专利名称：人重组Reg4蛋白及其编码基因以及该蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种人重组Reg4蛋白及其编码基因以及该蛋白的制备方法，属 于基因工程技术领域。
背景技术：
Reg4蛋白能促进几种肿瘤细胞的增殖和生长，在结肠癌、胃癌、胰腺癌和 前列腺癌，以及炎症性肠病中表达明显升高。人Reg4基因(丽_032044. 2H285bp， CDS长度477bp。 CDS前面66bp编码一长度为22个氨基酸的信号肽。信号肽不 包含在分泌出来的Reg4内。但Reg4在生物体内含量很少，且难以纯化。目前尚 无有具有生物活性的人重组Reg4蛋白报道或上市。我们实验室发展出一种在大 肠杆菌中直接表达并纯化成熟形式的人重组Reg4的方法，并在体外检测了重组 Reg4蛋白的生物学活性。采用我们的方法纯化出来的人重组Reg4具有纯度高、 内毒素含量低、活性强的优点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有现有技术的不足，提供一种人重组Reg4蛋白及 其编码基因以及该蛋白的制备方法。本发明所提供的人重组Reg4蛋白为直接具 有活性的形式，制备方法简单、成本低廉，蛋白产品纯度达到98%以上，内毒素 含量低，活性高。
本发明是通过以下的技术方案实现的，
第一方面，本发明涉及一种人重组Reg4蛋白，该蛋白为如下(a)或(b)的蛋 白质
(a) 氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白质；
(b) (a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有肿 瘤细胞促增值活性的由(a)衍生的蛋白质。
第二方面，本发明涉及一种编码上述人重组Reg4蛋白的DNA序列，序列如 SEQ ID NO: 2所示。第三方面，本发明涉及一种制备上述人重组Reg4蛋白的方法，包括如下步
骤
步骤一，构建含有编码人重组Reg4蛋白DNA的重组表达载体； 步骤二，制备含有步骤一所得重组表达载体的转化体； 步骤三，培养转化体，表达蛋白； 步骤四，纯化蛋白，得到人重组Reg4蛋白。
步骤一中，所述DNA的序列如SEQ ID NO: 2所示。
步骤一中，所述重组表达载体为原核表达载体或真核表达载体。
步骤一中，所述重组表达载体为原核表达载体。
步骤一中，所述重组表达载体为pET30a质粒。
步骤二中，所述转化体为大肠杆菌。
在步骤三之后和步骤四之前还包括如下步骤将大肠杆菌破菌并收集包涵 体，包涵体用Pellet Wash Buffer洗涤后，溶解至盐酸胍变性溶液中，然后再 将盐酸胍变性溶液加入到复性液中，得到复性后的人重组Reg4蛋白溶液；其中，
所述复性液的组分及含量为1L复性液的组分及含量为Tris 6. 057g， KC1 0. 7455g， NaCl 14g， MgCl2 0. 4g， CaCl2 0. 3g， Guanidine-HCL 47. 76g， Sucrose 136. 92g， Arginine-HCL 105. 35g， GSH 300mg， GSSH 60mg，余量为水。
优选地，所述复性后的人重组Reg4蛋白溶液中人重组Reg4蛋白浓度为 0.lmg/mL。
对得到的复性后的人重组Reg4蛋白溶液进行如下处理4'C静置过夜，12000 rpm离心30 min，得上清，将上清pH值调至8. 0，再离心12000rpm离心30 min， 收集上清；之后将上清用与上清等体积的pH为7.2的磷酸缓冲液稀释，之后用 膜包去盐去水至稀释后总体积的1/10，再用pH为6. 5的磷酸缓冲液将去水后得 到的溶液稀释10倍。
所述纯化为阳离子交换柱纯化，具体为
步骤一，用pH为6.5磷酸盐缓冲液清洗管路及阳离子交换柱，直至电导与 UV值平衡；
步骤二，上样，控制流速为lml/min;歩骤三，用PH为6. 5的含有1M NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱蛋白； 步骤四，收集流穿液。 所述阳离子交换柱为S/CM柱。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明首次公开了人重组 Reg4蛋白的制备方法。本发明所提供的人重组Reg4蛋白为直接具有活性的形式。 本发明所述制备人重组Reg4蛋白的方法，工艺简单、成本低廉，不需要酶切等 额外的步骤，所生产的重组Reg4蛋白产品纯度达到98。/。以上，内毒素含量低， 活性高。这为Reg4蛋白在新药研发和检测试剂的应用提供了丰富的、高质量的 原料。
图1为自人Reg4cDNA中PCR出来的人Reg4基因片段和割胶回收后的Reg4 基因片段的电泳图2为包装的pET30a质粒示意图3为表达的人重组Reg4的电泳图4为以FPLC方法纯化的人重组Reg4检测结果图5为纯化的人重组Reg4电泳图6为人重组Reg4纯度的SEC-HPLC检测结果图7为人重组Reg4蛋白western blotting电泳图8为纯化后人重组Reg4蛋白对结肠癌细胞促增殖作用的对比图。
