葡激酶衍生体在制备降血脂药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药技术领域，具体涉及葡激酶衍生体(SAK-HV)在制备降血脂药物中的应用。
【背景技术】
[0002]葡激酶(staphylokinase SAK)是由金黄色葡萄球菌分泌的一种含有136个氨基酸残基的胞外蛋白质。葡激酶在本世纪四十年代末被发现，并在五十年代至六十年代发现其具有纤溶作用。
[0003]中国专利文献(CN1850976B)中公开了一种葡激酶衍生体(SAK-HV)(其氨基酸序列在文献中权利要求1中所示)并且在文献(Min Wang, Yuanyuan Wang, etal.Construct1n and characterizat1n of a novel staphylokinase variant withthrombin-1nhibitory activity.B1technol Lett (2009) 31:1923 - 1927)中也进行了公开。上述公开的葡激酶衍生体(SAK-HV)是具有多功能结构域的融合蛋白。
[0004]目前降脂类药物主要包括HMG-CoA还原酶抑制剂，胆酸螯合剂，纤维酸类，烟酸及其衍生物，中药成分如枸杞多糖、茶叶多糖、黄连素等。目前临床应用最广泛的降脂药物为他汀类药物，其作用机理为抑制HMG-CoA还原酶，他汀药物的治疗周期一般为6-8周。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供葡激酶衍生体(SAK-HV)在制备降血脂药物中的应用。
[0006]所述葡激酶衍生体，其氨基酸序列为中国专利文献(CN1850976B)中权利要求1所述的氨基酸序列。
[0007]一种降血脂组合物，包含权利上述葡激酶衍生体。
[0008]所述葡激酶衍生体的制备方法为:培养含有葡激酶衍生体基因序列重组表达载体的工程菌，通过破碎菌体分离上清经过纯化后获得葡激酶衍生体蛋白液，将纯化的葡激酶衍生体中加入赋形剂，4°C保存；再加入冻干保护剂，冷冻干燥。
[0009]所述赋形剂为海藻糖。
[0010]所述保护剂为甘露醇、右旋糖酐、蔗糖、乳糖、氯化钠、甘氨酸中的一种以上。
[0011]其中，将SAK-HV的基因序列重组构建到表达载体中，转化宿主菌。所用重组表达载体可为pBV220、pET17b、pET15a或pET28a。可使用的表达宿主菌为coliBL21、E.coliDH5a、E.coliHBlOUE.coliJM109 或 E.coliJM103
[0012]具体的，SAK-HV粉剂的制备方法为:
[0013]利用基因重组技术将SAK-HV蛋白的基因序列构建到表达载体中，进一步转化宿主菌。通过筛选获得高表达，高活性的工程菌株。从转化好的菌种平板上挑取单菌落在无菌环境下接种于3ml含氨卞青霉素(25yg/ml)的LB培养基的试管中，25?30°C振荡培养过夜制成一级种子液。一级种子液于无菌环境下按0.1:1000的比例接种于2000ml含氨卞青霉素(25 μ g/ml)的LB培养基中，25?30 °C振荡培养过夜制成二级种子液。二级种子液接种于发酵罐中，发酵培养，富集菌体，通过调节诱导过程中的不同PH值，溶氧量，诱导温度等条件选择最佳的发酵条件，发酵结束后，离心收菌，称重并取菌体破碎进行SDS-PAGE检测SAK-HV表达水平。经过发酵后富集工程菌，获得的SAK-HV表达水平可达45%以上。菌体在冰浴中超声破碎，离心，收集上清进行离子交换层析分离及凝胶过滤分离通过SDS-PAGE，HPLC检测蛋白纯度，纯度可达95 %以上。选择不同浓度的冻干保护剂，包括甘露醇、右旋糖酐、蔗糖和甘氨酸等组成不同浓度的单一和复合配方，冷冻干燥后检测冻干样品的活性和成型的变化，经过37°C加速实验后，检测其活性和成型状况的改变，确定SAK-HV蛋白粉剂制备的主要成分。
[0014]上述降血脂组合物，可通过静脉、皮下或口服给药。
[0015]将上述降血脂组合物复溶后使用生理盐水稀释至0.005?0.5mg/ml静脉注射，注射周期为14天，每天注射一次连续注射14天；在小鼠上的用量为0.05mg/kg?5mg/kg，鹤鹤上的用量为0.01mg/kg?5mg/kg。
[0016]本发明的有益效果:通过本发明人的研宄显示葡激酶衍生体可能通过stat3信号通路调控脂肪代谢相关基因表达。本发明中的葡激酶衍生体经静脉注射等方式作用于ApoE-/-小鼠和鹌鹑后可以显著降低血浆总胆固醇(TG)，甘油三酯(TC)，低密度脂蛋白(LDL-c)水平，在同等时间内其降脂效果优于其疗效优于他汀类药物。经静脉注射后2周即可显示出明显的降脂效果，同时还可以明显抑制机体炎症水平，改善氧化应激状态。经过基因芯片分析肝脏转录组发现SAK-HV蛋白可能通过stat3信号通路调控脂肪代谢相关基因表达。
【附图说明】
[0017]图1为SRH-HV工程菌发酵结果，1-分子量标准物，2-发酵全菌，3-破碎上清，4-破碎沉淀。
[0018]图2为SRH-HV纯化后SDS-PAGE及HPLC分析结果，(A)为SDS-PAGE结果:1-分子量标准物，2-4-纯化产物收集；(B)为HPLC分析蛋白纯度结果。
[0019]图3为ApoE-/-小鼠血脂检测结果。
[0020]图4为高脂喂养鹌鹑血脂检测结果。
【具体实施方式】
[0021]以下实施例并不限定本发明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，科学出版社(J.Sambrook，Davidff.Russell, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001 (I).J.))或参阅所用试剂盒的说明书。如无特别指明，下述实施例中所使用的试剂，试验方法等皆为本领域技术人员所熟知。
[0022]实施例1含有本发明SAK-HV蛋白基因的工程菌的制备
[0023](I)含有SAK-HV蛋白基因表达载体的构建
[0024]将质粒pBV220用EcoR I和BamH I双酶切，将质粒pET17b用Nde I和BamH I双酶切，将SAK-HV全长片段分别用EcoR I和BamH I双酶切，Nde I和BamH I双酶切。使用T4DNA连接酶链接酶切后的SAK-HV片段及pET17b质粒。SAK-HV酶切片段5 μ 1，载体I μ 1，1XLigand Buffer3 μ 1，T4Ligand I μ 1，ddH2015 μ 1，14_16°C过夜连接。
[0025](2)含有SAK-HV蛋白基因载体转化工程菌
[0026]将过夜连接的产物全部加入200 μ I感受态细胞中，0°C冰浴30min。42°C热休克90sec，迅速放入冰浴中冷却I 一 2min。在每管中加入800 μ I LB (AmpO培养基，37°C摇床180 — 200rpm培养45 — 60min。将每管4000rpm离心5min。吸取800 μ I上清弃之，用剩余的200 μ I上清将沉淀悬起来。然后涂在LB固体平板(100 μ g/ml Amp+)上。待平板全部吸收后，倒置于37°C温箱，培养12_16h。
[0027](3)含有SAK-HV蛋白的工程菌表达活性检测
[0028]挑取单菌落接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C摇床220rpm过夜培养。将活化菌液以1:100比例接种于3ml含氨苄青霉素的LB培养基中。30°C摇床220rpm培养。取约100 μ I