菌液用分光光度计测得OD6cJ直达到0.4-0.6时，加入10mMIPTG,终浓度为
0.5mM，将菌液转入30°C摇床中诱导表达5h。4°C离心收集菌体。用SDS-PAGE电泳分析表达产物。结果显示在17kD的位置有一表达量很高的蛋白条带，此蛋白的大小与SAK-HV相同，而空载体对照则无此蛋白带，说明以此制备的工程菌可以高效表达SAK-HV蛋白，薄层扫描结果显示SAK-HV的表达量占菌体总蛋白的45 %以上。图1为使用SDS-PAGE方法分析工程菌种发酵后的表达情况，取少量发酵菌，悬浮于20mMPBE和2mMEDTA的缓冲液之中，超声破碎，12000转/分钟4°C离心5分钟，分别取全菌、离心上清和离心沉淀进行SDS-PAGE检测发酵菌的表达情况。泳道I为分子量marker，泳道2为全菌蛋白，可见在分子量14kD与20kD之间有目的条带表达(箭头所示)。泳道3为破碎后上清，泳道4为破碎后沉淀，可见目的蛋白主要存在于上清中以可溶形式表达。
[0029]实施例2含有SAK-HV蛋白粉剂的制备
[0030](I)纯化SAK-HV蛋白的制备
[0031]根据SRH蛋白的等电点及分子量等理化特性，选择经济实用的分离材料，经过不同的缓冲体系、不同的酸碱度、不同的离子强度、不同的洗脱条件等综合研宄，获得了经济、适用、分离效果好的SRH融合蛋白的纯化工艺，具体流程如下:使用Source Q15阴离子交换柱，用20-60mMPB (PH6-9，2mMEDTA)缓冲液平衡纯化柱，流动速度为2ml/min。将破碎后上清上柱，流动速度为0.5ml/min。上样结束后用20_60mMPB (PH6-9，2mMEDTA)缓冲液洗脱杂蛋白，流动速度为2ml/min。当蛋白穿过峰下降至基线水平后，用10_50mMNaCl溶液洗脱，收集蛋白峰。用IMNaCl溶液再生离子交换柱上，流速2ml/min，再用PB缓冲液洗柱将NaCl除去。凝胶过滤层析:层析介质为S印hacryl S-200，缓冲液为20_50mMPB (PH7.4，2mMEDTA)，流速0.9ml/min,上样40ml，18h后收集洗脱峰。待缓冲液洗柱两个柱体积后用20%乙醇洗柱。最后将柱子存于20%乙醇中。4°C保存。将所得的样品SDS-PAGE蛋白电泳，并将收集的蛋白液进行HPLC分析纯度，如图2所示。各泳道为Sephacryl S-200洗脱后收集的目的蛋白，未见明显杂蛋白条带。HPLC分析蛋白纯度，结果显示目的蛋白纯度在95%以上。
[0032](2) SAK-HV蛋白的冻干
[0033]溶液配制及配方组成:配制50%蔗糖溶液、lmol/L甘氨酸溶液、20%右旋糖酐溶液，组成不同的冻干保护剂配方。分装结束后，将样品置于冷井中密封，预冻至冷井温度-700C，物料-630C，开始启动干燥程序24h后取出样品，加盖密封。在40W的日光灯下，观察成型状况，然后加入Iml生理盐水，在40W日光灯下观察样品溶解状况及有无不溶物。
[0034]实施例3
[0035]高脂血症动物模型构建
[0036](参考 Nhat-Tu Le,A Crucial Role for p90RSK_Mediated Reduct1n ofERK5Transcript1nal Activity in Endothelial Dysfunct1n and Atherosclerosis, Circulat1n.2013 ； 127:486-499.Satoshi Imaizumi, et al.Mitogen-activated proteinkinase phosphatase-1deficiency decreases atherosclerosis in apolipoproteinE null mice by reducing monocyte chemoattractant protein-llevels.MolecularGenetics and Metabolism 101 (2010)66 - 75)
