-669 ；Tuteja,2005, Arch Biochem Biophys 441, 107-111 ;Dalbey 等，1997，Protein Science 6,1129-1138)。将G-CSF信号肽的氨基酸序列与上述提出的共有信号肽的特征进行比较。发现有若干氨基酸残基与所提出的模型不符。具体地，所提出的位于信号肽C-末端的Ala-X-Ala 基序被存在于G-CSF前体肽中的、带电荷的氨基酸(Glu29)阻断，而所述基序被认为是精确切割的关键。此外，所述带电荷的残基Lysll及His21位于该信号肽的疏水区，因而与该模型的要求不一致。用 SignalP 禾口 TargetP 软件(www. cbs. dtu. dk/services ； Emanue Is son 2007, Nature Protocols 2，953-971)对所述野生型的G-CSF信号肽进行了计算机模拟(in silico)分析。所述软件显示，预测加工会发生在正确的G-CSF的N端(Thrfl)，但还会发生在其它几个位点(图1)。然而，该软件并未预测到在截短位点(Gly34)处的加工。实施例2根据上述假定的信号肽酶模型，用计算机模拟所述野生型的G-CSF信号肽的模型，其中，对该信号肽的氨基酸序列进行了最低限度的改变。再次用SignalP和TargetP软件分析所得切割位点。计算机模拟的少数模型，如称为SP9 G-CSF和SPlO G-CSF的模型中，预测到G-CSF的加工仅发生在正确的位点(Thrfl)，而这可以认为是潜在的优化的信号肽(SP9 G-CSF及SPlO G-CSF切割位点的计算机模拟分析分别参见图2及图3)。一些这样的构建体被选中用于基因合成(GeneArt，Regensburg，德国)。所述合成的、分别编码SP9 G-CSF和SPlO G-CSF肽的基因被克隆至真核表达载体中，用于转染HEK293F细胞。实施例3SP9 G-CSF 前体蛋白所述SP9 G-CSF前体蛋白产生于野生型的人G-CSF前体蛋白(SEQ ID N0:1)的信号肽序列。具体地，野生型信号肽在四位的谷氨酸(Glu29)被去除并插入到沈位(Glu26)。 在一个示例性的实施方式中，所述SP9G-CSF前体蛋白具有下文所示的、如SEQ ID NO 2的序列MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWETVQATPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQ⑶GAALQEKLCATY KLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATT IWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP实施例4SPlO G-CSF 前体蛋白所述SPlO G-CSF前体蛋白产生于野生型的人G-CSF前体蛋白(SEQ ID NO 1)的信号肽序列。具体地，通过将11位的赖氨酸取代为亮氨酸(LysllLeu)、将组氨酸21取代为苯丙氨酸(His21Phe)、将谷氨酰胺观取代为亮氨酸(Gli^SLeu)。在一个示例性的实施方式中，所述SPlO G-CSF肽具有下文所示的、如SEQ ID NO 3的序列MAGPATQSPMLLMALQLLLWFSALWTVLEATPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQ⑶GAALQEKLCATY KLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATT IWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP必须注意到，尽管信号肽有所改变，成熟的G-CSF肽保持了野生型(SEQ ID NO :1、 SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :3，31-204 位的残基)。实施例5用编码SP9 G-CSF及SPlO G-CSCF的表达载体进行的瞬时转染分别用编码SP9 G-CSF或SPlO G-CSF的表达载体瞬时转染HEK293F细胞。3天后收集上清液。用ELISA测定G-CSF的分泌。数据显示，其表达水平与具有野生型信号肽的 G-CSF相当，或甚至具有更高的表达水平(图4)。将G-CSF纯化至高纯度。采用与野生型G-CSF相同的方案而不对方案作任何改变，分别对两种产物SP9 G-CSF及SPlO G-CSF进行纯化。实施例6用Edman降解法(TopLab，Martinsried，德国)测定野生型G-CSF、商品化的产品格拉诺赛特(Chugai的专利CA1341389，产生于CHO细胞中的G-CSF)、SP9 G-CSF及SPlO G-CSF的氨基末端序列。令人惊讶地是，两个表达产物SP9 G-CSF及SPlO G-CSF的数据显示出仅有正确的N端而没有任何截短(图5和图6)。格拉诺赛特中也观察到相同的结果 (图7)。与此相反，尽管用SignalP或TargetP进行计算机模拟预测的结果是仅有一个切割位点(数据未给出)，具有野生型信号肽的G-CSF以及其它几种设计的构建体中，观察到了所述截短(图8)。实施例7用细胞增殖测定法来测定SP9 G-CSF和SPlO G-CSF的活性，并将其活性与格拉诺赛特的活性进行比较。SP9 G-CSF和SPlO G-CSF的细胞增殖活性优于格拉诺赛特的活性。