专利名称：Gibc基因及其编码的蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及GIBC基因(G-patch protein Implicated in BreastCarcinogenesis)，该基因编码的蛋白，含有该基因的表达载体及其在肿瘤治疗中的应用。
背景技术：
肿瘤细胞的生长和增殖与许多蛋白有关，找出编码这些蛋白的基因，抑制基因表达这些蛋白，可有效阻止肿瘤细胞的生长和增殖，从而达到治疗肿瘤的效果。
发明内容
本发明发现了一种与乳腺癌等的癌细胞的生长和增殖有关的蛋白，克隆了编码该蛋白的基因，构建了含有该基因的表达载体和含有该表达载体的宿主细胞，并且发现该蛋白可促进乳腺癌、子宫癌、肝癌等肿瘤细胞的生长和增殖，基于以上发现，完成了本发明。
因此，在一个方面，本发明提供了可促进肿瘤细胞的生长和增殖的蛋白，尤其重组蛋白，该蛋白具有序列表中序列2所示的氨基酸序列，或者通过所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失，取代或增加而得到的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了编码上述蛋白的基因，它是具有序列1所示的碱基序列的DNA或者与所述DNA在严格条件下杂交的DNA。
在另一个方面，本发明提供了含有上述基因或者编码上述蛋白的基因的表达载体。
在又一个方面，本发明提供了由上述表达载体转化的宿主细胞。
在另一个方面，本发明提供了生产本发明的重组蛋白的方法，该方法包括下列步骤培养上述转化的宿主细胞，使转化细胞产生本发明的重组蛋白；和从培养物中分离出重组蛋白。
在另一个方面，本发明提供了针对上述蛋白的抗体，它是使用所述重组蛋白作为免疫原而产生的特异性抗体。它可以是单克隆或多克隆抗体。
在另一个方面，本发明提供了检测所述蛋白的试剂盒，它含有上述特异性抗体，可以进行抗原-抗体反应，用于检测具有序列2所示的蛋白。
此外，本发明提供了用于检测序列1所示的核苷酸序列的探针诊断试剂盒，它含有与核苷酸序列1中的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。
本发明还提供了用于PCR扩增的引物，该引物为P1gat agc ggc cgc atg gac gag gag ag
P2gcg cgg atc cct aga act cag tca tc。
本发明还提供了上述基因、蛋白或抗体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
附图简述
图1是本发明蛋白的结构示意图。
图2是GIBC的原核表达图。
图3是GIBC对肿瘤细胞生长增值的影响，在每组方柱中，左侧为载体，右侧为GIBC。
以下是本发明的详细描述。
基因获取方式根据基因芯片检测所获EST序列，再通过生物信息学分析数据，设计了上下游引物，以乳腺cDNA文库作为模板进行PCR扩增，获取了该基因的ORF。引物设计如下P1gat agc ggc cgc atg gac gag gag agP2gcg cgg atc cct aga act cag tca tc此基因被命名为GIBC(G-patch protein Implicated in BreastCarcinogenesis)。
真核表达载体的构建以下列序列为引物，经过PCR扩增，克隆到pcDNA3.1(-)(Invitrogen)载体中，经转化DH5α(Invitrogen)菌株，得到GIBC的真核表达载体。
ups 5’-GGAATTCGCCACCATGGACGAGGAGAGC-3’(EcoRI)downs 5’-CGGGATCCACGAACTCAGTCATCTTC-3’(BamHI)原核表达载体的构建以下列序列为引物，经过PCR扩增，克隆到pGEX-4T-3(Amersham)载体中，经转化BL21(Invitrogen)菌株，得到GIBC的原核表达载体。
ups 5’-GGAATTCCATGGACGAGGAGAGC-3’downs5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCTAGAACTCAGTCATCTTC-3’此基因定位与染色体20q13.3，全长为1882bp。表达蛋白约55kD。ORF序列(1536bp)。编码蛋白其开放阅读框架编码一个511个氨基酸的蛋白质。根据生物信息学预测，这个蛋白质含有三个主要的结构域，第一个是从第180至第198个氨基酸的C3H1型锌指结构，第二个是从第313至第359个氨基酸的G-patch结构域，第三个是从第119个至第128个氨基酸的多聚谷氨酸结构域。图1是该蛋白的示意图。
同源序列
H.sapiens KIAA1847 KIAA1847M.musculus BC021513 cDNA sequence BC021513R.norvegicu LOC296478 similar to cDNA sequences BC021513D.melanogas CG4709Drosophila melanogaster CG4709ter geneA.gambiae 1281359 Anopheles gambiae str.PESTENSANGG0000001...
