人TIM-1-Fc融合蛋白的重组表达的制作方法

专利名称：人TIM-1-Fc融合蛋白的重组表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及TIM-IFc的重组表达。
背景技术：
初始CD4+Th细胞接受抗原活化后可向至少两种表型与功能不同的细胞亚群分 化Thl与Th2细胞。它们是免疫调节的核心，Th细胞分化成Thl与Th2受多种因素的调 节，包括抗原的种类与提呈途径、APC类型、细胞因子、转录因子与信号转导途径以及细胞微 环境因素等的综合作用。尽管对Thl与Th2亚群的功能及Th细胞分化的调节了解很多，但 对两者的特异性表面分子知之甚少，为了寻找能够区分Thl与Th2的细胞表面标志，2002 年Monney等发现并鉴定了表达于T细胞的一个新基因家族TIM(T cell immunoglobulin mucin, TIM)，随后有关TIM的大量发表在Nature和Science等杂志上，成为T细胞最新研 究的热点。T细胞免疫球蛋白粘蛋白(T cell immunoglobulin mucin，下文简称“TIM”)是 新近发现的表达在T细胞表面与细胞活化相关的重要新分子。研究显示，小鼠TIM基因家 族位于Ilbl. 1，目前共发现8个基因，包括编码蛋白TIMl 4和4个假想蛋白TIM5 8。 在人类，TIM家族只有3个基因，定位于染色体5q33. 2，相应于小鼠的TIM-I、TIM_3，但没有 TIM-2。由于TIM-4为TIM-I的配体表达于树突状细胞表面，而TIM_3、TIM_1则分别选择性 的表达于Thl与Th2细胞，凸现人类TIM家族中TIM-3、TIM-I在免疫调节中的作用。
Μ 蛋白是一类具有共同基序的跨膜糖蛋白，其基本结构包括免疫球蛋白(Ig)样区、粘蛋白样 区、跨膜区和有磷酸化位点的胞内区，其中IgV样区包括4个保守的半胱氨酸，粘蛋白区各 成员之间有较大的变化，但均富含苏氨酸、丝氨酸和脯氨酸，粘蛋白区有很多糖基化位点。 这些成员胞内区约含42 77个氨基酸，都包含一个胞内酪氨酸激酶磷酸化基序，为小鼠和 人类同源物中最高度保守的区域。其中TIM-I胞质结构域有含一个高度保守的酪氨酸激酶 磷酸化活化基序；但TIM-3包含一个与其他成员不同的保守性酪氨酸激酶磷酸化基序，能 与胞质中SH2结构域结合，介导的胞内抑制信号。人TIM-I最先被鉴定为甲型肝炎病毒的 细胞受体，它表达在肾脏与肝脏，因此最初克隆时命名为甲肝病毒细胞受体(hepatitis A virus cellular receptor, HAVcr 1)。HAV感染后，可与TIM-1的自然配体竞争结合在Th2 细胞上的TIM-1，从而阻断TIM-I与其配体结合后提供的向Th2细胞诱导的信号转导，改变 T细胞的分化以及Thl细胞与Th2细胞的平衡。在体内，TIM-I是CD4+T细胞活化必须的共 刺激信号，过度表达可引起IL-4的明显增加；抗TIM-I抗体可以降低IL-13等Th2细胞因 子的产生，从而减轻哮喘的症状。进一步研究人T细胞TIM-I的信号传导发现，TCR/CD3信 号所需的ZAP70和IL-2诱导的T细胞激酶的活化需要TIM-I胞内酪氨酸的磷酸化激活，通 过TIM-I的表达形成PI3K和ITK复合物，活化T细胞的信号传导，提示TIM-I分子及其信 号通路是T细胞介导疾病良好的选择性靶点。因此，利用TIM-I-Fc重组蛋白阻断T细胞的活化来诱导免疫耐受，对于器官移植排斥反应的治疗具有重要潜在临床应用价值。
迄今为止，主要是使用细菌特别是大肠杆菌作为以重组技术工业生产蛋白质的宿主细胞，大肠杆菌的主要优点是易于遗传操作并能保持转化株的稳定性；经大体积培养 可获得高产率的表达产物；比细胞易于培养，从而可降低生产成本。然而，使用大肠杆菌生产生物学活性蛋白质特别是真核细胞蛋白的一个重要的缺 点是，表达产物在宿主胞浆内形成所谓包涵体，即无生物学活性的不溶性聚合体，必须对包 涵体进行变性-溶解-复性处理。这一过程获得的产物回收率很低，也影响了蛋白质活性； 另外，大肠杆菌等原核表达系统无蛋白的糖基化功能，不能满足蛋白糖基化获得的活性。

发明内容
