含双油体蛋白与重组成纤维生长因子9融合蛋白的油体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及含双油体蛋白与重组成纤维生长因子9融 合蛋白的油体。
【背景技术】
[0002] 成纤维细胞生长因子9 (fibroblast growth factor 9, FGF9)是成纤维细胞生长 因子家族（FGFs)的成员之一。广泛分布于人体各种组织中，它参与骨骼发育、血管形成、 胚胎发育、损伤修复、细胞凋亡、神经再生、肿瘤生长等多种生理和病理的过程，可有效促进 有丝分裂和细胞生长。FGF9最初发现于人类神经胶质瘤细胞系，具有神经胶原激活因子的 活性，基于其活性最初被命名为胶质细胞激活因子（glia-activating factor，GAF)。FGF9 是一种自分泌或旁分泌生长因子，在许多生理过程起着至关重要的作用，包括胚胎发育。人 FGF9基因编码一个由207个氨基酸组成的蛋白质序列，分子质量约26kDa。FGF9主要分 布于细胞和组织中，包括成骨细胞、软骨细胞、血管内皮细胞、晶状体上皮细胞，皮肤、肝、肾 脏、胃、生殖系统、淋巴组织等。研究发现，FGF9具有多种生物学活性，作为胞间信号分子它 参了血管形成、胚胎发育、损伤修复、细胞凋亡、神经再生、肿瘤生长等多项生理和病理的过 程，尤其是在卵巢癌发生、骨骼发育、神经再生、性腺分化等过程中起着重要的作用。因此， 临床上应用FGF9对诊断卵巢癌、治疗软骨障碍、软骨发育不全以及性腺分化机理的研究， 越来越受到人们的关注，同时如何进行高纯度、高产率的具有生物活性的FGF9的提取一直 是广大研究者关注的课题。
[0003] 人FGF9定位于第13号染色体短臂上（13qll-ql2)，编码区含有627个脱氧核苷 酸，共编码208个氨基酸；在FGF9的3'端非编码区（3' -UTR)存在一个潜在的多腺苷酸 化位点；FGF9的5'端非编码区（5' -UTR)和外显子1具有一个高G/C区域，具有哺乳动 物启动子的普遍特点。FGF9的空间构象是由C端和N端的2个a螺旋和12个折叠组 成的一个类似金字塔形的结构。在结构上，FGF9和FGF16、FGF20相似，为同一亚家族成员， FGF9与FGF家族FGF1、FGF2具有30%的同源性，并且氨基酸保守区完全相同，具有三叶草 核心结构。FGF9与FGF16、FGF20均没有经典的信号肽序列，但其能依靠N端的35个氨基 酸作为非剪切信号肽以及位于96~101位的EFISIA基序所具有的疏水性分泌到细胞外。
[0004] FGF9是一种肝素结合生长因子，为单链多肽，具有多种生物学活性，其活性依赖于 肝素的存在。FGFR主要有4种（FGFR1~FGFR4)，均为单链酪氨酸激酶受体，结构十分相似， 由胞外区、跨膜区、胞内区组成。FGF9主要与FGFR2和FGFR3结合，FGFR的结合需要肝素、 受体和配体间形成三分子复合体。
[0005] FGF9及其受体在骨骼发育过程中起重要作用。在骨骼发育早期，FGF9能促进软骨 细胞肥大；在骨骼发育后期，其主要调节生长板的血管化和成骨过程。在牙齿发育过程中 FGF9与FGF4在调节牙尖的形成信号中心原发性釉结节中的表达水平上调，继而在继发性 釉结节上表达，且FGF9的表达从原发性釉结节扩延到内釉上皮处。在连续不断切牙的生长 过程中，FGF9表达于牙颈环上皮处。从而认为作为上皮信号分子FGF9在牙齿发育各阶段 中间接地诱导牙上皮与间充质之间相互作用，在牙齿形态调节中起作用，甚至其可能参与 到成牙本质细胞分化过程。FGF9广泛存在于中枢神经及外周神经系统中，对许多脑神经元 有维持生存和促进生长及修复受损神经元并再生的作用，能显著的延缓神经元死亡 [12]和 保护神经细胞的作用并防止脊根神经节神经的坏死，在小脑颗粒神经元的迀移中也起到关 键作用。此外，FGF9还具有促进组织修复、调节视力、调节性腺分化、促进毛发再生、控制盲 肠的形成以及卵巢癌肿瘤发生等多种生物活性。