本发明涉及的大肠杆菌BL21 (DE3)己在《Guo D, Hu K， Lei Y， Wang Y， Ma T, He D. Identification and characterization of a novel cytoplasm protein ICF45 that is involved in cell cycle regulation. J" Biol Chem. 2004， 279(51) :53498-53505》文献中公开。大肠杆菌BL21 (DE3)可通过公开市售的 商业渠道取得，如可以从德国Novagen公司购得，编号为Novagen: 69389;
本发明涉及的表达载体PET30a(+)已在《Lin M， Trottier E, Pasick J， Sabara M. Identification of antigenic regions of the Erns protein for pig antibodies elicited during classical swine fever virus infection. J Biochem. 2004， 136(6) :795-804》文献中公开。表达载体PET30a(+)可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从德国Novagen公司购得，编号为Novagem 69909-3。
具体实施例方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解为这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册见New York Cold Spring Harbor Laboratory出版社1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所 建议的条件。
通过从酵母、如细菌的微生物或人或动物细胞系中分泌，可产生重组分子形 式的本实施例的人重组Reg4蛋白。任选从宿主细胞中分泌多肽。
许多表达系统是已知的和可用的，包括细菌(例如大肠杆菌和枯草芽袍杆 菌)，酵母(例如酿酒酵母、乳克鲁维酵母和巴斯德毕赤酵母)，丝状真菌(例如 曲霉)，植物细胞，动物细胞和昆虫细胞。
本实施例包括编码本实施例的人重组Reg4蛋白的DNA以及含有这些DNA的 载体、转化体。
本实施例中，转化体(transformant)，即带有异源DNA分子的受体细胞。 本实施例还包括通过合成和重组技术生产本实施例的人重组Reg4蛋白的方
法。通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、宿主
细胞和生物体。
用于本实施例的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆 转录病毒载体。可用于克隆和/或表达本实施例的多核苷酸的载体是能在需复制 和/或表达多核苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。 一般说来， 多核苷酸和/或载体可用于任何真核或原核细胞，包括哺乳动物细胞(如人(如 HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔网织红细胞)、大鼠、仓鼠(如CH0、 NSO和幼 仓鼠肾细胞)或小鼠细胞(如L细胞))、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或细 菌细胞(如大肠杆菌)。有关适用于多种类型宿主细胞的适当载体的例子可参见 例如F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology . Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (1992)禾口 Sambrook et al. (1989)。可以使用含有这些多核苷酸的宿主细胞来大量表达可用于例如药物、
7诊断试剂、疫苗和治疗剂的蛋白质。
已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使DNA与载体可操作相连。例 如，可在欲插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过 互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。