本发明第一方面提供了一种分离的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含人 免疫球蛋白Fc部分、T细胞免疫球蛋白粘蛋白以及任选的接头，所述人免疫球蛋白Fc部分 和T细胞免疫球蛋白粘蛋白两者通过所述接头相连或直接相连。本发明另一方面提供了一种分离的核酸序列，所述核酸序列选自1)编码上述融合蛋白的核酸序列；2) 1)所述的核酸序列的互补序列。本发明第三方面提供了 一种表达载体，所述表达载体上述核酸序列。本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞被前述表达载体转化。本发明第五方面提供了一种制备上述融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包 括以下步骤1)提供上述的宿主细胞；2)在适合蛋白表达的条件下，培养步骤1)所述的宿主细胞；3)分离出所述的融合蛋白。本发明采用哺乳动物细胞表达系统，并在目的蛋白的N端连接分泌信号肽，实现 前体分子的跨膜分泌和正确切割，并维持成熟的分泌蛋白的正确构象。本发明的其它优点 和特征可在阅读了下文详细描述后更清楚地明了。


图1为Tim-I-Fc的Westernblot检测图和SDS-PAGE图，其中泳道A 未转染CHO 细胞上清(含血清)；泳道B:转染48小时后CHO细胞培养上清(无血清)；泳道C:转染48 小时后CHO细胞培养上清(含血清)；泳道D 转染48小时后CHO细胞(无血清)；泳道E 转染48小时后CHO细胞(含血清)；泳道F 阳性对照( 74kD含Fc重组蛋白)；MK 蛋白 分子量标准(泳道C箭头表示转染48小时后CHO细胞培养上清中做Westernblot可以检 测到Tim-I-Fc蛋白的表达)。图2为Tim-I-Fc重组蛋白的Western-blot鉴定结果，其中泳道A 纯化后蛋白样 品；MK:蛋白分子量标准。图3为Tim-I-Fc重组蛋白的细胞活性检测图。图4为Tim-I-Fc重组蛋白对小鼠⑶4+T细胞和⑶8+T细胞增殖的抑制作用。图5为Tim-I-Fc重组蛋白对同种MLR反应的抑制作用。图6为Tim-I-Fc重组蛋白对人淋巴细胞的抑制作用。
具体实施例方式如上所述，本发明第一方面提供了一种分离的融合蛋白，所述融合蛋白包含人免疫球蛋白Fc部分、T细胞免疫球蛋白粘蛋白以及任选的接头，所述人免疫球蛋白Fc部分和 T细胞免疫球蛋白粘蛋白两者通过所述接头相连或直接相连。在本发明中，术语“分离的”在用于核酸或蛋白质时，表示核酸或蛋白质基本上不 含其它在天然状态下相关的细胞成分，其最好呈均质状态，但也可以是干的或水溶液。纯度 和均一性通常可用分析化学方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定。术语 “蛋白质”、“肽”或“多肽”可互换使用。它们指通过肽键或酰胺键连接在一起的两个或多个 氨基酸的链，无论是否经过翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。该定义范围中特别包括 抗体。本发明的多肽还可包含一个以上的亚基，每个亚基一条由分开的DNA序列编码。此处所用的术语“包含”指的是融合蛋白中除了人免疫球蛋白Fc部分、T细胞免疫 球蛋白粘蛋白以及任选的接头之外还可以有其它氨基酸序列，只要这些氨基酸序列的存在 对于所述融合蛋白的所需生物活性没有实质性的影响即可。此处所用的术语“融合蛋白的 所需生物活性”指的是抑制T细胞(如CD4+T细胞、CD8+T细胞)的增殖、阻断T细胞的活 化，从而诱导免疫耐受。在上述发明的一个优选实施方案中，所述融合蛋白由人免疫球蛋白Fc部分、T细 胞免疫球蛋白粘蛋白以及任选的接头组成。在上述发明的一个优选实施方案中，所述T细胞免疫球蛋白粘蛋白是哺乳动物T 细胞免疫球蛋白粘蛋白，优选是人T细胞免疫球蛋白粘蛋白，更优选是人Tim-I、Tim-3和 Tim-4。作为一个更优选的实施方案，所述T细胞免疫球蛋白粘蛋白是人Tim-I的胞外区序 列(具体序列如下所示(SEQ ID NO 3) SVKVGGEAGPSVTLPCHYSGAVTSMCWNRGSCSLFTCQNGIVWT NGTHVTYRKDTRYKLLGDLSRRDVSLTIENTAVSDSGVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPPKVTTTPIVTTVPTV TTVRTSTTVPTTTTVPMTTVPTTTVPTTMSIPTTTTVLTTMTVSTTTSVPTTTSIPTTTSVPVTTTVSTFVPPMPLP RQNHEPVATSPSSPQPAETHPTTLQGAIRREPTSSPLYSYTTDGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLL)。此处所用的术语“人免疫球蛋白Fc部分”指的是人免疫球蛋白链恒定区，特别是 免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分。