重组蛋白疫苗、含编码该重组蛋白疫苗的基因的重组表达载体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组蛋白疫苗含编码该重组蛋白疫苗的 基因的重组表达载体及其应用。
【背景技术】
[0002] EB病毒（Epstein-Barr Virus, EBV)是一种含172kb DNA基因组的人类γ疱疫病 毒，被世界卫生组织归为第一类致瘤病毒，在人群中感染非常普遍，90%以上的个体在4岁 以前就已经感染EB病毒，但不引起症状，能够在B淋巴细胞中建立潜伏感染，刺激细胞增殖 和转化。EB病毒与多种疾病的发生有关，如鼻咽癌、传染性单核细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、 胃癌、获得性免疫缺陷综合症相关的中枢神经系统淋巴瘤等。
[0003] 截止目前的研究进展，EB病毒核抗原I (EBNAl)是病毒编码的DNA结合蛋白，是 病毒DNA复制、病毒基因维持终生感染和B淋巴细胞永生化过程中唯一必需的病毒蛋白；此 外，EB病毒核抗原1是唯一在所有类型EB病毒感染细胞核和EB病毒相关肿瘤组织中一贯 表达的病毒蛋白。在EB病毒潜伏感染中起多项重要作用，包括招募病毒复制所需的细胞蛋 白和酶到病毒DNA复制起点、激活病毒潜伏期基因转录和协调持续感染过程中的DNA复制 等。最新研究表明，EB病毒核抗原1显性抑制和EB病毒核抗原IsiRNA (RNA干扰)都能抑 制感染细胞的病毒复制并防止EB病毒相关肿瘤的增殖。
[0004] 单纯疱疹病毒（HSV)糖蛋白gD是病毒囊膜的结构成分，也是病毒进入宿主细胞必 不可少的结构。糖蛋白与单纯疱疹病毒进入调解分子结合，能够阻断T细胞激活过程中的 免疫抑制信号，激活T淋巴细胞，可以明显提高CD4和CD8T细胞对抗原的反应功能。
[0005] 目前，EBV特异性抗原肽疫苗是肿瘤疫苗研究领域的热点，主要针对在EB病毒感 染或潜伏期中特异性的靶点，如gp350、LMP1、LMP2和EBNA3A等，研发针对这些靶点的疫 苗，通过抑制表达相应的蛋白以达到治疗EB病毒相关肿瘤的目的，但是，现有研究中的疫 苗仅以单一 EB病毒蛋白为靶抗原，并且大部分靶抗原仅在病毒感染的特定时期表达，不能 全面、有效地抗EB病毒感染、消除EB病毒及其相关的疾病和肿瘤。
[0006] 因此，相比针对单一靶点治疗，有必要提供一种多靶点、多途径预防EB病毒感染、 消除EB病毒及其相关疾病和肿瘤的疫苗。
【发明内容】
[0007] 为解决上述问题，本发明提供了一种重组蛋白疫苗，该重组蛋白疫苗含EB病毒核 抗原I(EBNAl)的抗原表位，以及人类疱疹病毒糖蛋白的抗原表位，，该融合蛋白不仅能够有 效激活特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL)反应，直接抑制表达EBNAl，发挥EB病毒相关肿瘤 的治疗效果；还能通过疱疹病毒糖蛋白直接阻断免疫抑制途径，提高调节性T细胞的活性； 因此，本发明提供的重组蛋白疫苗能更全面、多途径预防或治疗EB病毒感染及其相关的疾 病和肿瘤；本发明还提供了含编码该重组蛋白疫苗的基因的重组表达载体和该重组蛋白疫 苗的应用。
[0008] 第一方面，本发明提供了一种重组蛋白疫苗，所述重组蛋白疫苗包括EB病毒核抗 原1的抗原表位，以及人类疱疹病毒糖蛋白的抗原表位。
[0009] 优选地，所述EB病毒核抗原1的抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0010] 优选地，所述人类疱疹病毒糖蛋白为人类疱疹病毒1型糖蛋白、人类疱疹病毒2型 糖蛋白、人类疱疹病毒3型糖蛋白、人类疱疹病毒4型糖蛋白、人类疱疹病毒5型糖蛋白、人 类疱疹病毒6型糖蛋白、人类疱疹病毒7型糖蛋白或人类疱疹病毒8型糖蛋白。
