专利名称：一种重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法
技术领域：
本发明属于生物工程基因领域，涉及一种重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白及其编码基因，以及其表达、纯化和包涵体复性方法。
背景技术：
干扰素(Interferon，IFN)是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。根据IFN的来源即动物种类、细胞类型、诱生剂的性质和诱生条件不同，可分为α、β、Y三种。其中，Υ干扰素(interfeixm，IFN- y )具有免疫干扰素之称，由T细胞及NK细胞合成，其生物学效应包括抗病毒活性、抗肿瘤细胞增殖、诱导MHCI级抗原表达、诱导MHC II级抗原表达、激活M41，使其杀伤肿瘤细胞以及杀灭包内寄生虫。由此可见，干扰素Y不仅具有广谱抗病毒功能，还具有免疫调节的作用，对疾病的发生发展的控制有着重要的影响。我国是养猪大国，猪圆环病毒病、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病等多种猪病毒性传染病给养猪业带来了巨大的经济损失。目前我国虽广泛接种各种猪病疫苗，仍不能有效控制疾病流行。基因工程动物用药干扰素-Y可有效增强猪仔的免疫功能，提高机体对病毒的防御作用，并且具有无药物残留、无副作用等特点，深受临床兽医和养殖户的青睐。但是干扰素-Y的生物学效应具有高度的种属特异性，而天然的猪干扰素Y在机体内表达甚微，很难直接从体内大量提取供临床研究及应用。因此本发明通过基因工程手段提供了一种成本低廉且可以大量表达重组猪干扰素Y表达系统和表达方法。另一方面，作为小分子量蛋白，猪干扰素Y也与其他干扰素Y —样，存在血浆清除速度较快的缺陷，从而导致在临床治疗中需要重复多次用药才能达到治疗效果。因此，半衰期短及用药的频繁也将成为使用猪干扰素Y治疗猪病毒性疾病的瓶颈。IgG免疫球蛋白是人和动物体内的主要抗体，它在体内的半衰期约为20天。其稳定性是由于IgG的Fe片段可与新生Fe受体(FcRn)结合，避免IgG进入溶酶体中被降解。有鉴于此，本发明尝试考虑在猪干扰素Y上增加IgG的Fe片段来构成融合蛋白，以提高猪干扰素Y体内半衰期，达到长效的目的。由此，本发明的目的是提供一种既能保留猪干扰素Y原有活性，又可以延长体内半衰期的猪干扰素Y与Fe片段的融合蛋白。然而，通过大肠杆菌表达的重组蛋白多为不溶解、无活性的细胞内聚集物，即包涵体。包涵体的复性是一个非常复杂的过程，如果复性条件不适宜将会出现分子内二硫键的错配，分子间共价结合或疏水结合形成聚合体，一方面降低重组蛋白的比活率，造成产品质量不合格，同时又产生沉淀析出，影响得率。因此，本发明所要解决的另一个技术问题是采用合适的方法将大肠杆菌表达的蛋白包涵体进行复性。 发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，通过密码子优化的方式，提供一种可在大肠杆菌内高效表达的重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白以及其基因和表达、纯化、复性方法。本发明提供了重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白，所述融合蛋白包括猪干扰素Y部分和Fe片段部分，其中，猪干扰素Y部分为猪干扰素Y胞外区的全部序列，Fe片段部分包括铰链区、CH2区和CH3区，猪干扰素Y与Fe片段部分之间为直接融合。其中的Fe片段选自人或动物的免疫球蛋白Fe，是Fe全长或是部分序列，Fe选自IgG、IgM、IgD、IgA,每种免疫球蛋白类型包括各亚型,如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。本发明的融合蛋白中的Fe片段 部分特别优选来自猪的IgGl。优选地，本发明的重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，其中第2-144位氨基酸残基为猪干扰素Y的胞外区序列，第145-374位氨基酸残基为猪IgGl序列。本发明提供了编码上述所述重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白的基因，其碱基序列如SEQ ID N0:1所示。该序列是专为大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列，相比之下能显著提高异源基因在宿主菌中的表达。