含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的 方法。用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶 限制性消化产生的DNA区段，所述的两种聚合酶用其3'，5'-核酸外切活性除 去突出的Y-单链末端，并用其聚合活性补平3'-凹端。因此，这些活性的联 合产生了平端DNA区段。然后在能催化平端DNA分子连接的酶，如噬菌体T4 DNA连接酶的存在下将平端区段与大摩尔过量的接头分子一起保温。因此，反应 产物是末端携有聚合接头序列的DNA区段。然后用适当的限制性酶裂解这些 DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中，所述酶能产生与所述DNA区段 相容的末端。从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头。
多核苷酸插入物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适 当启动子上。启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的 例子包括噬菌体久PL启动子、大肠杆菌lac、 trP 、 phoA、 tac启动子、SV40 早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子。其它适当启动子是本领域技术 人员已知的。表达重组载体进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区含有用 于翻译的核糖体结合位点。重组载体表达的转录物的编码部分可包括位于起点处 的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的终止密码子(UAA， UGA或 腐)。
如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括对真核细胞培 养物而言的二氢叶酸还原酶、G41S、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性；以及用于大肠 杆菌和其它细菌培养的四环素、卡那霉素或氨卞青霉素抗性基因。适当宿主的代 表性例子包括但不限于细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞; 真菌细胞，如酵母细胞(如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)；昆虫细胞，如果蝇S2 和夜蛾SF9细胞；动物细胞，如CH0 , COS ， NS0 , 293和Bowes黑素瘤细 胞；和植物细胞。上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域己知的。
本实施例还包括含有本实施例的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。 可以选择能调节插入的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基 因产物的宿主菌株。在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高；因 此，可以控制经基因改造的多肽的表达。另外，不同宿主细胞具有特征性的和特 殊的翻译、翻译后加工和修饰(如磷酸化、裂解)蛋白质的机制。可以选择适当 的细胞系以确保对表达的外源蛋白质进行合乎需要的修饰和加工。
通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿 孔、转导、感染或其它方法，即可将本实施例的核酸和核酸重组载体导入宿主细 胞。所述方法描述于多个标准的实验室手册中，如Davis etal.， BasicMethods In Molecular Biology (1986)。
编码本实施例的人重组Reg4蛋白的多核苷酸可以与含有选择标记的载体连 接以在宿主中增殖。 一般说来，可在沉淀物，如磷酸钙沉淀物或其与带电脂质的 复合物中导入质粒载体。如果载体是病毒，可使用适当的包装细胞系在体外对其 进行包装，再转导至宿主细胞。
通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本实施例的DNA 重组载体的细胞。例如，可培养导入表达重组载体所得的细胞以产生所需多肽。 收集并裂解细胞，使用如Southern ( 1975 ) J. Mol. Biol. 95， 503或Berent et al (1985) Biotech. 3， 208所述的方法，检测其DNA内容物中DNA的存在。 或者，使用抗体检测上清液中蛋白质的存在。
通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本实施例的人重组 Reg4蛋白较为有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离 子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、疏 水电荷作用层析和凝集素层析。在一些实施方案中，可使用高效液相层析(HPLC) 进行纯化。