[0011] 优选地，所述人类疱疹病毒1型糖蛋白的抗原表位选自如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列中的一种。
[0012] 优选地，所述重组蛋白疫苗的氨基酸序列的N端到C端由SEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:3所示序列依次排列组成。
[0013] 进一步优选地，编码所述SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示氨基酸 序列的碱基序列分别如SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示。
[0014] 本发明提供的重组蛋白疫苗含EB病毒核抗原I (EBNAl)的抗原表位，以及人类疱 疹病毒I型糖蛋白的抗原表位，能同时表达含有EBNAl抗原表位以及疱疹病毒糖蛋白抗原 表位的融合蛋白，该融合蛋白不仅能够通过EBNAl的抗原表位有效激活特异性细胞毒性T 淋巴细胞（CTL)反应，抑制表达EBNAl肿瘤细胞的分裂和增殖，发挥EB病毒相关肿瘤的治 疗效果；还能通过疱疹病毒糖蛋白的抗原表位与肿瘤坏死因子家族成员BTLA竞争结合单 纯疱疹病毒进入调解分子（HVEM)，BTLA-HVEM作为免疫抑制通路的一部分抑制B淋巴细胞 和T淋巴细胞的活化；疱疹病毒糖蛋白能够阻断BTLA结合到HVEM，阻断免疫抑制途径，提 高调节性T细胞的活性，通过多途径协同预防或治疗EB病毒感染、消除EB病毒及其相关的 疾病和肿瘤。
[0015] 第二方面，本发明提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有编码如第一 方面所述的重组蛋白疫苗的核苷酸序列。
[0016] 优选地，所述表达载体为原核表达载体或真核表达载体。
[0017] 进一步优选地，所述原核表达载体为pET_28a (+)、pET_32a (+)。
[0018] 进一步优选地，所述真核表达载体为p⑶NA3. 1、p3x-FLAG_myc。
[0019] 第三方面，本发明提供了一种如第二方面所述重组表达载体的制备方法，包括如 下步骤：
[0020] (I )、PCR扩增得到编码EB病毒核抗原EBNAl的抗原表位的基因，其中，所述PCR的 上游引物和下游引物的基因序列分别如EBNAl-F和EBNAl-R所示：
[0021] EBNAl-F: 5 ' -ATGTCTGACGAGGGGCCAGG-3 '
[0022] EBAN1-R:5,-CTCCTGCCCTTCCTCACCCT-3,；
[0023] (2)、提供或制备两对PCR引物，其中，第一对PCR引物的上游引物和下游引物基因 序列分别如gD-UpF和gDHJpR-ΕΒΝΑΙ所不：
[0024] gD-UpF: 5，-GGAATTCCATGGGTCCGCGGCAAATATGC-3，
[0025] gD-UpR-EBNA1:5，-CCTGGCCCCTCGTCAGACATGGGCCCGTGCCACCCGGCGAT-3，
[0026] 所述下游引物gD-UpR-EBNAl中的序列
[0027] CCTGGCCCCTCGTCAGACAT与步骤（1)所得编码EBNAl抗原表位基因的一条链的5' 端序列特异性互补；
[0028] 第二对PCR引物的上游引物和下游引物基因序列分别如gD-DnF-EBNAl和gD-DnR 所示：
[0029] gD-DnF-EBNA1:5，-AGGGTGAGGAAGGGCAGGAGAAGGCCCCATACACGAGCAC-3，
[0030] gD-DnR: 5，-AAATATGCGGCCGCGTTGTTCGGGGTGG-3 '
[0031] 其中，所述上游引物gD-DnF-EBNAl中的序列
[0032] AGGGTGAGGAAGGGCAGGAG与步骤（1)所得编码EBNAl抗原表位基因的另一条链的5' 端序列特异性互补；
