一种无细胞百日破联合疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于疫苗生产制备技术领域，具体涉及一种无细胞百日破联合疫苗及其制 备方法。
【背景技术】
[0002] 百日咳、白喉、破伤风等疾病在我国流行范围广、危害严重，及时进行疫苗接种是 有效的预防保护性措施。我国目前应用于计划免疫预防百日咳、白喉和破伤风疾病的疫苗 包括全细胞百白破联合疫苗（DTwP)和无细胞百白破联合疫苗（DTaP)。两者区别在于联合 疫苗中的百日咳不同，即全细胞百日咳和无细胞百日咳。
[0003] 顾名思义，全细胞百日咳是将百日咳全菌体用适当灭活剂灭活后，与佐剂配合，直 接用作免疫用疫苗。作为最早纳入WHO扩大免疫计划（EPI)的疫苗，全细胞百白破疫苗已 经在预防和控制这三种传染病方面发挥了重要作用。我国也在1985年将其纳入第一批国 家计划免疫的疫苗。然而，由于全细胞百白破疫苗中白喉类毒素、破伤风类毒素均为提纯精 制过的有效蛋白抗原，而百日咳则为全细胞菌体，所以注射全细胞百白破联合疫苗后容易 发生因百日咳所含毒性组份引起的严重不良反应。20世纪70年代，由于百日咳发病率的下 降以及接种全细胞百白破疫苗（DTwP)后出现的严重的不良反应，英国、荷兰及日本等国家 一度出现了抵制疫苗接种及停用的现象，导致接种率下降，致使这些国家百日咳的发病率 又出现大幅反弹。我国也因其容易产生副反应，严重影响了计划免疫的实施，使全国免疫覆 盖率未真正达到85%，造成过百日咳局部爆发流行的情况，如贵州1997年曾爆发流行。
[0004] 目前，绝大多数发达国家均已经采用副反应较小的无细胞百白破联合疫苗，作为 常规免疫用疫苗，取代传统的全细胞百日咳疫苗。无细胞百白破联合疫苗中的无细胞百日 咳主要是通过提取纯化，去掉百日咳菌体中一些易引起副反应的毒性物质，而保留具有保 护性免疫作用的抗原成分。
[0005] 无细胞百日咳疫苗从生产工艺来讲可分为共纯化疫苗和组份纯化疫苗。日本是最 早研制出无细胞百白破疫苗的国家。1981年日本率先采用共纯化工艺研制成功含有百日咳 毒素（PT)和丝状血凝素（FHA)的无细胞百白破疫苗。其工艺包括发酵罐培养细菌后，盐析 沉淀，然后用蔗糖密度梯度离心去除杂质，收集富含PT和FHA的有效成分。我国的无细胞 百白破联合疫苗于80年代中期开始研制，90年代中期获得生产文号，生产工艺是沿用日本 的共纯化工艺。2011年，我国将共纯化的无细胞百白破纳入免疫接种计划。
[0006] 然而，由于共纯化无细胞百日咳是在同一反应体系中同时纯化提取抗原，因此不 同厂家的工艺不同，同一厂家相同工艺下，纯化的细微差异均会导致抗原含量比例的不同。 实际上，中国食品药品检定院在疫苗批签发审核检测时，也发现共纯化百日咳疫苗PT和 FHA的比例变化极大（骆鹏等，建立我国百日咳组份纯化疫苗质量标准的探讨。中国生物制 品学杂志，2013年9月第26卷第9期，1351~1354)，类似情况在日本也有报道（李忠云 等，百白破联合疫苗：问题与对策。上海预防医学，2006,18(1) :3~5)，因此共纯化工艺不 利于产品的质量稳定。
[0007] 随着纯化技术的发展，使分别分离出百日咳有效抗原并配制成组份疫苗成为可 能。这种工艺被称为组份纯化工艺，即采用柱层析法，将不同的保护性抗原分别纯化，然后 再将各抗原定量配比成疫苗。组份纯化工艺的优点在于，疫苗抗原成分明确，含量可控，纯 度更高，使得疫苗副作用更小，安全性更好；另一方面，组分纯化疫苗的柱层析工艺相对简 单，耗时短。自90年代中期以来，欧美发达国家均采用柱层析分离纯化百日咳各抗原组份 来生产无细胞百日咳疫苗。中国目前仍然停留在共纯化工艺生产无细胞百日咳疫苗的水平 上，与欧美发达国家存在近20年的差距（潘殊男等，中国百日咳疫苗的现状及研发趋势初 探。微生物学免疫学进展，2012年第49卷第5期，72~77)。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种无细胞百日破联合疫苗及其制 备方法，该疫苗成分明确，容易进行质量控制，副作用更小，安全性更好；制备方法具有操作 简单、制备方便、成本低、适宜于工业化大规模生产。
[0009] 本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种无细胞百日破联合疫苗，它由下述 组分的原料组成：