例如，免疫球蛋白Fc区可包括重链CH1、 CH2、CH3、CH4的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。根据重链恒定区的氨基酸 序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类，主要有5类免疫球蛋白IgA，IgD, IgE, IgG和IgM， 其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG-1，IgG-2，IgG-3，IgG-4, IgA-I和IgA_2。 从特定的免疫球蛋白类别和亚类中选择特定的免疫球蛋白Fc区在本领域技术人员所掌握 的范围之内。在一个优选的实施例中，本发明所用的人免疫球蛋白Fc部分包括至少一个免 疫球蛋白绞链区，一个CH2结构域和一个CH3结构域。在更优选的实施方案中，所述人免疫 球蛋白Fc部分由免疫球蛋白绞链区，CH2结构域和CH3结构域组成。在一个优选的实施方 案中，所述人免疫球蛋白Fc部分由SEQ ID NO 4所示的序列编码。在本发明的一个优选实施方案中，所述融合蛋白由人免疫球蛋白Fc部分、T细胞 免疫球蛋白粘蛋白以及任选的接头组成，其中所述人免疫球蛋白Fc部分是人Tim-I的胞外 区序列，所述人免疫球蛋白Fc部分由免疫球蛋白绞链区，CH2结构域和CH3结构域组成。在一个优选的实施方案中，所述人免疫球蛋白Fc部分通过接头(即连接肽)和T细胞免疫球蛋白粘蛋白连接。所述接头可选择多种氨基酸，例如丙氨酸(Ala)、甘氨酸 (Gly)和丝氨酸(Ser)或其它氨基酸的组合，例如可选择一系列的甘氨酸和丝氨酸的组合， 长度约为10-15个氨基酸残基。在一个优选的实施方案中，所述人免疫球蛋白Fc部分的C 端通过所述接头和T细胞免疫球蛋白粘蛋白的N端相连。在另一个优选的实施方案中，所 述人免疫球蛋白Fc部分的C端通过接头和T细胞免疫球蛋白粘蛋白的N端相连。另外，本 领域技术人员也可选择使人免疫球蛋白的铰链区多肽序列直接与T细胞免疫球蛋白粘蛋 白相连。最佳的连接肽长度和氨基酸组成取决于日常的实验情况。在本发明的一个优选实 施例中，使人免疫球蛋白的铰链区多肽序列直接与T细胞免疫球蛋白粘蛋白相连。另外，如本领域技术人员所能预见到的，本发明的“人免疫球蛋白Fc部分”和“T细 胞免疫球蛋白粘蛋白”还涵盖了具有相同或相似生物活性的所述多肽的变异形式。这些变 异形式包括(但并不限于)相对于所述多肽的氨基酸序列有若干个(较佳地1-10个，更佳 为1-5个，最佳为1-3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代。另外，所述缺失或插入(增加) 也可发生在C末端和/或N末端(通常有20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以 内的氨基酸缺失或增加)。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会 改变蛋白质的功能。提供功能相似氨基酸的保守性置换表是本领域所熟知的。下列5组各 自含有能相互保守置换的氨基酸脂族甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、 异亮氨酸(I)；芳族苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫甲硫氨酸(M)、半胱氨酸 (C)；碱性精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺 (N)、谷氨酰胺(Q)。另外，该术语还包括了 T细胞免疫球蛋白粘蛋白的片段或衍生物，较佳 的是该片段或衍生物保留了所需的蛋白生物活性。应当理解，本领域技术人员可以根据密码子的兼并性以及在不同物种中的表达偏 好，合成相应的核酸序列。这些变化也涵盖在本发明的范围之内。本发明另一方面提供了一种编码上述融合蛋白的分离的核酸序列或其互补序列。 另外，本发明的核酸序列的范围内还涵盖了与所述核酸序列具有高度相同性(同源性)，如 有至少60 %、更佳70 %、还要佳80 %、90 %、甚至95 %以上的同源性或相同性的核酸序列。 两个核酸序列基本上相同/同源的另一个指标是两个核酸序列在高度严谨条件下相互杂 交。因此，本发明的核酸序列的范围内还涵盖了在高度严谨条件下与本发明核酸序列杂交 的核酸序列。本发明的核酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于 PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并 用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而 得有关序列。