在一些实施方案中，可使用上述的一种或多种层析方法纯化本实施例的人重 组Reg4蛋白。在其它实施方案中，可使用下述的一种或多种层析柱纯化本实施 例的人重组Reg4蛋白，所述层析柱有Q s印harose FF柱、SP s印harose FF 柱、Q sepharose High Performance柱、Blue sepharose FF柱、 Blue柱、 Phenyl Sepharose FF柱、 DEAE Sepharose FF或Methyl柱。另外，可使用国际公开号W000/44772 (全文列入本文作为参考)中描述的 方法纯化本实施例的人重组Reg4蛋白。本领域技术人员可以容易地改动其中所 述的方法以用于纯化本实施例的人重组Reg4蛋白。可以从包括例如细菌、酵母、 高等植物、昆虫和哺乳动物细胞的原核或真核宿主经重组技术产生的产物中回收 本实施例的人重组Reg4蛋白。
实施例
步骤一，人重组Reg4蛋白表达载体的构建
从人类肝脏cDNA中用引物5' GGAATTCCATATGGATATCATCATGAGACCCAGC 3' (SEQ ID NO: 4)和反向引物5， CGGGATCCCTATGGTCGGTACTTGCACAGG 3' ( SEQ IDN0: 5)(由上海生工合成)PCR出人Reg4基因。引物中加下划线的部分是M/e I和万a力WI的酶切位点。PCR条件为94°C 2分钟94°C 30秒钟，58°C 30秒 钟，68°C 30秒钟，35循环。PCR产物凝胶电泳，回收约500bp的DNA片段(见 图1)，以Nde I和BamH双酶切并将酶切下来的片段包装进入Nde I和BaraH双 酶切的pET30a质粒并测序(Invitrogene)。以卡拉霉素平板挑选阳性克隆，并 将阳性克隆抽提质粒，以Nde I和BamH双酶切验和测序验证正确包装的质粒(SEQ ID NO: 2)。图1为自人Reg4cDNA中PCR出来的人Reg4基因片段和割胶回收后 的Reg4基因片段的电泳图；图2为包装的pET30a质粒示意图，其中斜体部分为 Nde I和BamH的酶切位点，终止子为"TAG"。将包装的pET30a载体转化到BL21 (DE3)大肠杆菌中，并行双酶切、PCR和测序鉴定，选出构建成功的 Reg4-pET30a-BL21工程菌株。
步骤二，人重组Reg4蛋白的表达
步骤一中制备的工程菌株在LB培养基(1% NaCl; 1% Tryptone; 0. 5% Yeast Extract; PH7. 0)中培养至OD600=0. 6左右时，加入IPTG进行诱导(我们使用 的是lmM浓度，然而，更高或者更低的浓度也是适用的)，诱导在37 42'C下摇 床培养进行4小时。诱导结束后离心收集菌体，并以1XPBS (137mMNaCl; 2. 7mM KC1; 4. 3mM Na2HP04;1.4mMKH2P04; pH7. 4)进行洗涤。图3为表达的人重组
Reg4的电泳图；图3中，第一道分子量标记；第二道未经IPTG诱导的工程
菌株；第三道经IPTG诱导的工程菌株；可见在约16kDa处有诱导出来的人重 组Reg4。步骤三，人重组Reg4蛋白的变性及复性
步骤二中离心收集的菌体以超声的方式进行破菌并收集包涵体(新芝 JY92-2D， 500W，适量超声。我们的方法中使用的是3秒超声3秒休息为一个循 环，共30分钟。超声缓冲液1XPBS; 1 mM EDTA; 0.1 mM PMSF; pH7. 4。
Pellet Wash Buffer的组分及含量为:Triton X-100 lml， EDTA 0. 292g， NaCl 0.293g，余量为lxPBS;其中1L lxPBS的组分及含量为:NaCL 8g， KCL 0. 2g， Na2HP04 1.42g, KH2P04 0.27g，余量为水)；
洗涤后以50倍体积的盐酸胍变性溶液溶解(所述盐酸胍变性溶液的组分及 含量为100ml盐酸胍变性溶液的组分及含量为Tris 0. 606g， EDTA 0. 292g, NaCl 0. 293g, Guanidine-HCL 57. 318g，余量为水；pH8. 0);
包涵体充分溶解后再将变性液滴加至复性液中(所述复性液的组分及含量 为1L复性液的组分及含量为:Tris 6.057g， KC1 0.7455g， NaCl 14g， MgCl2 0. 4g， CaCl20. 3g， Guanidine-HCL 47. 76g， Sucrose 136. 92g， Arginine-HCL 105. 35g， GSH 300mg， GSSH 60mg，余量为水)；复性时需严谨控制蛋白浓度， 最佳浓度为0. lmg/mL;