[0010] 百日咳毒素： 5~40 ug; 丝状血凝素：5~40 Bg; 百日咳黏附素：2~10 Ug; 白喉类毒素：10~251f; 破伤风类毒素：4~IOlf; 氢氧化错： I. 0~2. Orag/ml; 氯化钠： 7.5~9.5g/L。 toon] 作为优选方案，它由下述组分的原料组成：
[0012] 百日咳毒素： 25 Pg; 丝状血凝素： 25 Pg; 百日咳黏附素： 8ug; 白喉类毒素： u.Slf; 破伤风类毒素：51f; 氢氧化招： I. 0~I. 5mg/ml; 氯化钠： 7, 5~9. 5g/L。
[0013] 一种无细胞百日破联合疫苗的制备方法，它包括以下步骤：
[0014] SI.制备各单价疫苗原液
[0015] SlL制备白喉类毒素原液：开启白喉杆菌PW8株，先在产毒培养基种子管中传 1~3代，再转至产毒培养基制成生产用种子，采用培养罐液体培养，培养基采用改良林氏 培养基，34~36°C培养约48小时，培养结束后加入甲醛杀菌，在培养物中加入硫酸铵沉淀 杂蛋白，离心收集上清，超滤浓缩后再加入硫酸铵盐析沉淀白喉毒素蛋白，离心收集沉淀， 加生理盐水溶解，超滤去除毒素中的硫酸铵，加入甲醛，置35~37°C，脱毒30天，除菌过滤 即为白喉类毒素原液；
[0016] S12.制备破伤风类毒素原液：开启破伤风梭状芽孢杆菌，先在产毒培养基种子管 中传1~3代，再转至产毒培养基制成生产用种子，采用培养罐液体培养，培养基采用双胨 培养基，34~36°C培养62~72小时，培养结束后加入甲醛杀菌，培养液经过滤去除菌体， 加入硫酸铵沉淀毒素蛋白，离心收集沉淀，超滤去除毒素中的硫酸铵后加入甲醛，置35~ 37°C，脱毒30天，即为破伤风类毒素原液；
[0017] S13.制备无细胞百日咳疫苗原液：开启百日咳杆菌，接种于改良包-姜培养基或 活性炭半综合培养基，于35~37°C培养不超过72小时，以后各代不超过48小时，生产用培 养基选用CPB培养基，采用培养罐液体培养，于细菌对数生长期后期或静止期前期收获，收 获的培养物采用离心法进行固液分离，然后分别进行分离纯化得百日咳黏附素、丝状血凝 素和百日咳毒素，将百日咳毒素采用戊二醛进行脱毒、百日咳黏附素和丝状血凝素采用甲 醛进行脱毒，除菌过滤后即为无细胞百日咳原液；
[0018] S2.合并和稀释：将无细胞百日咳原液、白喉类毒素原液、破伤风类毒素原液加入 已经稀释的氢氧化铝佐剂内，调pH至5. 8~7. 2,即为无细胞百日咳疫苗。
[0019] 进一步地，步骤S13中所述百日咳黏附素、丝状血凝素和百日咳毒素的纯化方法 分别为：
[0020] 所述百日咳黏附素的纯化为：将离心后收集的菌体采用60°C热释放，超滤浓缩 后，上样于Capto adhere层析柱，以醋酸缓冲液为流动相，收集含百日咳黏附素的洗脱组 份，再上样于Capto SP层析柱，以醋酸缓冲液为流动相，以氯化钠梯度洗脱，收集洗脱峰；
[0021] 所述丝状血凝素和百日咳毒素的纯化为：离心后的上清液超滤浓缩后上样于 Capto SP层析柱，流动相采用含尿素的磷酸盐缓冲液，以氯化钠梯度洗脱，分别收集含丝状 血凝素和百日咳毒素的洗脱组份，将含百日咳毒素的洗脱组份上样于CaptoMMC层析柱，缓 冲液采用Tris-HCl缓冲液，以氯化钠梯度洗脱，收集百日咳毒素洗脱峰；将含丝状血凝素 的洗脱峰上样于羟基磷灰石层析柱纯化，收集洗脱峰。
[0022] 本发明具有以下优点：本发明提供了一种由分离纯化的百日咳制备的无细胞百白 破联合疫苗，其特点是采用柱层析技术，分别纯化百日咳保护性抗原百日咳毒素（PT)和丝 状血凝素（FHA)和黏附素（PRN)，定量配比后与精制纯化的破伤风类毒素、白喉类毒素配制 成疫苗，其优点是疫苗成分明确，容易进行质量控制，副作用更小，安全性更好，该联合疫苗 上市后可为我国儿童传染病预防工作提供安全性更好的优质疫苗，同时减少接种次数，降 低接种成本，创造良好的社会和经济效益。该疫苗的制备方法具有操作简单、制备方便、成 本低、适宜于工业化大规模生产。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所 述：
[0024] 实施例1 :一种无细胞百日破联合疫苗，它由下述组分的原料组成：
[0025] 百日咳毒素： 5 Ug; 丝状血凝素：5 ug; 百日咳黏附素：2yg; 白喉类毒素：IOlf; 破伤风类毒素：41f; 氢氧化铝： 1.0mg/ml; 氯化钠： 7. 5g/L。
[0026] 实施例2 :-种无细胞百日破联合疫苗，它由下述组分的原料组成：
[0027] 百日咳毒素： 40 μ g; 丝状血凝素：40 μ g; 百日咳黏附素：IOug; 白喉类毒素：251f; 破伤风类毒素：IOlf; 氢氧化铝