A.thaliana At2g24830 Arabidopsis thaliana At2g24830gene对其进行生物信息学分析，发现其广谱表达。
cDNA sourcesNEUROBLASTOMA COT 25-NORMALIZED；PLACENTACOT 25-NORMALIZED；成人脑；肾；淋巴；浆液乳头状癌，高级，2种合并肿瘤；子宫；合并的软骨肉瘤肿瘤细胞；pnet；denis_drash；宫颈；绒毛膜癌；黑素瘤；胃；退行发育术的寡枝神经胶质细胞瘤；肺，细胞系；CNCAP(3)T-225细胞系；小细胞癌；腺癌；用EGFR放大的恶性胶质瘤；结肠肿瘤，RER+；淋巴瘤细胞系；epid_tumor；骨肉瘤，细胞系；正常胎盘；肺肿瘤；大细胞癌；中等分化腺癌；乳房；转移细胞乳头状瘤，细胞系；腺癌细胞系；正常色素视网膜上皮；下丘脑；海马；神经肿瘤；正常神经；混合的肺和脾；混合的脑，肺，睾丸；混合的胰腺和脾；脑；白血球；导管癌，细胞系；成神经细胞瘤，细胞系；平滑肌肉瘤；卵巢(pool of 3)；脾；睾丸；胎儿眼睛，晶状体，眼睛前段，视神经，视网膜，视网膜凹区和斑，RPE和脉络膜；晶状体；腹水；心脏；胃；天然杀伤细胞，细胞系；肝脏；结肠；肺；原发性肺囊性纤维化上皮细胞；郎格罕氏岛；bocio_tumor；testis_normal；鳞状细胞癌，细胞系；腺癌，细胞系；坐骨神经；细胞系泪腺；前列腺；肝脏；视神经；；Aveolar巨噬细胞；人肺上皮细胞；肝脏和脾上皮(细胞系)。
通过使用本发明的蛋白或者免疫学上等效的多肽，可以获得其抗体，抗体用于所述蛋白的检测和纯化。可以利用本发明的蛋白或其部分氨基酸序列作为免疫原来产生抗体。可以通过将抗体接种给宿主动物并回收血清的常规方法产生多克隆抗体。还可以通过常规杂交瘤方法产生单克隆抗体。
利用MTT法检测不同浓度的GIBC对MCF-7和T47-D(乳腺癌细胞)、ECC-1和Ishikawa(子宫癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)细胞等肿瘤细胞增殖的影响，结果发现，GIBC有促进肿瘤细胞增殖的作用。
通过抑制所述蛋白表达，或通过利用针对所述蛋白的抗体，可以抑制肿瘤细胞的生长和增殖，从而可以达到治疗肿瘤的目的。
实施例实施例1用PCR方法从人乳腺癌文库克隆编码GIBC蛋白的基因用乳腺癌文库(Clontech公司)为模板，用下列引物进行PCR扩增
Primer15’-gat agc ggc cgc atg gac gag gag ag-3’Primer25’-gcg cgg atc cct aga act cag tca tc-3’扩增反应条件在50μl的反应体系中含有50mmol/L KCL，10mmol/L Tris-Cl(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/LdNTP，20pmol引物，1U的Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa公司产品)。在PTC-100型PCR仪(MJR公司)上按下列条件反应25个周期94℃ 30sec；56℃ 1min；72℃ 2min。扩增产物用QIAGEN公司的PCR纯化试剂盒纯化，用DNA限制性内切酶NotI和BamHI(NEB公司)进行切割(37℃ 12Hours)。由博亚公司进行测序得到一1536bp序列。
实施例2GIBC在原核细胞中的表达及纯化pGEX-4T-3-GIBC可以在大肠杆菌BL21菌株中30℃诱导表达GST-GIBC的融合蛋白，首先制备BL21的感受态细胞挑取单克隆到适量培养基中，37℃ 250rpm培养至A6000.4-0.5，2500g离心15分钟，备用。将1-50ng pGEX-4T-3-GIBC转化到上述制备的感受态细胞中，用Glutathione Sepharose 4B进行纯化，纯化的步骤如下(1)取单克隆到2-3mL 2YTA培养基中培养4-5小时。转接到100mL的锥形瓶中生长过夜。
(2)转接到500mL的锥形瓶中培养3-5小时。
(3)加0.5mL 1M IPTG 30℃，培养3-6小时。
(4)3000rpm 10分钟离心收集细胞。
(5)用25mL PBS重悬细胞。超声10分钟。
(6)加1.25mL 20％Triton X-100，混匀1小时。
(7)1000rpm 10分钟离心，加入0.5mL 50％slurry of GlutathioneSepharose 4B，室温30分钟。
(8)1000rpm 5分钟离心，PBS洗三遍。
(9)用0.5mL洗脱Buffer洗脱，短暂离心后收集上清。
电泳结果如图2所示。