[0037]将16周龄ApoE-/-小鼠高脂饲养I?2周(饲料配方:胆固醇2%，猪大油10%，蔗糖5%，基础饲料83% )至17-18周龄，开始给药。SAK-HV尾静脉注射连续每天给药一次，共给药14次，饲养过程中动态观察血脂变化。
[0038]将4周龄鹌鹑高脂饲养20周(饲料配方:蔗糖10%，胆固醇5%，猪大油10%，基础饲料84%)后开始给药。尾静脉注射连续每天给药一次，共给药14次，饲养过程中动态观察血脂变化。
[0039]治疗方案及结果
[0040]将SAK-HV蛋白使用生理盐水稀释至所需浓度(0.005?0.5mg/ml)，300 μ I/只小鼠尾静脉注射。连续注射每天一次，共注射14次。治疗结束后处死小鼠，心脏采血后分离血清，检测血浆总胆固醇(TG)，甘油三酯(TC)，低密度脂蛋白(LDL-c)指标。研宄结果显示SAK-HV可以显著降低ApoE+小鼠TC及LDL-c水平，降脂效果优于他汀口服，如图3所示。
[0041]将SAK-HV蛋白使用生理盐水稀释至所需浓度(0.01?0.5mg/ml), 300 μ I/只鹌鹑静脉注射。连续注射每天一次，共注射14次。治疗结束后处死鹌鹑，颈动脉采血后分离血清，检测TC，TG, LDL-c指标。研宄结果显示SAK-HV可以显著降低高脂饲养鹌鹑的TC，TG,LDL-c水平(图4)，降脂效果优于他汀口服给药。
【主权项】
1.葡激酶衍生体在制备降血脂药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述葡激酶衍生体，其氨基酸序列为中国专利文献(CN1850976B)中权利要求1所述的氨基酸序列。
3.—种降血脂组合物，其特征在于，包含权利要求1或2中所述的葡激酶衍生体。
4.根据权利要求3所述的一种降血脂组合物，其特征在于，所述葡激酶衍生体的制备方法为:培养含有葡激酶衍生体基因序列重组表达载体的工程菌，通过破碎菌体分离上清经过纯化后获得葡激酶衍生体蛋白液，将纯化的葡激酶衍生体中加入赋形剂，4°C保存；再加入冻干保护剂，冷冻干燥。
5.根据权利要求3或4所述的一种降血脂组合物，其特征在于，所述赋形剂为海藻糖。
6.根据权利要求3或4所述的一种降血脂组合物，其特征在于，所述保护剂为甘露醇、右旋糖酐、蔗糖、乳糖、氯化钠、甘氨酸中的一种以上。
【专利摘要】本发明公开了属于生物医药领域的葡激酶衍生体在制备降血脂药物中的应用。所述葡激酶衍生体，其氨基酸序列为中国专利文献(CN1850976B)中权利要求1所述的氨基酸序列。本发明中的葡激酶衍生体经静脉注射等方式作用于ApoE-/-小鼠和鹌鹑后可以显著降低血浆总胆固醇(TG)，甘油三酯(TC)，低密度脂蛋白(LDL-c)水平，在同等时间内其降脂效果优于其疗效优于他汀类药物。经静脉注射后2周即可显示出明显的降脂效果，同时还可以明显抑制机体炎症水平，改善氧化应激状态。利用生物工程方法制备SAK-HV蛋白工程菌，经过工艺优化其表达量可达45％，经发酵纯化获得纯化蛋白纯度可达95％以上。
【IPC分类】A61P3-06, A61P29-00, A61K47-48, A61K38-48
【公开号】CN104707133
【申请号】CN201510130693
【发明人】徐东刚, 王旻, 付文亮, 王园园, 邹民吉, 夏文戎, 毛金武
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年3月24日