当序列较长时，通常可通过重叠扩增，例如进行两次或多次PCR扩增，然后再 将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。例如，构建本发明核酸序列的方法可以是首 先，合成编码T细胞免疫球蛋白粘蛋白的核酸序列从基因库中搜索目标蛋白(如人Tim-I 胞外区)的cDNA序列，用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法等合成目标基因；其次，在 合成得到的cDNA序列前段连接一段编码IgK分泌信号(如小鼠IgK分泌信号)的序列，使得编码的IgK分泌信号在T细胞免疫球蛋白粘蛋白(如人Tim-I胞外区)的N端。然后， 从cDNA库中钓取人的编码免疫球蛋白Fc片段的序列，并通过任选的接头将其与前述T细 胞免疫球蛋白粘蛋白(如人Tim-I胞外区)连接(例如连接在T细胞免疫球蛋白粘蛋白的C端)。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。本发明第三方面提供了携带上述核酸序列的表达载体。“表达载体”指一种DNA构 建物，它含有的DNA序列与能使DNA在合适宿主中表达的合适的控制序列操作性相连。这 些控制序列包括实现转录的启动子、控制该转录的任选的操纵子序列、编码合适的mRNA核 糖体结合位点的序列，以及控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、或 简单地是潜在的基因组插入物。在某些场合，“质粒”和“载体”有时可互换使用，因为质粒 是目前最常用的载体形式。一旦转化到合适宿主中，该载体能不依赖于宿主基因组进行复 制和起作用，或在一些情况下，其本身整合入基因组中。哺乳动物细胞培养表达的典型的表 达载体例如以 pRK5(EP307, 247)，pSV16B(W0 91/08291)和 pVL1392 (Pharmingen)为基础。在一个优选的实施方案中，所述表达载体除了包含上述核酸序列外，还含有编码 分泌信号肽的核酸序列。所述分泌信号肽是小鼠IgK分泌信号肽，其连接在目的蛋白的N端 (即所述核酸序列的3'端连接在编码权利要求1所述的融合蛋白的核酸序列的5'端)。 在一个优选的实施方案中，所述编码分泌信号肽的核酸序列是SEQ IDNO 2所示的序列；AT GGCATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCC)。本发明第四方面提供了由上述表达载体转化的宿主细胞。本文所用的术语“转化” 是指用本领域技术人员熟知的方法将含有感兴趣的核酸的表达载体直接导入宿主细胞内。 转化方法因宿主细胞类型而异，通常包括电转化；采用氯化钙、DEAE-葡聚糖或其它物质 的转染；微粒轰击；脂转染；感染和其它方法(见Sambrook等人的《分子克隆实验指南》第 2版，1989年)。优选的方法是电转化方法。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。可作为宿主进行表 达的哺乳动物细胞表达系统是本领域中已知的，其包括许多从美国典型培养物保藏中心 (ATCC)获得的无限增殖细胞系，包括但不局限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞、乳 仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如H印G2)和其它许多细胞系。本发明另一方面提供了一种制备上述融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包 括以下步骤1)提供一宿主细胞(如上所述)，该宿主细胞包含一表达载体，该表达载体包含上 述核酸序列以及与其操作性相连的表达调控序列；2)在适合蛋白表达的条件下，培养步骤1)所述的宿主细胞；3)分离出所述的融合蛋白。具体而言，本发明采用哺乳动物细胞表达系统，并在目的蛋白的N端连接分泌信 号肽，实现前体分子的跨膜分泌和正确切割，并维持成熟的分泌蛋白的正确构象。同时，本 发明将IgK分泌信号与人的Tim-I-Fc基因融合，从而提高了Tim-I-Fc的可溶性表达。在本发明的一个优选实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。