实施例3MTT法检测不同浓度的GIBC对肿瘤细胞增殖的影响MTT(四甲基偶氮唑兰)可被细胞摄取，并被活细胞内线粒体脱氢酶还原成一种不溶于水的蓝紫色产物甲瓒，并沉淀于细胞中，而死细胞没有这种功能。甲瓒可溶于二甲基亚砜(DMSO)，溶液在570nm处有最大吸收。故该波段处吸收值越大代表存活细胞量越多。MTT法广泛应用于细胞毒性实验、细胞生长测定等。本实验利用MTT法观察SIP对MCF-7生长的影响。具体操作方法如下将培养到对数生长期的MCF-7和T47-D(乳腺癌细胞)、ECC-1和Ishikawa(子宫癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)细胞接种于96孔板中，每孔接种细胞数为1×104个。次日按照浓度梯度加入SIP(25、50、100ng)，每浓度作用6孔细胞，37℃，5％CO2进行培养。分别培养1d、2d、3d、4d后，在每个细胞培养孔内加入50μlL 1mg/mL的MTT溶液，同样培养条件下作用4小时后取出，小心吸出每孔内液体，每孔加入二甲基亚砜150μL，轻微振荡10分钟，使蓝紫色结晶充分溶解在二甲基亚砜中。用自动酶标仪测量96孔板中每孔在570nm处的吸光值。结果如图3所示，说明本发明的蛋白具有促进肿瘤细胞增殖的作用。
GIBC序~1SEQUENCE LISTING<110>北京大学<120>GIBC基因其编码的蛋白和应用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1536<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)..(1533)<223>
<400>1atg gac gag gag agc ctg gag tcg gcc ttg cag acc tac cgt gcg cag 48Met Asp Glu Glu Ser Leu Glu Ser Ala Leu Gln Thr Tyr Arg Ala Gln1 5 10 15ctg cag cag gtg gag ctg gcc ttg ggc gcc ggc ctg gat tcg tct gag 96Leu Gln Gln Val Glu Leu Ala Leu Gly Ala Gly Leu Asp Ser Ser Glu20 25 30cag gct gac ctg cgc cag ctg cag ggg gac ctg aag gag ctc atc gag144Gln Ala Asp Leu Arg Gln Leu Gln Gly Asp Leu Lys Glu Leu Ile Glu35 40 45ctc acc gag gcc agc ctg gtg tct gtc agg aag agc agg ttg ttg gcc192Leu Thr Glu Ala Ser Leu Val Ser Val Arg Lys Ser Arg Leu Leu Ala50 55 60gcg ctg gac gaa gag cgc ccg ggc cgc cag gaa gat gct gag tac cag240Ala Leu Asp Glu Glu Arg Pro Gly Arg Gln Glu Asp Ala Glu Tyr Gln65 70 75 80gct ttc cgg gag gcc atc act gag gcg gtg gag gca cca gca gcg gcc288Ala Phe Arg Glu Ala Ile Thr Glu Ala Val Glu Ala Pro Ala Ala Ala85 90 95cgt ggg tcc gga tca gag acc gtt cct aaa gca gag gcg ggg cca gaa336Arg Gly Ser Gly Ser Glu Thr Val Pro Lys Ala Glu Ala Gly Pro Glu100 105 110tct gcg gca ggt ggg cag gag gag gaa gag gga gag gac gag gaa gag384Ser Ala Ala Gly Gly Gln Glu Glu Glu Glu Gly Glu Asp Glu Glu Glu115 120 125ctg agt ggg aca aag gtg agc gcg ccc tac tac agc tcc tgg ggc act432