将变性一复性后的蛋白溶液小心封好，4'C静置过夜，12000 rpm离心30 min， 得上清，将上清pH值调至8.0，再离心12000rpm离心30 min，收集上清；之后 将上清用与上清等体积的pH为7. 2的磷酸缓冲液稀释，之后用膜包去盐去水至 稀释后总体积的1/10,再用pH为6. 5的磷酸缓冲液将去水后得到的溶液稀释10 倍，待过柱纯化。发明人发现采用此缓冲液体系可保证复性出来的人重组Reg4 蛋白能被方便的纯化出来并且具有相应的生物学活性。
步骤四，人重组Reg4蛋白的纯化
步骤三中所制备的人重组Reg4蛋白复性液在15000rpm离心30分钟后，取 上清以经膜包去盐去水后，进行离子交换柱纯化。在我们的方法中采用了一步离 子交换柱纯化的方法。步骤如下
(1) Phase A (磷酸盐缓冲液，pH 6.5)平衡柱床用pH为6. 5磷酸盐缓 冲液清洗管路及柱子，直至电导与UV值平衡；
(2) 上样，控制流速为lml/min;
11(3) 用pH为6. 5的含有1M NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱蛋白；
(4) 收集Flow Through (流穿液)观察紫外吸收曲线，在上样时和洗脱 时紫外吸收升高时收集Flow Through;
(5) 纯化后的人重组Reg蛋白以以pH7.4的IXPBS透析；
(6) 透析后的蛋白浓度可达lmg/mL以上，纯度可达98°/。以上，蛋白可直接 以液氮速冻后置于-8(TC低温冰箱保存。
图4为以FPLC方法纯化的人重组Reg4检测结果图；图中显示的是阳离子柱 纯化，根据紫外吸收峰和电导曲线，收集洗脱峰。
以下是对制备得到的Reg 4蛋白进行的相关检测 一，Reg 4蛋白的常规检测
(1) 按照常规SDS-PAGE电泳操作检测纯度。图5为纯化的人重组Reg4电
泳图；如图5所示，第一道分子量标记。第二道未经IPTG诱导后的工程菌 株。第三道经IPTG诱导后的工程菌株。第四道洗涤后包涵体。第五道变 性后上清。第六道阳离子交换柱洗脱下来的纯化的人重组Reg4蛋白。蛋白纯 度经BandScan软件分析其纯度可达98%以上；
(2) 步骤四制备的人重组Reg4蛋白进行HPLC-SEC检测，条件为(条件 ACME 9000 (Younglin， Korea), TSK-GEL G2000SWXL (Tosoh， Japan)上样量为 20ul，蛋白浓度为O. 5ug/ul ，流速为0. 8 mL/rain， UV检测280nm)。可见在 洗脱液中，只有一个峰存在。如图6所示，图6为人重组Reg4纯度的SEC-HPLC 检测结果(3) 按照常规Western blotting检测表达蛋白的特异性。将菌体蛋白经 SDS-PAGE电泳后，转膜到PVDF膜上，5%脱脂奶粉4度封闭过夜，商品化的抗Reg4 抗体室温孵育lh，洗膜3次，二抗室温孵育45mins， ECL检测。图7为人重组 Reg4蛋白western blotting电泳图；图7中，第一道IPTG诱导的菌体蛋白； 第二道未经IPTG诱导的菌体蛋白。可见表达的蛋白确为特异性的Reg4蛋白。
二，人重组Reg4蛋白内毒素检测
采用鲎试剂(厦门鲎试剂实验厂有限公司)，检测了步骤四制备的三批人重 组Reg4蛋白的内毒素含量，均〈lE.U/ug。三，人重组Reg4蛋白活性检测
步骤四制备的人重组Reg4蛋白对于结肠癌细胞显示了较强的促增殖作用。 HCT116 (a)和HT29 (b)细胞长满培养皿70-80%时，在无小牛血清1640培养液 中培养过夜;将HCT116和HT29细胞以1 X 107孔的密度分别接种于％孔培养板， 在0. lml 1640培养液(含10%胎牛血清)中于37°C、含5%C02的孵箱中培养过 夜；吸去培养液，加入0. lml新鲜1640培养液(含5%胎牛血清，但含有不同浓 度的重组hReg4纯品(OnM，， 10 nM， 100 nM， 200 nM， 500 nM， 1000 nM))继 续培养68h;终止培养前加入CCK-8溶液10ul/孔，37。C温育3h，测定0D450nm 和0D490nm值。同时设置空白孔(培养基、CCK-8溶液)，对照孔(细胞、相同 浓度的药物溶解介质、培养液、CCK-8溶液)，每组设定6复孔，结果取其平均 值。图8为纯化后人重组Reg4蛋白对结肠癌细胞促增殖作用的对比图纯化后 人重组Reg4蛋白对对结肠癌细胞显示了较强的促增殖作用。
四，人重组Reg4第12位氨基酸由Gly改为Ala
将步骤一中所述的PCR目的基因片段自起始密码子ATG之后第32位碱基以 定点突变的方法改成G，即(ATGGATATCATCATGAGACCCAGCTGTGCTCCTGGA)改为 (ATGGATATCATCATGAGACCCAGCTGTGCTCCTGCA)，表达并纯化后的蛋白质序列第12 位由Gly变为Ala (见SEQ IDN0:3)，即(MDIIMRPSCAPG)成为(，IIMRPSCAPA)。 对这一纯化后的蛋白质采用了 "三，人重组Reg4蛋白活性检测"中所述的方法， 在变异后的人重组Reg4蛋白浓度为OnM， 10nM， 100nM， 200nM， 500nM， 1000 nM 时，其活性与步骤四制备的人重组Reg4蛋白相比无显著变化。序列表