可作为宿主进 行表达的哺乳动物细胞表达系统是本领域中已知的，其包括许多从美国典型培养物保藏中 心(ATCC)获得的无限增殖细胞系，包括但不局限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞、 乳仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如H印G2)和其它许多细胞系。在一个优选的实施方案中，所述核酸序列编码的氨基酸序列包含IgK分泌信号、T 细胞免疫球蛋白粘蛋白、以及人免疫球蛋白的Fc部分，其中IgK分泌信号在T细胞免疫球 蛋白粘蛋白的N端。所述IgK分泌信号肽宜为小鼠IgK分泌信号肽。另外，所述T细胞免疫球蛋白粘蛋白和人免疫球蛋白的Fc部分之间还可以任选地存在接头。所述T细胞免疫 球蛋白粘蛋白是哺乳动物T细胞免疫球蛋白粘蛋白，优选是人T细胞免疫球蛋白粘蛋白，更 优选是人Tim-1、Tim-3和Tim-4。作为一个更优选的实施方案，所述T细胞免疫球蛋白粘 蛋白是人Tim-I的胞外区序列。所述人免疫球蛋白Fc部分包括至少一个免疫球蛋白绞链 区，一个CH2结构域和一个CH3结构域，但缺少CHl结构域。随后，在适合本发明融合蛋白表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。本领域技 术人员根据常规试验就能选择和确定培养基、培养温度、时间等条件。采用本领域常规检测 手段，如SDS-PAGE，Western印迹等，可以检测出本发明融合蛋白的表达。
最后，可用常规的蛋白分离纯化技术，进行融合蛋白的分离纯化，其包括离心，沉 淀，过滤，层析等手段。具体地，层析方法又包括亲和法，凝胶过滤，离子交换，疏水层析，以 及反向层析等。本发明提供的本发明的融合蛋白的分离纯化方法也包括上述各种方法的适 当组合。在本发明的一个优选实施方案中，所述T细胞免疫球蛋白粘蛋白是人Tim-I的胞 外区序列，其与人IgG抗体Fc部分(hinge-CH2-CH3)相连，所述宿主细胞为CHO细胞，所述 表达载体为pcDNA3. 1。在一个优选实施方案中，具体方法包括如下步骤1.大量扩增带有小鼠IgK信号肽编码序列-Tim-I-Fc基因的pcDNA3. 1载体将筛 选获得的带有小鼠IgK信号肽编码序列-Tim-I-Fc基因的PCDNA3. 1 (pcDNA3. I-Tim-I-Fc) 转化入大肠杆菌DH5ci感受态中，经过氨苄青霉素抗性的平板筛选转化子，将筛选得到的 阳性重组菌DH5ci /pcDNA3. I-Tim-I-Fc单菌落，接种到氨苄青霉素抗性的LB培养基中， 37°C摇床震荡培养14小时，然后按照比例转到新的氨苄青霉素抗性的LB培养基中， 37°C摇床震荡培养14小时后，Invitrogen公司质粒大抽试剂盒抽提质粒。2.转染CHO细胞，诱导表达Tim-I-Fc融合蛋白转染时，CHO细胞达到75 85% 的融合，按照Lipofectamine -2000转染试剂说明书将pcDNA3. I-Tim-I-Fc转染进CHO细 胞。培养48h后，收集细胞上清液。3.分离纯化Tim-I-Fc融合蛋白取上清液进行树脂亲和层析，经过洗涤、洗脱、脱 盐，即得到纯化后的Tim-I-Fc融合蛋白，经过SDS-PAGE、考马氏亮蓝染色验证蛋白的大小 及检测其浓度。本发明中涉及的基因的设计、合成和克隆，表达载体的构建，DNA序列分析及鉴定， 以及表达产物的分离和纯化等操作可按照本领域已知的技术进行(参见Sambrook ct al., Molecular Cloning :A Laboratory Mannua1,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cola Spring Harbor, NY,1989)。本发明Tim-I的表达方法，以Fc作为融合蛋白标签，采用真核表达系统表达具有 以下优势1.抗蛋白酶解在细胞内，蛋白酶解受到严密控制，通过降解空闲或错误折叠的 蛋白维持细胞的稳定性。宿主表达的重组蛋白很容易被当成空闲蛋白被酶解，从而降低表 达水平。Fc融合表达时，可能促使重组蛋白胞内区域化，降低对酶解的敏感性。2.增加重组蛋白的表达量蛋白表达是一个很复杂的过程，通常依赖于mRNA的稳 定性、转录效率、转录调控等，而重组蛋白的高效表达依赖于mRNA的拷贝数和稳定性、有效的转录起始和延伸(强有效的启动子)、翻译的增强(密码子偏好性)。Fc与蛋白融合表达 时表达量明显增加，但确切的机理尚不清楚。3.促进蛋白正确折叠虽然大肠杆菌的表达体系是重组蛋白的首选表达方式，但 是由于缺乏蛋白折叠机制，表达很多真核蛋白，尤其是富含二硫键的蛋白时，很难形成正确 结构，一旦蛋白大量表达，来不及正确折叠导致形成非活性的包涵体。采用真核表达体系， 就可以避免此类问题的出现。