GIBC序~1Leu Ser Gly Thr Lys Val Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Ser Trp Gly Thr130 135 140ctg gag tat cac aac gcc atg gtg gtg gga acg gaa gag gcg gag gat 480Leu Glu Tyr His Asn Ala Met Val Val Gly Thr Glu Glu Ala Glu Asp145 150 155 160ggc tcg gcg ggt gtc cgt gtg ctt tac ctg tac ccc act cac aag tct 528Gly Ser Ala Gly Val Arg Val Leu Tyr Leu Tyr Pro Thr His Lys Ser165 170 175ctg aag ccg tgc ccg ttc ttc ctg gag gga aag tgc cgc ttt aag gag 576Leu Lys Pro Cys Pro Phe Phe Leu Glu Gly Lys Cys Arg Phe Lys Glu180 185 190aac tgc agg ttc tcc cat ggg cag gtg gtc tct ctg gat gag ctg cgc 624Asn Cys Arg Phe Ser His Gly Gln Val Val Ser Leu Asp Glu Leu Arg195 200 205ccc ttc cag gac cca gac ctg agc tcc ctg cag gcc ggc tct gcg tgt 672Pro Phe Gln Asp Pro Asp Leu Ser Ser Leu Gln Ala Gly Ser Ala Cys210 215 220ctg gcc aag cac cag gat ggc ctc tgg cac gca gca cgc atc acc gat 720Leu Ala Lys His Gln Asp Gly Leu Trp His Ala Ala Arg Ile Thr Asp225 230 235 240gtg gac aac ggc tac tac aca gtc aag ttt gac tcg ctg ctg ctg agg 768Val Asp Asn Gly Tyr Tyr Thr Val Lys Phe Asp Ser Leu Leu Leu Arg245 250 255gag gcc gtg gtg gag ggg gac ggc atc ctg ccc cca ctg cgc aca gag 816Glu Ala Val Val Glu Gly Asp Gly Ile Leu Pro Pro Leu Arg Thr Glu260 265 270gcc aca gag tcc gac tca gac agc gac ggt acg ggt gac tcc agc tat 864Ala Thr Glu Ser Asp Ser Asp Ser Asp Gly Thr Gly Asp Ser Ser Tyr275 280 285gcc aga gtg gtg ggg tca gat gct gtg gac tct ggg acc tgc agc tct 912Ala Arg Val Val Gly Ser Asp Ala Val Asp Ser Gly Thr Cys Ser Ser290 295 300gcc ttt gct ggc tgg gag gtg cac acg cga ggt ata ggc tcc aga ctc 960Ala Phe Ala Gly Trp Glu Val His Thr Arg Gly Ile Gly Ser Arg Leu305 310 315 320ctc acc aag atg ggc tat gag ttt ggc aag ggt ttg ggc cga cac gcg1008Leu Thr Lys Met Gly Tyr Glu Phe Gly Lys Gly Leu Gly Arg His Ala325 330 335gaa ggc cgg gtg gag ccc atc cat gct gtg gtg ttg cct cga ggg aag1056Glu Gly Arg Val Glu Pro Ile His Ala Val Val Leu Pro Arg Gly Lys340 345 350tcg ctg gac cag tgt gtg gag acc ctg cag aag cag acc agg gtt ggc1104
GIBC序~1Ser Leu Asp Gln Cys Val Glu Thr Leu Gln Lys Gln Thr Arg Val Gly355 360 365aag gct ggc acc aac aag ccc ccc agg tgc cgg gga aga ggg gcc agg1152Lys Ala Gly Thr Asn Lys Pro Pro Arg Cys Arg Gly Arg Gly Ala Arg370 375 380cct ggg ggc cgc cca gct cct cgg aat gtg ttt gac ttc ctc aat gaa1200Pro Gly Gly Arg Pro Ala Pro Arg Asn Val Phe Asp Phe Leu Asn Glu385 390 395 400aag ctg caa ggt cag gct cct ggg gcc