本发明还提供了包含了上述所述编码重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白的基因的质粒，所述的质粒优选为原核表达质粒，最优选为pET21b载体。本发明还提供了包含有上述所述质粒的大肠杆菌菌株，优选地，所述菌株选自大肠杆菌BL21 (DE3)菌株。本发明还提供了重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白在大肠杆菌表达方法，包括如下步骤:该方法的步骤为:1.挑取I个或多个含有上述所述重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白的大肠杆菌菌落，接入LB培养液，于37 °C培养过夜；2.取适量过夜培养物，接入于所述过夜培养物的100倍量的LB培养液中，于37°C震荡培养至对数中期0D_=1.0 ；3.在培养物中加入浓度为lmmol/L的IPTG，于37°C，诱导表达4h后，于4°C以转速5000rpm,离心处理15min,收集含有重组猪干扰素Y-Fe融合蛋白的大肠杆菌菌体。所述LB培养液中均含有氨苄青霉素50-100 μ g/ml。本发明的上述所述表达方法是经过发明人反复多次实验摸索和验证得到的用于表达重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白的最为有效的方法，该方法的表达量高，且表达得到包涵体复性后活性更高。本发明还提供了重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白的包涵体纯化方法，包括如下步骤:1.将收集得到的上述含有诱导重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白大肠杆菌沉淀，用预冷的PBS重悬，并于4°C高速离心处理；重复一次。2.吸去上清，称菌体沉淀重量，每克(湿重)加入裂解缓冲液Buffer A3_10mL，搅动缓冲液，使菌体悬起。3.每克(湿重)菌体加入3-10yL浓度为100mmol/L的PMSF，3-100yL浓度为lOOmg/mL的溶菌酶，于冰上搅动。4.破碎菌体，样品置于冰上，超声，并于4°C高速离心处理。5.沉淀用洗涤缓冲液Buffer B洗涤，并于4°C高速离心处理，沉淀包涵体，重复一次。6.包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解,室温下搅拌30_60min。7.充分混匀后室温高速离心处理，弃沉淀，取上清，即得到重组猪干扰素Y-Fe融合蛋白变性溶液。该纯化方法优选步骤如下:1.将收集得到的上述含有诱导 重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白大肠杆菌沉淀，用预冷的PBS重悬，于4°C，以12000rpm的转速离心15min ;重复一次。2.吸去上清，称菌体沉淀重量，每克(湿重)加入裂解缓冲液Buffer A5mL，用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。3.每克(湿重)菌体加入5μ L浓度为100mmol/L的PMSF，5y L浓度为100mg/mL的溶菌酶，冰上搅动20min。4.用探针型超声波仪破碎菌体，样品置于冰上，超声120次，每次5s间隔5s，循环三次，每次循环至冷却样品之间等待2min,等待样品冷却。于4°C ,以12000rpm的转速离心15min,弃上清。5.沉淀用洗漆缓冲液Buffer B洗漆,于4 ,以12000rpm的转速离心15min,沉淀
包涵体，重复一次。6.包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温下搅拌30min。7.充分混匀后室温下以12000rpm的转速离心15min，弃沉淀，取上清，即得到重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白变性溶液。本发明还提供了优化后的重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白的包涵体复性方法，包括如下步骤:取适量用变性缓冲液Buffer C溶解的重组猪干扰素Y-Fe融合蛋白变性溶液，用复性缓冲液Buffer D将蛋白浓度稀释到0.2mg/mL, 4°C复性至24h时，将复性后重组蛋白溶液用0.45 μ m滤膜过滤，即得到低浓度的重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白溶液。并可进一步超滤脱盐、浓缩，低温真空干燥，即获得重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白粉末。各缓冲液的成分及其含量如下表所示:
权利要求
1.一种重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括猪干扰素Y部分和Fe片段部分，所述猪干扰素Y部分为猪干扰素Y胞外区的全部序列，所述Fe片段部分包括铰链区、CH2区和CH3区，猪干扰素Y与Fe片段部分之间为直接融合。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
3.—种编码权利要求2中所述的融合蛋白的基因，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
4.一种载体,所述载体含有权利要求3的基因。
5.如权利要求4所述的载体，所述载体为pET21b。
6.一种大肠杆菌，所述大肠杆菌具有权利要求4或5的载体。
7.如权利要求6所述的大肠杆菌，所述大肠杆菌为BL21(DE3)菌株。
8.—种重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白的原核细胞表达方法，包括如下步骤: (1)在合适的条件下于培养基中培育权利要求6或7中所述的大肠杆菌； (2)从大肠杆菌和/或培养基中分离重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白。
9.如权利要求8所述的表达方法，包括如下步骤: (O挑取一个或多个含有权利要求6或7中所述的大肠杆菌菌落，接入含抗生素的LB培养液，培养过夜； (2)取过夜培养物转接入于含抗生素的新鲜LB培养液中，于37°C震荡培养至对数中期OD600=L O ； (3)在培养物中加入浓度为lmmol/L的IPTG，37°C，诱导表达4h后，离心处理收集含有重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白的大肠杆菌菌体沉淀。
10.一种重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白的纯化和复性方法，其特征在于，包含如下步骤: (1)将收集得到的如权利要求9所述的含有诱导重组猪干扰素Y-Fe融合蛋白大肠杆菌沉淀，PBS重悬，并于4°C高速离心处理，重复一次； (2)吸去上清，称菌体沉淀重量，每克(湿重)加入裂解缓冲液BufferA3-1OmL,搅动缓冲液，使菌体悬起； (3)每克(湿重)菌体加入3-10μ L浓度为100mmol/L的PMSF，3-100yL浓度为IOOmg/mL的溶菌酶,于冰上搅动； (4)破碎菌体，样品置于冰上，超声，并于4°C高速离心处理； (5)沉淀用洗涤缓冲液BufferB洗涤，并于4°C高速离心处理，沉淀包涵体，重复一次； (6)包涵体沉淀用变性缓冲液BufferC溶解,室温下搅拌30_60min ； (7)充分混匀后室温高速离心处理，弃沉淀，取上清，即得到重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白变性溶液； (8)取适量用变性缓冲液BufferC溶解的重组猪干扰素Y -Fe融合蛋白变性溶液，用复性缓冲液Buffer D将重组猪干扰素Y-Fe融合蛋白变性溶液的浓度稀释至0.2mg/mL，4°C透析复性24h，将复性后重组蛋白溶液用0.45 μ m滤膜过滤，即得到重组猪干扰素Y -Fe融合蛋白复性溶液； 所述重组猪干扰素Y-Fc融合蛋白复性溶液可进一步超滤浓缩、脱盐至最小体积，低温真空干燥，即获得重组猪干扰素Y-Fe粉末。
全文摘要
本发明提供了一种重组猪IFNγ-Fc融合蛋白及其编码基因、表达、纯化和包涵体复性方法，属于生物基因工程领域。IFNγ是由T细胞及NK细胞合成，具有广谱抗病毒功能和免疫调节的作用，对疾病的发生发展有着重要的影响。天然的猪IFNγ在机体内表达不足以供临床大量研究及应用，并存在在血浆中清除速度较快的缺陷。本发明提供了一种适于大肠杆菌原核表达体系的重组猪IFNγ-Fc融合蛋白。其中，猪IFNγ部分为猪IFNγ胞外区的全部序列，Fc片段部分包括抗体的铰链区、CH2区和CH3区，二者之间为直接融合。本发明的融合蛋白，不仅具有高于原蛋白IFNγ的生物活性，而且极大的延长了其半衰期，为其产业化发展提供了机遇。
文档编号C12N15/62GK103232544SQ20131018176
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月16日 优先权日2013年5月16日
发明者马永, 王安良, 章成昌, 徐春林, 陈晨, 王耀方 申请人:江苏众红生物工程创药研究院有限公司, 常州京森生物医药研究所有限公司