为了防止此类问题的出现，分子伴侣和折叠酶的共表达、分泌 表达、融合表达等策略相继出现。Fc融合标签可以增强可溶性，可能是由于Fc具有独特的 结构，如亲水的表面和高度疏水的内核，从而增强所融合蛋白的可溶性。4.通过蛋白质糖基化提高蛋白质活性真核表达系统能满足蛋白糖基化获得活 性的需求。本领域技术人员能够理解，本发明的上述所有优选技术方案可以任意方式相互组 合，出于使文本简明的目的，本文不再对这些组合进行逐一描述。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、 重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中 有完整的描述例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989) ； ((DNA克隆》第I和II卷 (D. N. Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M. J. Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B. D. Hames 和S. J. Higgins编辑· 1984)；《蛋白质纯化原理和实践》第2版(Springer-Verlag, N. Y.)， 以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D. C. Weir和C. C. Blackwell编辑1986)。或者，可按照试 剂生产商所提供的说明书进行。实施例1 Tim-I基因的人工合成根据基因库中搜索到的人的Tim-I基因序列人工合成方法获得人的Tim-I基因，并在其N端(5'端)添加小鼠的IgK分泌信号，按照密码子的简并性消除在本实验中所用 的酶切位点；合成好的Tim-I亚克隆到哺乳动物细胞表达载体pcDNA3. 1载体中，扩增并抽 提含有Tim-I基因的载体质粒pcDNA3. I-Tim-I。小鼠IgK分泌信号-Tim-I的序列如下所示(SEQ ID NO=I ；斜体下划线部分表示 小鼠IgK分泌信号)
ATGGCA TGGA GCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCA GTAA CTA CA GGTGTCCA
CTCC TCTGTAAAGGTTGGTGGAGAGGCAGGTCCATCTGTCACACTACCCTGCCACTACAGTGGAGCTGTCACATC
CATGTGCTGGAATAGAGGCTCATGTTCTCTATTCACATGCCAAAATGGCATTGTCTGGACCAATGGAACCCACGTCA
CCTATCGGAAGGACACACGCTATAAGCTATTGGGGGACCTTTCAAGAAGGGATGTCTCTTTGACCATAGAAAATACA
GCTGTGTCTGACAGTGGCGTATATTGTTGCCGTGTTGAGCACCGTGGGTGGTTCAATGACATGAAAATCACCGTATC
ATTGGAGATTGTGCCACCCAAGGTCACGACTACTCCAATTGTCACAACTGTTCCAACCGTCACGACTGTTCGAACGA
GCACCACTGTTCCAACGACAACGACTGTTCCAATGACGACTGTTCCAACGACAACTGTTCCAACAACAATGAGCATT
CCAACGACAACGACTGTTCTGACGACAATGACTGTTTCAACGACAACGAGCGTTCCAACGACAACGAGCATTCCAAC
AACAACAAGTGTTCCAGTGACAACAACTGTCTCTACCTTTGTTCCTCCAATGCCTTTGCCCAGGCAGAACCATGAAC
CAGTAGCCACTTCACCATCTTCACCTCAGCCAGCAGAAACCCACCCTACGACACTGCAGGGAGCAATAAGGAGAGAA