cta gaa gcc ggg gcg gcc cca1248Lys Leu Gln Gly Gln Ala Pro Gly Ala Leu Glu Ala Gly Ala Ala Pro405 410 415gcg ggg agg agg agc aag gac atg tac cat gcc agc aag agt gcc aag1296Ala Gly Arg Arg Ser Lys Asp Met Tyr His Ala Ser Lys Ser Ala Lys420 425 430cgg gcc ctg agc ctg cgg ctc ttc cag act gag gag aag atc gag cga1344Arg Ala Leu Ser Leu Arg Leu Phe Gln Thr Glu Glu Lys Ile Glu Arg435 440 445acc cag cgg gac atc agg agc atc cag gag gct ctc gcc cgc aac gct1392Thr Gln Arg Asp Ile Arg Ser Ile Gln Glu Ala Leu Ala Arg Asn Ala450 455 460ggc cgg cat agc gtg gcg tca gcc cag ctg cag gag aag ctg gca gga1440Gly Arg His Ser Val Ala Ser Ala Gln Leu Gln Glu Lys Leu Ala Gly465 470 475 480gcc cag cgc cag ctg ggg cag ctc cgg gct cag gaa gcc ggc ctg cag1488Ala Gln Arg Gln Leu Gly Gln Leu Arg Ala Gln Glu Ala Gly Leu Gln485 490 495cag gag cag agg aag gca gac acc cac aag aag atg act gag ttc tag1536Gln Glu Gln Arg Lys Ala Asp Thr His Lys Lys Met Thr Glu Phe500 505 510<210>2<211>511<212>PRT<213>人<400>2Met Asp Glu Glu Ser Leu Glu Ser Ala Leu Gln Thr Tyr Arg Ala Gln1 5 10 15Leu Gln Gln Val Glu Leu Ala Leu Gly Ala Gly Leu Asp Ser Ser Glu20 25 30Gln Ala Asp Leu Arg Gln Leu Gln Gly Asp Leu Lys Glu Leu Ile Glu
GIBC序~135 40 45Leu Thr Glu Ala Ser Leu Val Ser Val Arg Lys Ser Arg Leu Leu Ala50 55 60Ala Leu Asp Glu Glu Arg Pro Gly Arg Gln Glu Asp Ala Glu Tyr Gln65 70 75 80Ala Phe Arg Glu Ala Ile Thr Glu Ala Val Glu Ala Pro Ala Ala Ala85 90 95Arg Gly Ser Gly Ser Glu Thr Val Pro Lys Ala Glu Ala Gly Pro Glu100 105 110Ser Ala Ala Gly Gly Gln Glu Glu Glu Glu Gly Glu Asp Glu Glu Glu115 120 125Leu Ser Gly Thr Lys Val Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Ser Trp Gly Thr130 135 140Leu Glu Tyr His Asn Ala Met Val Val Gly Thr Glu Glu Ala Glu Asp145 150 155 160Gly Ser Ala Gly Val Arg Val Leu Tyr Leu Tyr Pro Thr His Lys Ser165 170 175Leu Lys Pro Cys Pro Phe Phe Leu Glu Gly Lys Cys Arg Phe Lys Glu180 185 190Asn Cys Arg Phe Ser His Gly Gln Val Val Ser Leu Asp Glu Leu Arg195 200 205Pro Phe Gln Asp Pro Asp Leu Ser Ser Leu Gln Ala Gly Ser Ala Cys210 215 220Leu Ala Lys His Gln Asp Gly Leu Trp His Ala Ala Arg Ile Thr Asp225 230 235 240Val Asp Asn Gly Tyr Tyr Thr Val Lys Phe Asp Ser Leu Leu Leu Arg245 250 255Glu Ala Val Val Glu Gly Asp Gly lle Leu Pro Pro Leu Arg Thr Glu