实施例8GluC消化后，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI T0F)肽质量指纹谱分析测定SP9 G-CSF和SPlO G-CSF的糖基化。反射谱显示，HEK293F细胞中产生的SP9 G-CSF或SPlO G-CSF与野生型G-CSF相比没有任何差别。实施例9对用编码SP9 G-CSF的表达载体进行稳定转染所得克隆的评估用编码SP9 G-CSF的表达载体稳定转染HEK293F细胞。转染稳定后，分离同种克隆(homogeneous clones) 0在不同的发酵规模下分析所选克隆的上清液。为实现该目的， 从采集的上清液中，将G-CSF纯化至高纯度，并针对它们的氨基末端序列、糖基化类型及活性进行评估。观察到，尽管由SP9 G-CSF得到的上清液中并未观察到N端3个氨基酸的截短(所述上清液是从瞬时转染库(pool)分析所得)，但对于某些克隆，并不能完全抑制所述3个氨基酸的截短。该效应是克隆依赖性的，且进一步依赖于培养规模和培养条件。所述克隆依赖性(图9)暗示了 G-CSF信号肽序列的修饰导致所述SP9 G-CSF载体在很大程度上支持所述信号肽的正确切割；尽管100%的正确切割仍受制于克隆的特异性代谢。干预克隆特异性代谢的主要手段是优化培养条件的应用。用2个示例性的克隆来评估培养pH对G-CSF信号肽序列正确切割的影响。在实验室规模的搅拌釜反应器中培养这2个克隆，各反应器确定的pH值为6. 6、6. 8、7. 0及7. 2。将含有G-CSF的上清液纯化至高纯度，并针对它们的氨基末端序列进行评估(图10和图11)。 对于两个示例性的克隆，都观察到通过将G-CSF克隆的细胞培养的pH控制在7. 2，可以实现所述信号肽序列的正确加工，所述信号肽序列的正确加工使全长G-CSF的比率> 99%。所述> 99%的值与测序方法的检测下限为相符。实施例10在一个克隆的实施例中完成不控制pH及培养基中含不同浓度胰岛素的摇瓶培养。所述胰岛素浓度在5mg/L胰岛素到20mg/L胰岛素的范围内变化。将含有G-CSF的上清液纯化至高纯度，并针对它们的氨基末端序列进行评估(图12)。在所评估的克隆的实施例中，可以观察到，在不控制pH的培养条件下，将培养基中的胰岛素浓度优化至15-20mg/L 胰岛素的范围内，可引起所述信号肽序列的正确加工。 在一个克隆的实施例中，完成利用灌流模式供应培养基的大规模的高细胞密度培养。不控制所述培养的PH，培养过程中，该pH在6. 8到7. 2之间变化。培养基中的胰岛素浓度被调节至优化的浓度(15mg/L胰岛素)。将来自挑选出的4个培养时间点的含有G-CSF 的上清液纯化至高纯度，所述时间点为培养的第6、7、17及21天，并针对它们的氨基末端序列进行评估(图13)。所有经分析的上清液中都实现了所述信号肽序列的正确加工，使得全长G-CSF的比率> 99%，而该现象与细胞密度和G-CSF的产率无关。因而，优化的胰岛素浓度(15mg/L)的应用对于避免大规模的高细胞密度培养中的N端截短十分有效。
权利要求
1.一种包括信号肽和G-CSF肽的G-CSF前体，其中，所述信号肽具有人G-CSF/b分子中的人野生型信号肽的序列，所述序列具有至少以下突变之一-Glu29的删除， -Glu26的插入， -LysllLeu 的取代， -His2IPhe的取代，以及 -Glu28Leu 的取代。
2.如权利要求1所述的G-CSF前体，其中，所述G-CSF前体具有至少2个、或至少3个、 或至少4个、或所有5个权利要求1所述的突变。
3.如权利要求1或2所述的G-CSF前体，其中，所述G-CSF前体在所述信号肽中至多具有另外3个突变，所述突变选自插入、删除及取代。
4.一种编码权利要求1-3任一项所述的G-CSF前体的多核苷酸。
5.一种与权利要求4所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
6.一种包括权利要求4或5所述的多核苷酸的载体。
7.一种含有权利要求4或5所述的多核苷酸、或权利要求6所述的载体的经转染的细胞。
8.如权利要求7所述的经转染的细胞，其中，所述经转染的细胞是真核细胞，优选是人细胞，更优选是HEK293细胞，更进一步优选是HEK293F细胞。
9.如权利要求7或8所述的经转染的细胞，其中，所述转染是瞬时的。
10.如权利要求7或8所述的经转染的细胞，其中，所述转染是稳定的。
11.一种表达G-CSF的方法，所述方法包括以下步骤-在合适的培养基中，培养权利要求7-10任一项所述的经转染的细胞； -从所述培养基中分离G-CSF。
12.如权利要求11所述的方法，其中，在pH为6.8-7. 5、优选为7. 1-7. 3的范围内进行所述培养。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中，在胰岛素浓度为5-25mg/ml、优选为 15-25mg/ml、更优选为15-20mg/ml的范围内进行所述培养。
14.如权利要求11-13任一项所述的方法，其中，所述培养基不含血清。
全文摘要
一种包括信号肽和G-CSF肽的G-CSF前体，其中，所述信号肽具有人G-CSF/b分子中的人野生型信号肽的序列，且该序列具有至少以下突变之一Glu29的删除、Glu26的插入、Lys11Leu的取代、His21Phe的取代，以及Glu28Leu的取代。
文档编号C07K14/535GK102164955SQ200980137913
公开日2011年8月24日 申请日期2009年10月2日 优先权日2008年10月2日
发明者伊丽莎白·卡萨特蒙特, 卡罗拉·施罗德, 彼得·索勒曼尼, 迈克尔·莱纳尔 申请人:奥克塔法马生物制药股份有限公司