CCCACCAGCTCACCATTGTACTCTTACACAACAGATGGGAATGACACCGTGACAGAGTCTTCAGATGGCCTTTGGAATAACAATCAAACTCAACTGTTCCTAGAACATAGTCTACTG实施例2 pcDNA3. I-Tim-I-Fc表达载体的构建从人cDNA库中钓取人IgGl的Fc片段(hinge-CH2_CH3)，将钓取的人Fc片段克隆 到pcDNA3. I-Tim-I上，测序验证构建质粒的准确性；采用Invitrogen的中抽试剂盒，按照 说明书抽提获得重组的质粒DNA即pcDNA3. I-Tim-I-Fc0人IgGl的Fc片段序列如下所示(SEQ ID NO 4)GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCG GCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGG CGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCA GCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCC AAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTT CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACG AAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG CAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAA GTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAAC CACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGC TTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGT GCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCT TCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA实施例3重组Tim-I-Fc蛋白的获得1、诱导表达将测序正确的pcDNA3. I-Tim-I-Fc利用Lipofectamine -2000转染到融合率达到 75-85%的CHO细胞中，培养48h后，收集细胞及其上清液。通过SDS-PAGE电泳检测每步结 果并控制最终产品质量。通过Western-blot验证目标蛋白正确性(图1)。2、蛋白质的纯化按照上述的融合蛋白表达的最优条件，扩大培养体积，收集上清，通过亲和，离子 交换，疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白Tim-1-Fc，最终蛋白产品的纯 度一般不低于80%。通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。实施例4重组Tim-I-Fc蛋白的鉴定Western-blot检测验证目标蛋白正确性。纯化的重组Tim-I-Fc蛋白样品加入6X上样缓冲液(100mmol/L Tris-HCl, 200mmol/L DTT,4% SDS，0. 2%溴酚蓝，20%甘油，pH6. 8)混勻，于 100°C水浴煮沸 5min 后， 冷却后上样，同时上样预染蛋白分子量标准。样品蛋白经12% SDS-PAGE电泳分离。随后以80V恒定电压，于冰浴下将聚丙烯酰胺中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜，丽春红染色并标记 大小和方向。在封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST溶液)室温孵育2h后，将膜与适当浓度的 一抗溶液(稀释于含5%脱脂奶粉的TBST中)4°C封闭过夜。TBST中洗3次，每次15min，然 后与稀释于抗体稀释液中的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育lh，TBST洗3次， 每次15min。将Western印迹发光检测试剂中的A液和B液等体积混勻，室温孵育5min，于 凝胶成像分析检测仪上进行检测。结果显示在Marker 62KD的位置有大量蛋白存在，与重组Tim-I-Fc蛋白的分子大小一样(图2)。