[0006] FGF9结构和功能特点的多样性和复杂性，决定了其在许多领域的重要地位以及良 好的应用前景，其适应症机制的研究主要有以下几方面： (一）FGF9诱发卵巢癌的机制研究 FGF9具有癌基因活性，研究发现其与肺癌、肝癌、前列腺癌、大肠癌以及子宫内膜癌的 发生发展有着重要的关系。增殖细胞、促进上皮细胞恶性转化和浸润内皮细胞都与FGF9的 参与相关，在卵巢癌发生发展过程中起到了关键作用。
[0007] (二）FGF9对骨骼发育的作用机制 骨骼发育分为两种形式：膜内成骨和软骨内成骨。FGF9具有促进膜内成骨，其主要受 体为FGFR2和FGFR3。FGFR2主要在软骨膜和骨膜中表达，而FGFR3主要在软骨生长板内的 软骨细胞中表达。FGF9通过促进膜内成骨进行骨再生。FGF9与FGFR3的二者共同结合抑 制软骨内成骨过程，近年来的研究表明它们的结合在长骨发育过程中起到负调节的作用抑 制软骨内成骨。
[0008] (三）FGF9对性腺分化的调节作用机制 性腺具有发育成睾丸或卵巢的潜在能力。在睾丸分化过程中，Y染色体上的 基因 Sry(sex determining region on Y chromosome, Sry)起着开关作用。基因 Sox9 (SRY-related high mobility group-box gene 9)继 Sry 在两性生殖嵴表达后第一 个在Sertoli前体细胞中表达。FGF9在性别决定过程中极为关键，参与了性腺细胞增殖、 Sertoli细胞分化和中肾细胞迀移过程并发挥重要作用。
[0009] 油体作为乳化剂。在生产食品、饲料、药物、个人护理产品和工业产品等中得到广 泛的应用。比起来自矿物的乳化剂更加环保和可再生。油体蛋白是油体中主要的膜蛋白。油 体蛋白存在2-4个亚型。它们在种子发育过程中可呈现出不同的表型，并且伴随着种子的 萌发而发生变化。油体蛋白是碱性的疏水蛋白，三个部分组成油体蛋白：亲脂的C端和N端 ，和中间疏水区域，它是通过磷脂膜进入到油体内部。N端和C端则镶嵌在油体表面，暴露在 细胞质中。油体蛋白的结构以及它的特异性，使油体在生物技术中得到广泛的应用。多油体 蛋白可以增加吸胀后种子的耐冻性及乳化稳定性和油体结构的完整性，2-3个Oleosin分 子连6?卩分子（〇1608；[11-01608；[11-6??，01608；[11-01608；[11-01608；[11-6??)，尤其是6??位 于两个 oleosin 分子之间（oleosin-GFP-oleosin)优于单油体（single-oleosin)可以 提高GFP的表达量，而且这种结构不会影响植物活力和生理学或油体稳定，有利于植物生 物技术更好的商业化。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是一种表达载体P0BT-0L-0L-FGF9及含双油体蛋白与成纤维细胞 因子9融合蛋白的油体。
[0011] 一种表达载体P0BT-0L-0L-FGF9,它是由下述方法制备的： 1) 用HindIII和kpnl分别酶切并连接表达载体pOBT和序列表SEQ ID N0. 3所示基因， 得植物特异表达载体P0BT-0L ; 2) 用Ncol与Hindlll分别酶切并连接植物特异表达载体pOBT-OL和序列表SEQ ID NO. 5 所示基因，得表达载体P0BT-0L-0L-FGF9; 一种表达载体P0BT-0L-FGF9,它是插入了上述的步骤1)制备的植物特异表达载体 pOBT插入了 SEQ ID N0. 5所示的基因。
[0012] 含油体蛋白与成纤维细胞因子9融合蛋白的油体，它是将一种表达载体 P0BT-0L-0L-FGF9转化至油料作物中，收获种子提取油体。
[0013] 含双油体蛋白与成纤维细胞因子9融合蛋白的油体，它是由下述方法制备的：将 一种表达载体P0BT-0L-0L-FGF9转化至油料作物中，收获种子提取油体。
[0014] 含油体蛋白与成纤维细胞因子9融合蛋白的油体在制备药品或化妆品方面的应 用。
[0015] 含双油体蛋白与成纤维细胞因子9融合蛋白的油体在制备药品或化妆品方面的 应用。
[0016] 本发明提供了含双油体蛋白与成纤维细胞因子9融