GIBC序~1260 265 270Ala Thr Glu Ser Asp Ser Asp Ser Asp Gly Thr Gly Asp Ser Ser Tyr275 280 285Ala Arg Val Val Gly Ser Asp Ala Val Asp Ser Gly Thr Cys Ser Ser290 295 300Ala Phe Ala Gly Trp Glu Val His Thr Arg Gly Ile Gly Ser Arg Leu305 310 315 320Leu Thr Lys Met Gly Tyr Glu Phe Gly Lys Gly Leu Gly Arg His Ala325 330 335Glu Gly Arg Val Glu Pro Ile His Ala Val Val Leu Pro Arg Gly Lys340 345 350Ser Leu Asp Gln Cys Val Glu Thr Leu Gln Lys Gln Thr Arg Val Gly355 360 365Lys Ala Gly Thr Asn Lys Pro Pro Arg Cys Arg Gly Arg Gly Ala Arg370 375 380Pro Gly Gly Arg Pro Ala Pro Arg Asn Val Phe Asp Phe Leu Asn Glu385 390 395 400Lys Leu Gln Gly Gln Ala Pro Gly Ala Leu Glu Ala Gly Ala Ala Pro405 410 415Ala Gly Arg Arg Ser Lys Asp Met Tyr His Ala Ser Lys Ser Ala Lys420 425 430Arg Ala Leu Ser Leu Arg Leu Phe Gln Thr Glu Glu Lys Ile Glu Arg435 440 445Thr Gln Arg Asp Ile Arg Ser Ile Gln Glu Ala Leu Ala Arg Asn Ala450 455 460Gly Arg His Ser Val Ala Ser Ala Gln Leu Gln Glu Lys Leu Ala Gly465 470 475 480Ala Gln Arg Gln Leu Gly Gln Leu Arg Ala Gln Glu Ala Gly Leu Gln
GIBC序~1485 490 495Gln Glu Gln Arg Lys Ala Asp Thr His Lys Lys Met Thr Glu Phe500 505 510
权利要求
1.可促进肿瘤细胞的生长和增殖的蛋白，尤其重组蛋白，该蛋白具有序列表中序列2所示的氨基酸序列，或者通过所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失，取代或增加而得到的氨基酸序列。
2.编码权利要求1的蛋白的基因，它是具有序列1所示的碱基序列的DNA或者与所述DNA在严格条件下杂交的DNA。
3.含有权利要求2的基因或者编码权利要求1的蛋白的基因的表达载体。
4.由权利要求3的表达载体转化的宿主细胞。
5.生产权利要求1的重组蛋白的方法，该方法包括下列步骤培养权利要求4的转化的宿主细胞，使转化细胞产生权利要求1的重组蛋白；和从培养物中分离出重组蛋白。
6.针对权利要求1的蛋白的抗体，它是使用所述重组蛋白作为免疫原而产生的特异性抗体。
7.检测权利要求1的蛋白的试剂盒，它含有权利要求6的特异性抗体，可以进行抗原-抗体反应，用于检测具有序列2所示的蛋白。
8.用于检测序列1所示的核苷酸序列的探针诊断试剂盒，它含有与核苷酸序列1中的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。
9.用于权利要求2的基因的PCR扩增的引物，该引物为P1gat agc ggc cgc atg gac gag gag agP2gcg cgg atc cct aga act cag tca tc。
10.权利要求1的蛋白或权利要求2的基因在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及GIBC基因，该基因编码的蛋白，含有该基因的表达载体及其在医学中的应用。
文档编号G01N33/53GK1807454SQ200510011198
公开日2006年7月26日 申请日期2005年1月18日 优先权日2005年1月18日
发明者尚永丰, 吴歌 申请人:北京大学