<110>上海交通大学
<120>人重组Reg4蛋白及其编码基因以及该蛋白的制备方法
<160> 5
<170> Patentln version 3. 3
<210〉 1
<211> 137
〈212> PRT
<213> Homo s即iens
<220>
<221> MUTAGEN 〈222〉 (l)..(l)
<400> 1
Met Asp lie lie Met Arg Pro Ser Cys Ala Pro Gly Trp Phe Tyr His 15 10 15
Lys Ser Asn Cys Tyr Gly Tyr Phe Arg Lys Leu Arg Asn Trp Ser Asp 20 25 30
Ala Glu Leu Glu Cys Gin Ser Tyr Gly Asn Gly Ala His Leu Ala Ser 35 40 45
lie Leu Ser Leu Lys Glu Ala Ser Thr lie Ala Glu Tyr lie Ser Gly 50 55 60
Tyr Gin Arg Ser Gin Pro lie Trp lie Gly Leu His Asp Pro Gin Lys 65 70 75 80Arg Gin Gin Trp Gin Trp lie Asp Gly Ala Met Tyr Leu Tyr Arg Ser
85 90
95
Trp Ser Gly Lys Ser Met Gly Gly Asn Lys His Cys Ala Glu Met Ser
100 105
110
Ser Asn Asn Asn Phe Leu Thr Trp Ser Ser Asn Glu Cys Asn Lys Arg 115 120 125
Gin His Phe Leu Cys Lys Tyr Arg Pro 130 135
<210> 2
<211> 423
<212〉 醒
<213〉 Artificial
〈220〉
〈223>人工序列 <400> 2
catatggata tcatcatgag acccagctgt gctcctggat ggttttacca caagtccaat 60
tgctatggtt acttcaggaa gctgaggaac tggtctgatg ccgagctcga gtgtcagtct 120
tacggaaacg gagcccacct ggcatctatc ctgagtttaa aggaagccag caccatagca 180
gagtscataa gtggctatca gaga3gcc8g ccgat3tgga ttggcctgca cgscccEic3g 240
aagaggcagc agtggcagtg gattgatggg gccatgtatc tgtacagatc ctggtctggc 300
aagtccatgg gtgggaacaa gcactgtgct gagatgagct ccaataacaa ctttttaact 360
tggagcagca acgaatgcaa caagcgccaa cacttcctgt gcaagtaccg accataggga 420
tcc
423<210> 3
<211> 137
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Asp lie lie Met Arg Pro Ser Cys Ala Pro Ala Trp Phe Tyr His 15 10 15
Lys Ser Asn Cys Tyr Gly Tyr Phe Arg Lys Leu Arg Asn Trp Ser Asp 20 25 30
Ala Glu Leu Glu Cys Gin Ser Tyr Gly Asn Gly Ala His Leu Ala Ser 35 40 45
lie Leu Ser Leu Lys Glu Ala Ser Thr lie Ala Glu Tyr lie Ser Gly 50 55 60
Tyr Gin Arg Ser Gin Pro lie Trp lie Gly Leu His Asp Pro Gin Lys 65 70 75 80
Arg Gin Gin Trp Gin Trp lie Asp Gly Ala Met Tyr Leu Tyr Arg Ser 85 90 95
Trp Ser Gly Lys Ser Met Gly Gly Asn Lys His Cys Ala Glu Met Ser 100 105 110
Ser Asn Asn Asn Phe Leu Thr Trp Ser Ser Asn Glu Cys Asn Lys Arg 115 120 125
Gin His Phe Leu Cys Lys Tyr Arg Pro 130 135
16<210〉 4
<211> 34 <212>腿
<213> Artificial