[0033] 采用所述第一对PCR引物和第二对PCR引物分别扩增得到编码人类疱疹病毒1型 糖蛋白HSV-gD抗原表位基因的两个片段；
[0034] (3)、利用重叠 PCR技术，将步骤（1)扩增得到的编码EBNAl抗原表位的基因和步 骤（2)扩增得到的编码HSV-gD抗原表位的基因的两个片段在无引物条件下，运行3~5个 PCR循环，得到编码重组蛋白疫苗的融合基因，所述融合基因为在编码HSV-gD抗原表位的 基因中插入编码EBNAl抗原表位的基因；
[0035] (4)、以步骤（2)所述gD-UpF和gD-DnR为PCR引物，以步骤（3)得到融合基因为 PCR模板进行PCR反应扩增融合基因；
[0036] (5)、将扩增后的融合基因插入到表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体，所 述重组表达载体含有编码重组蛋白疫苗的核苷酸序列。
[0037] 其中，所述 EBNA1-F、EBNA1-R、gD-UpF、gD-UpR-EBNAl、gD-DnF-EBNAl 和 gD-DnR 的 核苷酸序列分别如 SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11 和 SEQ ID NO: 12 所示。
[0038] 优选地，所述步骤（5)中，所述表达载体为原核表达载体或真核表达载体。
[0039] 进一步优选地，所述原核表达载体为pET_28a (+)、pET_32a (+)。
[0040] 进一步优选地，所述真核表达载体为p⑶NA3. I、p3x-FLAG-CMV。
[0041] 优选地，所述步骤（5)中，所述将扩增后的融合基因插入到表达载体的多克隆位点 的步骤中，所述多克隆位点为pET-28a(+)载体的EcoR I和Not I酶切位点。
[0042] 在本发明的优选方式中，通过分别设计特异性引物EBNAl-F和EBNA1-R、gD-UpF和 gD-UpR-EBNAl、gD-DnF-EBNAl和gD-DnR，利用PCR技术扩增得到编码EB病毒核抗原1的基 因序列和两段编码糖蛋白gD不同区段的基因序列；再利用重叠 PCR技术，通过设计的特定 引物序列，优选gD-UpF和gD-DnR，将编码EB病毒核抗原1的基因序列链接至两段编码糖蛋 白gD不同区段的基因序列中间，形成融合基因 gD-ENBAl，该gD-ENBAl融合基因包括依次连 接的编码第一 HSV-gD抗原表位的基因、编码EBNAl抗原表位的基因和编码第二HSV-gD抗 原表位的基因；再将上述融合基因序列链接至表达载体上，优选为pET-28a(+)，得到重组 表达载体 pET-28a-gDEBNAl。
[0043] 将本发明的重组表达载体pET28a_gDEBNAl质粒转入大肠杆菌，可表达得到重组 蛋白疫苗。
[0044] 第四方面，本发明提供了一种含有如第二方面所述的重组表达载体的宿主细胞。
[0045] 优选地，所述宿主细胞为BL21、DH5a或CH0。
[0046] 第五方面，本发明提供了如第一方面所述的重组蛋白疫苗、如第二方面所述的重 组表达载体、如第四方面所述的宿主细胞在制备预防或治疗EB病毒感染的药物中的应用。 [0047] 本发明提供了的重组蛋白疫苗及其制备方法和应用具有如下有益效果：
[0048] (1)本发明提供的重组蛋白疫苗，不仅能够通过EBNAl的抗原表位有效激活特异 性细胞毒性T淋巴细胞（CTL)反应；还能通过疱疹病毒糖蛋白的抗原表位直接阻断免疫抑 制途径，提高调节性T细胞的活性；
[0049] (2)其次，相比单一靶点治疗，本发明提供的重组蛋白疫苗能更全面、多途径预防 EB病毒感染、消除EB病毒及其相关的疾病和肿瘤，利于疫苗在临床中的实际应用；
[0050] (3)此外，本发明还提供了含编码该重组蛋白疫苗的基因的重组表达载体和该重 组蛋白疫苗的应用。
【附图说明】
[0051] 图1为本发明实