实施例5 Tim-I-Fc蛋白活性检测采用尼龙毛柱法分离小鼠脾脏T淋巴细胞，以5 X 105/孔细胞接种于96孔板中， ConA刺激，并在含有10%的胎牛血清的1640培养基中加入纯化的Tim-I-Fc蛋白，以不加 Tim-I-Fc蛋白的细胞组为对照，培养三天后，以3H-Tdr法检测细胞的增殖情况。结果显示 在一定蛋白浓度下，重组的Tim-I-Fc蛋白能够明显的抑制T细胞的增殖(图3)。实施例6 Tim-I-Fc蛋白对小鼠⑶4+T细胞、⑶8+T细胞以及同种MLR反应的抑制 作用 分离小鼠脾脏T淋巴细胞，采用⑶4+或⑶8+磁珠分离⑶4+T细胞、⑶8+T细胞，以 5 X 105/孔细胞培养于96孔板中，ConA刺激，并在含有10%的胎牛血清的1640培养基中加 入纯化的Tim-I-Fc蛋白，以不加Tim-I-Fc蛋白的细胞组作为对照，培养三天后，以3H_Tdr 法检测细胞的增殖情况，结果显示在一定蛋白浓度下，重组的Tim-I-Fc蛋白能够明显的抑 制⑶4+T细胞、⑶8+T细胞的增殖(图4)。分离BALB/c小鼠脾脏细胞，采用Tris_NH4Cl去 除红细胞后加入终浓度为80ug/ml的丝裂霉素C，37°C孵育1小时后用RPMI1640洗涤三次 后计数作为刺激细胞备用；分离C57小鼠脾脏淋巴细胞，计数作为反应细胞，以刺激细反 应细胞分别为1 20、1 IOU 5的比例加入96孔板中，每孔加至200ul含有10%的胎 牛血清的1640培养基并含不同浓度的Tim-I-Fc蛋白，以不加Tim-I-Fc蛋白的细胞组作为 对照，培养三天后，以3H-Tdr法检测细胞的增殖情况，结果显示重组的Tim-I-Fc蛋白能够 抑制同种MLR反应(图5)。实施例7 Tim-I-Fc蛋白对人淋巴细胞的抑制作用分离正常献血员外周血淋巴细胞，以5X105/孔细胞接种于96孔板中，ConA刺激， 并在含有10%的AB血清的1640培养基中加入Tim-I-Fc蛋白，以不加Tim-I-Fc蛋白的细 胞组为对照，培养三天后，以3H-Tdr法检测细胞的增殖情况，结果显示在一定蛋白浓度下， 重组的Tim-I-Fc蛋白能够明显的抑制T细胞的增殖(图6)。尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的， 即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利 要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均 纳入本文作参考。
权利要求
一种分离的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含人免疫球蛋白Fc部分、T细胞免疫球蛋白粘蛋白以及任选的接头，所述人免疫球蛋白Fc部分和T细胞免疫球蛋白粘蛋白两者通过所述接头相连或直接相连。
2.如权利要求1所述的分离的融合蛋白，其特征在于，所述T细胞免疫球蛋白粘蛋白是 人Tim-1的胞外区序列。
3.如权利要求1或2所述的分离的融合蛋白，其特征在于，所述人免疫球蛋白Fc部分 由免疫球蛋白绞链区，CH2结构域和CH3结构域组成。
4.一种分离的核酸序列，所述核酸序列选自1)编码权利要求1所述的融合蛋白的核酸序列；2)1)所述的核酸序列的互补序列。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求4所述的核酸序列。
6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体含有编码分泌信号肽的 核酸序列，所述核酸序列的3'端连接在编码权利要求1所述的融合蛋白的核酸序列的5'端。
7.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述编码分泌信号肽的核酸序列是SEQ ID NO: 2所示的序列。
8.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求5、6或7所述的表达载体转化。
9.一种制备权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤1)提供权利要求8所述的宿主细胞；2)在适合蛋白表达的条件下，培养步骤1)所述的宿主细胞；3)分离出所述的融合蛋白。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
全文摘要
本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含人免疫球蛋白Fc部分、T细胞免疫球蛋白粘蛋白以及任选的接头。本发明还提供了该融合蛋白的编码序列、含有该编码序列的表达载体和宿主细胞。本发明还提供了该融合蛋白的制备方法。本发明的融合蛋白可用于抑制T细胞的增殖，从而诱导免疫耐受性。
文档编号C12N15/62GK101798351SQ20101011988
公开日2010年8月11日 申请日期2010年3月9日 优先权日2010年3月9日
发明者丁国善, 刘芳, 曹雪涛, 王全兴 申请人:中国人民解放军第二军医大学