<220>
<223〉人工序列
<400〉 4
ggaattccat atggatatca tcatgagacc cage 34
<210> 5
<211〉 30
<212〉 DNA
<213> Artificial
〈220>
<223>人工序列
〈400> 5
cgggatccct atggtcggta cttgcacagg 30
权利要求
1、一种人重组Reg4蛋白，其特征在于，该蛋白为如下(a)或(b)的蛋白质(a)氨基酸序列如SEQ ID NO1所示的蛋白质；(b)(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有肿瘤细胞促增值活性的由(a)衍生的蛋白质。
2、 一种根据权利要求1所述的人重组Reg4蛋白的DNA编码序列，其特征是， 所述序列如SEQ ID NO: 2所示。
3、 一种制备权利要求l所述的人重组Reg4蛋白的方法，其特征在于，包括 如下步骤步骤一，构建含有编码人重组Reg4蛋白DNA的重组表达载体； 步骤二，制备含有步骤一所得重组表达载体的转化体； 步骤三，培养转化体，表达蛋白； 步骤四，纯化蛋白，得到人重组Reg4蛋白。
4、 根据权利要求3所述的人重组Reg4蛋白的制备方法，其特征是，步骤一 中，所述DNA的序列如SEQ ID NO: 2所示。
5、 根据权利要求3所述的人重组Reg4蛋白的制备方法，其特征是，步骤一 中，所述重组表达载体为原核表达载体或真核表达载体。
6、 根据权利要求3所述的人重组Reg4蛋白的制备方法，其特征是，步骤一 中，所述重组表达载体为原核表达载体。
7、 根据权利要求3所述的人重组Reg4蛋白的制备方法，其特征是，步骤一 中，所述重组表达载体为pET30a质粒。
8、 根据权利要求3所述的人重组Reg4蛋白的制备方法，其特征是，步骤二 中，所述转化体为大肠杆菌。
9、 根据权利要求8所述的人重组Reg4蛋白的制备方法，其特征是，在步 骤三之后和步骤四之前包括如下步骤将大肠杆菌破菌并收集包涵体，包涵体用 Pellet Wash Buffer洗涤后，溶解至盐酸胍变性溶液中，然后再将盐酸胍变性 溶液加入到复性液中，得到复性后的人重组Reg4蛋白溶液；其中，所述复性液 的组分及含量为1L复性液的组分及含量为Tris 6.057g， KC1 0. 7455g， NaCl14g, MgCl20. 4g， CaCl20. 3g， G腦idine-HCL 47. 76g， Sucrose 136. 92g， Arginine-HCL 105. 35g， GSH 300mg， GSSH 60mg，余量为水。
10、 根据权利要求9所述的人重组Reg4蛋白的制备方法，其特征是，所述 复性后的人重组Reg4蛋白溶液中人重组Reg4蛋白浓度为0. lmg/tnL。
11、 根据权利要求9所述的人重组Reg4蛋白的制备方法，其特征是，对得 到的复性后的人重组Reg4蛋白溶液进行如下处理4'C静置过夜，12000 rpm离 心30 min，得上清，将上清pH值调至8. 0，再离心12000rpm离心30 min，收 集上清；之后将上清用与上清等体积的pH为7. 2的磷酸缓冲液稀释，之后用膜 包去盐去水至稀释后总体积的1/10，再用pH为6. 5的磷酸缓冲液将去水后得到 的溶液稀释10倍。
12、 根据权利要求3所述的人重组Reg4蛋白的制备方法，其特征是，步骤 四中，所述纯化为阳离子交换柱纯化，具体为步骤一，用pH为6.5磷酸盐缓冲液清洗管路及阳离子交换柱，直至电导与 UV值平衡；步骤二，上样，控制流速为lml/min;步骤三，用pH为6. 5的含有1M NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱蛋白； 步骤四，收集流穿液。
13、 根据权利要求12所述的人重组Reg4蛋白的制备方法，其特征是，所述 阳离子交换柱为S/CM柱。
全文摘要
一种基因工程技术领域的人重组Reg4蛋白及其编码基因以及该蛋白的制备方法。本发明涉及一种人重组Reg4蛋白，该蛋白为如下(a)或(b)的蛋白质(a)氨基酸序列如SEQ ID NO1所示的蛋白质；(b)(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有肿瘤细胞促增值活性的由(a)衍生的蛋白质；本发明还涉及编码所述人重组Reg4蛋白的DNA序列；本发明还提供了制备所述人重组Reg4蛋白的方法构建含有编码人重组Reg4蛋白DNA的重组表达载体；制备含有步骤一所得重组表达载体的转化体；培养转化体，表达蛋白；纯化蛋白，得到人重组Reg4蛋白。本发明所提供的人重组Reg4蛋白为直接具有活性的形式，制备方法简单、成本低廉，蛋白产品纯度达到98％以上，内毒素含量低，活性高。
文档编号C07K14/435GK101648995SQ20091005633
公开日2010年2月17日 申请日期2009年8月13日 优先权日2009年8月13日
发明者胡国勇, 伟 韩 申请人:上海交通大学